Methodenartikel

Een gestandaardiseerd ex vivo porcine oromucosale model voor het evalueren van peptidefluxen

378 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70935

⸱

9 juni 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1UCD School of Veterinary Medicine and UCD Conway Institute, University College Dublin, 2UCD School of Mechanical and Materials Engineering, University College Dublin

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een screeningsplatform met vers geïsoleerde porcine buccale epitheelweefselmucosae om peptidepermeatie te evalueren. De methode integreert permeatie van een GLP-1RA in aanwezigheid van een permeatieversterker uit oplossingen, Hilltop-kamers en films in Franz Diffusiecellen, en 3D-geprinte inserts, vergezeld van histologische mucosale beoordeling.

Samenvatting

Oromucosale toediening van geneesmiddelen in film, tabletten, zuigtabletten en andere doseringsvormen biedt een handige systemische toedieningsroute voor pediatrische en oudere patiënten, en voor patiënten die capsules of tabletten niet gemakkelijk kunnen doorslikken. Het ontwikkelen van buccale en sublinguale peptideformuleringen vereist preklinische modellen die overeenkomen met de niet-keratiniseerde oromucosale epitheelstructuren van mensen, waarvan varkens en honden het meest geschikt zijn. We hebben afgedankte verse varkens-oromucosale weefsels uit een slachthuis gehaald. De mucosae werden van de onderliggende gladde spier ontleed met gecontroleerde verwarming en vervolgens gemonteerd in Franz Diffusion Cells of in nieuwe laagvolume, 3D-geprinte, hars-uitgeharde inzetstukken. Peptide-permeatie-enhancercombinaties werden aan de donorzijde toegevoegd, en permeatieve moleculen werden bemonsterd vanaf de ontvangerzijde en gekwantificeerd met ultra-high performance vloeistofchromatografie (uHPLC). Voor de inserts werden transepitheliale elektrische weerstand (TEER) waarden van gemonteerde mucosae gemeten met EVOM eetstokjeselektroden. Weefselhistologie werd onderzocht na incubatie in zowel Franz-diffusiecellen als 3D-inserts. De optimale concentratie van permeatie-enhancer werd gekozen wanneer waterige mengsels van peptide en enhancer een toename van permeatie veroorzaakten. De pepptijdpermeatie bereikte 4,3% over 3 uur in driedimensionale (3D) inserts en 1,7% in Hilltop-kamermodellen, waarbij de laatste directe belichting van een buccale film simuleert. Laag-voor-laag polymere mucoadhesiefilms met peptide-versterkercombinaties werden ontwikkeld en toegepast op mucosaal weefsel voor permeatiestudies met behulp van diffusiekamers. Ex vivo peptidepermeatie over het porcine buccale mucosae bereikte 2% wanneer mucosaeën werden blootgesteld aan de optimale combinatie van glycodeoxycholaat (GDC) die in de buccale films is opgenomen. Deze ex vivo screeningsstudies bieden een route naar latere farmacokinetische evaluatie van met peptiden geladen filmformuleringen die via de oromucosale route worden toegediend bij varkens en mensen.

Inleiding

Buccale en sublinguale oromucosae zijn aantrekkelijke manieren van orale toediening omdat ze direct toegankelijke plekken bieden en het hepatische first-pass metabolisme vermijden, wat mogelijk de biobeschikbaarheid en patiëntacceptatie verbetert in vergelijking met andere routes, waaronder orale 1,2. Peptiden worden over het algemeen gegeven via injectie in plaats van orale toediening vanwege slechte permeatie door het intestinale epitheel, vanwege hun hogere molecuulgewicht, hydrofiliciteit en gevoeligheid voor enzymatische afbraak3. De FDA heeft 102 peptiden goedgekeurd voor therapeutische toepassingen, waarvan ~450 therapeutische peptiden worden geëvalueerd in preklinische of klinische proeven4. Deze omvatten orale tabletten die zijn samengesteld met permeatie-enhancers (bijv. semaglutide, Rybelsus) en oromucosale platforms (Minirin Melt en Nocdurna sublinguale desmopressine-acetaat) ontwikkeld met behulp van Catalent's Zydis orally disintegrate tablet (ODT) technologie6. Ondanks uitgebreid onderzoek naar onderzoeken naar permeabiliteitsstudies van buccale geneesmiddelen, vertonen de permeabiliteitswaarden van moleculen een slechte reproduceerbaarheid en beperkte vergelijkbaarheid in studies 7,8. Deze inconsistenties komen grotendeels voort uit variaties in de gebruikte experimentele diermodellen en door verschillen in het hanteren en bereiden van geïsoleerde buccale mucosae9.

Ex vivo permeabiliteitsassays met geïsoleerde buccale en sublinguale weefselmucosae zijn een waardevol hulpmiddel voor het voorspellen van de in vivo oromucosale kleine molecuulpermeabiliteit en voor preklinische screening van formuleringscomponenten die relevant zijn voor doseringsvormen 10,11,12; hun gebruik bij peptidescreening is echter beperkt omdat de basale permeabiliteit verwaarloosbaar is. In de afgelopen jaren is het porcine buccale slijmvlies het voorkeursmodel geworden omdat de niet-keratiniseerde structuur en fysiologische en biochemische kenmerken sterk lijken op die van mensen13. Buccale monsters van honden zijn nog minder toegankelijk dan varkensweefsel uit slachthuizen, hoewel beide bronnen niet-keratiniseerdzijn. Er blijft aanzienlijke variatie in epitheliale dikte en verwerkingsmethoden bestaan. Standaardisatie van buccale en sublinguale oromucosale voorbereiding is essentieel. Variabelen zoals korte- en langetermijnopslagcondities, weefseldikte en behoud van levensvatbaarheid tijdens experimenten beïnvloeden allemaal de ex vivo permeabiliteitsresultaten8. Weefselbehoud is cruciaal, aangezien zowel de structurele integriteit als de metabole activiteit van het mucosa direct invloed hebbenop diffusieprofielen 12,15. Verlies van barrièrefunctie kan leiden tot kunstmatig verhoogde geneesmiddelpermeatiepercentages16,17. Naast opslag brengt de methode om porcine buccale slijmvlies te dissecten voor montering in permeatiekamers verdere variabiliteit met zich mee. Verschillen in het verwijderen van submucosaal bindweefsel, of dat nu mechanisch, chemisch of thermisch is, kunnen de permeabiliteitveranderen 18. Hoewel sommige rapporten suggereren dat warmteafscheiding om het epitheel van gladde spieren te isoleren de permeabiliteit19 behoudt, ontbreekt consensus. Momenteel bestaat er geen universeel geaccepteerde methode om geïsoleerd buccal mucosae20 te disseceren en de integriteit te beoordelen. Het gelabelde hydrofiele suikerfluoresceïne isothiocyanaat-dextran (FITC dextran 4000, FD-4) wordt vaak gebruikt als integriteitsmarker voor het porcine buccale mucosa, omdat alleen kleine moleculen onder ~500 Da passief het weefsel kunnen doordringen. Daarentegen beperkt een intact mucosa het FD-4 transport, en een donor-naar-ontvanger overdracht onder 0,6% wordt doorgaans als acceptabel beschouwd over 2-4 uur21,22. Daarnaast biedt haematoxyline- en eosineweefselkleuring een eenvoudige beoordeling van de epitheelmorfologie23.

In dit werk hebben we een gestandaardiseerd protocol vastgesteld voor de slijmvliesbehandeling van geïsoleerde porcine buccale mucosae, ontworpen om de integriteit en permeabiliteit van het slijmvlies over een bepaalde periode te optimaliseren. Onze doelstellingen waren het bieden van een experimenteel kader voor het dissecten van porcine buccale epitheelweefsel en het verbeteren van de betrouwbaarheid van ex vivo permeabiliteitsbeoordelingen van peptiden in oromucosae gemonteerd in diffusiekamers en inserts. We voerden eerst visuele analyses uit om het schadevrije buccale slijmvlies van het slachthuis te identificeren. We optimaliseerden weefselverwerkingstechnieken, slijmvliesdikte en methoden om weefselintegriteit tijdens experimenten te behouden. Met behulp van een stabiel laagpotentie glucagon-achtig peptide-1 receptoragonist (GLP-1 RA) analoog als gereedschapsmolecuul, voerden we peptidepermeatiestudies uit in aanwezigheid en afwezigheid van een galzoutpermeatie-enhancer, natriumglycodeoxycholaat (GDC), op buccale mucosae gemonteerd in Franz-diffusiecellen en op maat gemaakte zelfgemaakte 3D-geprinte transwell-achtige inserts. GDC en de GLP-1 RA werden geïntroduceerd aan buccale mucosae uit oplossingen, Hilltop-kamers en mucoadhesierende polymere dubbellaagfilms. We gebruikten permeabiliteitsmarkers, weefselhistologie en trans-epitheliale/endotheliale elektrische weerstand (TEER) waarden als onze primaire evaluatie-eindpunten.

Protocol

De varkenswangen die in deze studie werden gebruikt, werden verzameld bij een lokaal slachthuis; daarom was er geen ethische goedkeuring vereist.

1. Isolatie, voorbereiding en opslag van het porcine buccale epitheel

  1. Verzamel varkenswangweefsels uit een lokaal slachthuis en vervoer het binnen 90 minuten naar het laboratorium in ijskoude fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, pH 7,4). Binnen de volgende 60 minuten bereid je de weefsels voor volgens de eerder beschreven methodologie19,24, met kleine aanpassingen voor verschillende oromucosae-locaties zoals weergegeven in Figuur 1.
  2. Met een scalpel scheid je het buccale slijmvlies van het onderliggende weefsel en spoel je het weefsel drie keer af met fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS). Verwijder het slijmvlies met zichtbare oppervlakteschade.
  3. Dompel intact slijmvlies in PBS bij 65 °C gedurende 3 minuten en scheid het epitheel en het resterende bindweefsel van gladde spieren met behulp van een horlogemakerstang van maat 5. Deze methode is ook toepasbaar voor het isoleren van sublinguale en tongepitheliale mucosae.
  4. Droog de gedissectiede oromucosae voorzichtig op cellulosefilterpapier en ga daarna permeatiestudies uit (de voorkeursoptie) of vries maximaal 4 weken in.
  5. Voor het invriezen na scheiding dompel je oromucosae 2 uur onder in een cryoprotectant, 85% glycerol25, met zacht schudden. Glycerol met hoge viscositeit vervangt intercellulair water om de vorming van waterkristallen te voorkomen, wat de weefselstructuur kan beschadigen.
  6. Na deze periode vervang je glycerol door verse PBS en 10% glycerol. Bevries de mucosale monsters bij -20 °C of -70 °C, afhankelijk van de benodigde opslagduur. Voer de vriesprocedure uit met een gecontroleerde snelheid van ~-1 °C·min-1.
    OPMERKING: Alle experimenten worden uitgevoerd met ten minste drie weefselmonsters van de wangen van verschillende dieren.

2. Ex vivo permeatiestudie in mucosae gemonteerd in Franz-diffusiecellen en gebruik van Hilltop-kamers om GLP-1 RA en GDC te presenteren

OPMERKING: Ex vivo permeabiliteitsstudies worden aanvankelijk uitgevoerd op verse, geïsoleerde porcine buccale mucosae met behulp van Franz-diffusiecellen (FDC).

  1. Plaats het dissecte weefselslijmvlies in kamers (venstergebied 1,2 cm2) zoals weergegeven in Figuur 2 en balanseer 30 minuten met PBS, pH 6,8 (donorzijde, 1 mL volume) en PBS, pH 7,4 (ontvangerzijde, 10 mL volume).
  2. Na 30 minuten evenwicht wordt de donoroplossing PBS (pH 6,8) vervangen door 1 mL PBS met een verhouding van 1:1 GLP-1RA (25 mg/mL) en GDC (25 mg/mL).
  3. Blijf de ontvangerkamer roeren met 10 mL PBS pH 7,4, gehandhaafd op 37 °C bij 300 rpm. Neem elke 60 minuten 1 ml uit het ontvangercompartiment gedurende 180 minuten. Neem driemaal monsters uit donorcompartimenten aan het begin en einde van het experiment. Na elke bemonstering vul je de kamers aan met 1 ml PBS.
  4. Aan het einde van het experiment bewaar je het weefsel in 10% formaline voor histologie of homogeniseer je het om het GLP-1RA-peptide dat in het weefsel overblijft te kwantificeren.
  5. Voer evenzo de permeabiliteit van de GLP-1RA uit met behulp van Hilltop-kamers (HTC).
    OPMERKING: Het doel van het gebruik van HTC is om het oromucosale permeatie-versterkende effect van GDC op de GLP-1 RA in oplossing te bevestigen voordat een bilayer buccale film wordt gevormd. De HTC is een kamer die is opgebouwd uit Kraton G-2705, een biocompatibele styreen-ethyleen-butyleen-styreen (SEBS) blokcopolymeer, met een buitendiameter van 19 mm, en bevat een Webril-pad (12,7 mm diameter) bestaande uit 100% niet-geweven katoenvezels, dat dient als absorberend anti-aanbakmateriaal voor oplossing26.
  6. Evalueer evenzo de ex vivo permeabiliteit van GLP-1RA en GDC (1:1 verhouding) geladen in mucoadhesierende dubbellaagfilms door de films in donorkamers van FDC's of in 3D-inserts te plaatsen, zoals beschreven voor HTC.
  7. Om de integriteit van porcine buccale epitholieweefsel te bevestigen, gebruik je FD-4 (0,05 mM) als fluorescerende fluxmarker en voeg je dit toe aan de donorzijde om lekkage over het weefsel te beoordelen.
    OPMERKING: Weefsels die lekken vertonen, zijn uitgesloten van permeabiliteitsberekeningen.
  8. Na het 3-uursexperiment wordt de cumulatieve GLP-1 RA-flux gekwantificeerd door uHPLC-analyse van de 200 μL monsters die uit het basolaterale compartiment in drievoud zijn gehaald. Herhaal alle permeatie-experimenten drie keer. Kwantificeer de cumulatieve flux van GLP-1RA op basis van een kalibratiecurve gegenereerd uit vaste concentraties van GLP-1RA.

3. Voorbereiding van buccale films die vastzitten bij de GLP-1RA en GDC

OPMERKING: Buccale dubbellaagfilms met een mucoadhesive- en backinglaag worden vervaardigd met oplosmiddelgieten en een semi-automatische coater27.

  1. Bereid een dubbellaagfilm voor om GLP-1RA te omsluiten met HPMC en PVP-K90 als filmvormende polymeren, en een mucoadhesivecomponent, Na-CMC.
    OPMERKING: Zie Tabel 1 voor de samenstelling van de mucoadhesive- en achterlaag van de buccale film. GDC wordt gecombineerd met een GLP-1 RA-peptide in modelfilms in lage mg-hoeveelheden om het effect op peptidepermeatie over porcine buccale mucosaeën in kamers te zien.
  2. Bereid de mucoadhesivelaag voor door de filmvormende polymeren, 45 mg HPMC, 10 mg Na-CMC en 25 mg PVP-K90, gedurende 10 minuten op te lossen in gedeïoniseerd water met 3% glycerol bij 400 rpm met behulp van een magnetische warmplaatroerder.
    OPMERKING: HPMC is oplosbaar bij kamertemperatuur, terwijl PVP-K90 30 minuten moet worden verwarmd op 40 °C om op te lossen.
  3. Voeg 2 mg Aerosil 200 F toe tijdens het roeren, gevolgd door de toevoeging van de GLP-1 RA. Voeg dan GDC toe en verspreid het bij 600 rpm gedurende 30 minuten.
  4. Ultrasonicaer de uiteindelijke polymeeroplossing 90 minuten met een ultrasonicatiebad om bubbels te verwijderen.
  5. Giet films op een polyethyleentereftalaat (PET) voering en bedek met een doctorblade ingesteld op 2600 μm bij 2 mm/s. Droog de films in een heteluchtoven op 40 °C gedurende ~1 uur.
  6. Voor de backinglaag los je 5% ethylcellulose (EC) en 5% propyleenglycerol (PG) op in hydroalcoholisch water (ethanol:water), en giet je de opgeloste slurry vervolgens op een PET-voering. Snijd de gedroogde films tenslotte in 1 cm × 1 cm vierkanten, pak ze in aluminium zakjes en bewaar ze bij 4 °C.

4. Printen van een aangepaste 3D-transwell-nabootsende insert

OPMERKING: De 3D-geprinte custom inserts worden vervaardigd volgens een eerder beschreven methode met kleine aanpassingen28.

  1. Kort gezegd: ontwerp het 3D-model met behulp van computerondersteund ontwerp (CAD) software.
  2. Houd de afmetingen van de 3D-insert gelijk aan die van het hoofdcilindrische lichaam (donorkamer), met een maximale oppervlakte van 1659,06 mm2 en een totale externe afmetingen van 25,20 mm langs de x-as, 14,50 mm langs de y-as en 21,63 mm langs de z-as.
  3. Daarnaast ontwerp je een afneembare ronde retentiering om het epitheelweefsel te ondersteunen. De ring heeft een buitendiameter van ongeveer 19,90 mm en een binnendiameter van 17,93 mm, overeenkomend met de afmetingen van het hoofdcilindrische lichaam, en kan passen in Transwell 12-wellplaten (Figuur 3).
  4. Fabriceer alle componenten met een desktop stereolithografie (SLA) 3D-printer met een UV-uithardbare heldere hars. Alle afmetingen zijn benaderend en kunnen indien nodig worden aangepast om een goede passing in Transwells en experimentele compatibiliteit te waarborgen.
    OPMERKING: Om de verwijdering van niet-gereageerde monomeren en potentiële uitlogbare stoffen te waarborgen, ondergingen alle onderdelen een gestandaardiseerd nabewerkingsprotocol, waaronder een 10-minuten wasbeurt in ongerepte 99% isopropylalcohol (IPA) gevolgd door UV-uitharding volgens fabrikantspecificaties, d.w.z. 1 minuut bij omgevingstemperatuur in een Form Cure 2. Stereolithografiebestand (STL) voor 3D-modelontwerp is te vinden in https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577 of aanvullende bestanden (Supplementary File 1 en Supplementary File 2).

5. Permeatie over mucosae, gemonteerd in 3D-inserts

OPMERKING: De ex vivo permeabiliteit van GLP-1RA en GDC die zijn opgenomen in mucoadhesive biccale folies kan ook worden beoordeeld met laagvolume, op maat gemaakte Transwell-nabootsende 3D-inserts (Figuur 2) als alternatief voor FDC's. Dit komt doordat de 10 mL ontvangerzijde van FDC's het peptide verdunt, waardoor de detectiegevoeligheid van uHPLC wordt uitgedaagd. Het FDC-ontwerp is daarom niet kosteneffectief of praktisch voor peptidefluxen, omdat het continu enzymgebonden immunosorbent-assay (ELISA) of radioimmunoassay (RIA) detectie vereist.

  1. Produceer/print de inserts in een UV-uithardbare hars met een desktop SLA3D-printer 28, en monteer ze in 12-put weefselkweekplaten.
  2. Plaats het porcine buccale slijmvlies over een vensteroppervlak van 1,4 cm² tussen de apicale en basolaterale kamers, meet de basislijn transepitheliale elektrische weerstand (TEER) met een EVOM 2 voltohmmeter met STX2 eetstokjes elektroden geplaatst aan de donor- en ontvangerzijde van de inserts. TEER wordt berekend volgens de wet van Ohm.
  3. Na het plaatsen van de film (1,0 × 1,0 cm2) op de bovenkant van het weefsel, pipette 0,5 mL PBS (pH 6,8) in de apicale kamer en 1,5 mL PBS (pH 7,4) in de basolaterale kamer.
  4. Verzamel monsters (0,2 mL) van de ontvangende zijden met intervallen van 1 uur over 3 uur en vervang met gelijke volumes verse buffer.
  5. Kwantificeer het fluxgevoede GLP-1 RA-peptide met uHPLC.
    OPMERKING: Er wordt geen adsorptie van GLP-1RA met 3D-inserts waargenomen na 3 uur, zoals weergegeven in Aanvullende Figuur 1 en Aanvullend Bestand 3.
  6. Meet de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) met een EVOM 2 voltohmmeter met STX2 eetstokjes elektroden op intervallen van 1 uur over 3 uur. TEER wordt berekend volgens de wet van Ohm.
  7. Om de integriteit van porcine buccale en sublinguale epitheliale weefsels te bevestigen, gebruik FD-4 (0,05 mM) als fluorescerende marker.
    OPMERKING: Alle experimenten worden driemaal uitgevoerd en de gerapporteerde resultaten zijn het gemiddelde ± SD van drie datasets.

6. uHPLC-detectie van de GLP-1 RA

  1. Kwantificeer de hoeveelheid GLP-1 RA die is doordrongen over oromucosae gemonteerd in FDC's en inserts, van elk van donorzijde oplossingen, HTC's en films door uHPLC met behulp van een CSH C18-kolom (130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm) met een mobiele fase van 0,1% TFA in acetonitril (Eluent A) en 0,1% TFA in water (Eluent B), gradiënt-elusie over 8 minuten bij 30 °C, met een injectievolume van 20 μL en een debiet van 0,7 mL/min, en UV-detectie bij 214 nm (retentietijd: ~4,2 min).
  2. Voer een lineariteitsstudie uit.
    1. Ontwerp een lineariteitsstudie om de analytische respons van de geoptimaliseerde uHPLC-condities te schatten met behulp van GLP-1 kalibratiestandaarden in het bereik van 2,5–20,0 μg·mL⁻1.
    2. Bereid onafhankelijk kalibratiestandaarden voor (n = 6–8 niveaus) en injecteer monsters in drievoud exemplaren. Voer een kleinste-kwadraten lineaire regressie uit van piekoppervlakte (mAU) versus nominale concentratie, en beoordeel lineariteit met behulp van de bepalingscoëfficiënt (r2), het % y-intercept en de verdeling van residuen (waargenomen–voorspelde respons).
      OPMERKING: Visuele inspectie van de kalibratiegrafiek en de residugrafiek gaf een onbeduidende afwijking van lineariteit aan bij het laagste gevoeligheidsniveau (2,5 μg·mL⁻1), waarbij residuen binnen de vooraf gedefinieerde acceptatiegrens (±3%) vallen. Het kalibratiebereik wordt vervolgens beperkt tot een bereik van 2,5–20,0 μg·mL⁻1, waarbij de regressie acceptabele lineariteit liet zien (r2 ≥ 0,999, % y-intercept < 2%, en alle residuen binnen ±3%).

7. Schatting van GLP-1RA die in buccale weefsel wordt vastgehouden

  1. Verwijder het porcine buccale epitheelslijmvlies dat is blootgesteld aan GLP-1 RA en GDC van FDC's/inserts.
  2. Spoel het weefsel drie keer af met PBS om geadsorbeerd geneesmiddel en film hulpstoffen te verwijderen.
  3. Homogeniseer vervolgens het weefsel in 5 mL PBS met een tafelhomogenisator totdat het volledig gefragmenteerd is.
  4. Bewaar het monster een nacht bij 4 °C om de evenwicht van peptideverdeling tussen gehomogeniseerd weefsel en PBS mogelijk te maken.
  5. Vervolgens centrifugeer je het mengsel op 5000 × g gedurende 5 minuten om de fragmenten neer te slaan en het supernatant te verzamelen voor kwantificatie.
  6. Steriliseer het supernatant met 0,22 μm centrifugefilters om resterende deeltjes te verwijderen vóór uHPLC-analyse.

8. Histologie van oromucosaal weefsel

OPMERKING: Na 3 uur permeatie van de GLP-1 RA uit mengsels, HTC's of films, worden mucosaeën verwerkt voor schadebeoordeling.

  1. Fix de weefsels in 10% formaline gedurende 48 uur, en voeg de vastgestelde weefsels vervolgens in paraffine in.
  2. Snijd de weefsels in een grootte van 5 μm met behulp van een microtoom.
  3. Kleur vervolgens weefsels met hematoxyline en eosine (HE) om de histologische integriteit te onderzoeken met lichtmicroscopie bij 4× vergroting.
  4. De dia's worden met een rechtopstaande microscoop afgebeeld en geanalyseerd met beeldanalysesoftware.
    OPMERKING: De algemene workflow wordt samengevat in Figuur 4.

Resultaten

Isolatie en dissectie van porcine buccale epitheelweefsels
Varkensbuccale mucosa wordt veel gebruikt als surrogaatweefsel voor menselijke oromucosae omdat ze vergelijkbare anatomische kenmerken en fysiologische barrière-eigenschappen delen29. Varkens-buccale epitheelweefsels worden geïsoleerd met zowel chirurgische als verhittingsmethoden, zoals weergegeven in Figuur 4. Aanvankelijk wordt een scalpel gebruikt om spieren en diepere bindweefsels uit de wangen te verwijderen. De geïsoleerde weefselstukken met gecombineerde en intacte slijmvliezen en bindweefsel worden vervolgens in een warme PBS geplaatst, verwarmd tot 65 °C gedurende 3 minuten. Het weefsel wordt uit de buffer verwijderd, en het epitheel en de onderliggende lamina propria worden afgepeld met de tang maat 5. Verhitting zorgt voor een consistente, uniforme dikte in het resulterende gedissecte epitheel.

Ex vivo permeatie van een GLP-1RA over varkensbuccale oromucosae, gemonteerd in FDC's en 3D-geprinte inzetstukken
Ex vivo permeatie van GLP-1RA werd beoordeeld met behulp van porcine buccale epitheliale weefselmucosaeën gemonteerd in FDC's en inzetstukken. Om de optimale concentratieverhouding van de GLP-1 RA: GDC te beoordelen, werden HTC's met wattenpadjes met een oppervlakte van 12,7 mm bevestigd aan de donorzijde van mucosaeën gemonteerd in FDC's, en werd het peptide-versterkermengsel op het wattenpad gepipeteerd. De cumulatieve permeatie van de GLP-1 RA bereikte ongeveer 4,3% over 3 uur wanneer GDC werd meegenomen in een verhouding van 1:1 (GLP-1RA 25 mg: GDC 25 mg). Daarentegen werd bij afwezigheid van GDC geen detecteerbare GLP-1RA-flux waargenomen27. Kwantitatieve permeabiliteitsparameters, inclusief deP-app, worden berekend met de volgende formule:

Papp = figure-results-1

Waar:
Papp: schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt (cm/s).
dQ/dt: transportsnelheid van de GLP-1RA in stationaire toestand, berekend als de hoeveelheid peptide die per tijdseenheid wordt getransporteerd (μg/s).
A: gebied van 3D-insert (cm2).
Co: de initiële concentratie van het peptide in het donorcompartiment (apicale) compartiment (μg/mL).

De schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt (Papp) van GLP-1RA over het porcine buccale slijmvlies is weergegeven in Aanvullende Figuur 2. Wanneer de GLP-1RA:GDC-verhouding 1:1 was, werden dezelfde concentraties als voor HTC's in dubbellaagfilms verwerkt; echter, GLP-1RA-permeatie over geïsoleerde porcine buccale weefsels was niet kwantificeerbaar met de conventionele FDC-opstelling, omdat de presentatie van GLP-1RA van de films naar mucosae langzamer verloopt dan bij gemengsels in oplossing of HTC's. Om deze beperking te overwinnen, werden op maat gemaakte 3D-geprinte inserts met laag volume ontwikkeld om het ontvangervolume te verlagen tot 1,5 mL, waardoor de detectiegevoeligheid verbeterde. Met behulp van 3D-inserts was de cumulatieve permeatie van GLP-1RA uit buccale films over 3 uur meetbaar en bereikte ongeveer 1,8%, zoals te zien is in Figuur 5. TEER-waarden en FD-4-fluxen werden gebruikt om de integriteit van epitheliale barrières en paracellulaire permeabiliteit te evalueren. Er werd een tijdsafhankelijke afname van TEER waargenomen (Aanvullende Figuur 3) in de behandelgroepen en correspondeerde met een verhoogde GLP-1RA-permeatie. PBS en met blanke film behandelde weefsels toonden geen veranderingen in TEER, wat aangeeft dat de bilayer-filmmatrix de barrière niet verstoorde. Deze gegevens betrekken GDC als de belangrijkste bijdrager aan het permeatieverhogende effect.

Histologische beoordeling van varkensweefsel
Histologische evaluatie van ex vivo porcine buccale mucosa werd uitgevoerd om de impact van weefselisolatiemethoden te beoordelen en om de epitheliale integriteit na 3 uur blootstelling aan GLP-1RA en GDC te onderzoeken. Zoals getoond in Figuur 6, behielden vers geïsoleerde weefsels verkregen met de verwarmingsmethode de normale epitheliale fysiologische architectuur, met intacte gelaagde lagen en continu oppervlakteslijm, en toonden geen bewijs van structurele schade. Daarentegen vertoonden weefsels die door mechanische afscheiding werden geïsoleerd of aan opslag/bevriezing werden onderworpen kleine veranderingen in de morfologie van de epitheelcellen en een vermindering van de dikte van het oppervlakteslijm. Buccale mucosae blootgesteld aan 25 mg GLP-1RA in aanwezigheid van 25 mg GDC behield de epitheliale integriteit en leek sterk op onbehandelde controles. Er werden alleen milde oedeem en oppervlakkige epitheliale erosie waargenomen. Blootstelling aan GLP-1RA alleen of aan blank en GLP-1RA: GDC-geladen bilayer-films veroorzaakten geen zichtbare weefselbeschadiging, en histologische kenmerken waren vergelijkbaar met die van PBS-behandelde controleweefsels.

figure-results-2
Figuur 1: Varkensmondholte met buccale en sublinguale slijmvliesgebieden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 2: FDC's en componenten. Zes kamers zijn gemonteerd in een geïntegreerd systeem (links). Een individu, Franz Cell, wordt getoond (midden). Het montagesysteem voor buccal weefsel in een individuele kamer (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 3: Componenten van 3D-geprinte 1 cm2 resin inzetstukken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 4: Werkwijze voor isolatie, montage, permeatie en histologische karakterisatieprocessen van porcine buccale epitheel. Gemaakt in BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 5: Cumulatief aantal van de GLP-1 RA. Ex vivo cumulatieve hoeveelheid GLP-1 RA doordrong aan de ontvangerzijde van het porcine buccale epitheliale mucosa na 180 minuten aanbrengen van 25 mg/mL GLP-1RA (Rood), 25 mg/mL GLP-1RA: 25 mg/mL GDC-oplossing (Zwart), en 25 mg/mL GLP-1RA: 25 mg/mL GDC geladen in films (paars) aangebracht via HTC, FDC en 3D-inserts. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 6: HE-gekleurde microscopische beelden van porcine buccale epitheliale mucosae onder verschillende belichtingsomstandigheden. (A) Blanco film, (B) waterig mengsel van GLP-1RA: GDC, (C) films gevangen met GLP-1RA:GDC, (D) mucosae geïsoleerd uit vers weefsel na warmtebehandeling (65 °C), (E) buccale epiteel geïsoleerd uit bevroren weefsel na warmtebehandeling, (F) mucosae geïsoleerd met een mechanische methode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Samenstelling van de mucoadhesie-laag
ComponentenConcentratie (mg)
GLP-1RA12,5 mg
GDC12,5 mg
HPMC45 mg
Na-CMC10 mg
PVP-K9025 mg
Glycerol3 mg
Aerosil 200F2 mg
Achterlaag
Ethylcellulose5 mg
Propyleenglycol5 mg

Tabel 1: Samenstelling van mucoadhesive- en ruglagen van buccale film.

Aanvullende Figuur 1: Adsorptie van GLP-1RA na het incuberen van 0,5 mg GLP-1RA gedurende 6 uur met 3D-inserts. De gegevens zijn het gemiddelde ± SD van drie experimenten (n = 3).Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt (Papp) van een GLP-1RA na 3-uur blootstelling van porcine buccale slijmvlies, gemonteerd in 3D-inzetstukken. 25 mg/mL GLP-oplossing (rood), 25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC waterige oplossing (zwart), en 25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC opgenomen in buccale films (paars). De weergegeven gegevens zijn het gemiddelde ± SD (n = 3). Statistische significantie tussen groepen werd waargenomen: p < 0,05. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3: Transepitheliale weerstand (TEER). Geleidelijke vermindering van transepitheliale weerstand (TEER) uit geïsoleerd porcine buccaal epitheelweefsel gefixeerd in 3D-inserts, na blootstelling aan 25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC-oplossing (rood), 25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC in buccale films (groen), en 25 mg/mL GLP-1RA in PBS (blauw). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Weefselintegriteit en lekkage. Weefselintegriteit en lekkage werden geëvalueerd door porcine buccale epitheelweefsels in 3D-inserts bloot te stellen aan 0,05 mM FD4 aan de donorzijde. Monsters werden op vaste intervallen van 60 minuten over 6 uur teruggetrokken. Gemiddelde +SD van drie experimenten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Bestand 1: transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Bestand 2: transwell-v9 (JOVE).stl.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Dossier 3: Aanvullende experimentele details.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Deze methodologie beschrijft experimentele protocollen voor de isolatie van porcine buccale en andere oromucosale epitheel, samen met permeabiliteitstests voor peptide-gebaseerde therapieën met een laagpotentie stabiel GLP-1RA-analogon als voorbeeld30. Peptiden zijn hydrofiele macromoleculen met verwaarloosbare permeabiliteit over slijmvliezen17. De succesvolle uitvoering van het bovenstaande protocol is afhankelijk van nauwkeurige isolatie en het plaatsen van het buccale en sublinguale slijmvlies. Isolatie vereist gespecialiseerde vaardigheid en strenge temperatuurregeling; Zelfs kleine thermische schommelingen tijdens het verwarmingsproces kunnen schadelijke fysiologische en morfologische veranderingen in het epitheelweefsel veroorzaken, wat uiteindelijk de integriteit van permeatiegegevens in gevaar brengt. Bovendien is het vastzetten van het geïsoleerde weefsel in de aangepaste 3D-geprinte inserts een cruciale stap. Gezien de kwetsbare aard van de epitheellagen is er een hoger risico op weefselbreuk of -lekkage tijdens het monteren. Om dit te beperken, gebruikten we een FD4-lektest, die dient als kwaliteitscontrole om de integriteit van het membraan te waarborgen voordat fluxstudies worden gestart. FD4-lekkage werd aanvankelijk visueel beoordeeld en verder gekwantificeerd met UV-zichtbare spectroscopie. De bijbehorende gegevens worden verstrekt in de aanvullende gegevens (Aanvullende Figuur 4 en Aanvullend Bestand 3).

Conventionele FDC, beschouwd als standaard voor ex vivo studies, brengt vaak uitdagingen met zich mee bij het kwantificeren van peptidetherapieën vanwege de hoge volumes in de ontvangerkamer, meestal 10 mL. Het hoge volume leidt tot overmatige monsterverdunning, waardoor de concentraties van permeated peptiden onder de lagere LOD worden geduwd voor standaard analytische methoden. Om dit te voorkomen hebben we een nieuw 3D-geprinte insert ontwikkeld dat de schaal en volumes van het transwells-systeem nabootst dat wordt gebruikt voor epitheelcelmonolagen, waaronder Caco-231. De inserts kunnen direct in standaard 12-well weefselkweekplaten worden geplaatst en huisvesten geïsoleerde porcine buccale epitheliale mucosaeën veilig. Deze aanpassing vermindert het volume van het donorcompartiment aanzienlijk bijna 7 keer tot 1,5 mL, waardoor de analyte wordt geconcentreerd en gevoeligheidsbeperkingen van uHPLC wordt overwonnen. Deze aanpassing is vooral belangrijk voor de kwantificering van kostbare laagpermeabiliteitspeptide-geneesmiddelen.

Een toename van GLP-1 RA-permeatie in aanwezigheid van GDC werd waargenomen met het 3D-insertsysteem. De cumulatieve permeate hoeveelheid GLP-1RA bereikte ~55,3 μg na 3 uur, wat overeenkomt met ~4,3% van de aanvankelijk toegepaste concentratie aan de donorzijde. Daarentegen werd geen meetbare GLP-1 RA-flux gedetecteerd wanneer vergelijkbare concentraties GLP-1RA en GDC gevangen in buccale films werden toegepast op buccale mucosaeën gemonteerd in FDC's, wat suggereert dat peptidepermeatie mogelijk heeft plaatsgevonden maar analytisch ondetecteerbaar bleef door overmatige verdunning in het grote ontvangervolume. De cumulatieve permeatie van GLP-1 RA uit de bilayer buccale filmformulering bereikte echter ongeveer 1,8% na 3 uur in 3D-inserts gedurende 3 uur, wat de haalbaarheid aantoont om laag-niveau peptidetransport over buccal weefsel te detecteren uit doseringsvormen met het miniaturisatie van het ontvangersysteem. De ex vivo permeatie van GLP-1 RA werd ook geëvalueerd met HTC's die een wattenschijfje bevatten met het peptide en GDC. Dit is een zeer nuttig initiële screeningsapparaat om te bewijzen dat de presentatie van een peptide uit films met een permeatieversterker mogelijk is. De barrièreintegriteit van het porcine buccale epitheel kan tijdens het experiment worden gemonitord met behulp van TEER- en FD-4-lekkas. Een langzame, tijdsafhankelijke afname van TEER werd waargenomen tijdens blootstelling aan GLP-1 receptoragonist (GLP-1 RA), wat consistent is met een verhoogd paracellulair transport dat in buccale mucosae wordt geïnduceerd door galzout32.

Een beperking van deze techniek is de afhankelijkheid van vers varkensweefsel, dat niet altijd op aanvraag beschikbaar is bij slachthuizen, en de kwaliteit van het weefsel kan variëren. Om de beperkingen van het verkrijgen van vers weefsel op redelijke afstand van het laboratorium aan te pakken, evalueerden we cryoprotectie voor het opslaan van hoogwaardige monsters die we later konden gebruiken. Hoewel het gebruik van vers weefsel optimaal is, vereist het gebruik van geïsoleerde opgeslagen mucosale weefsels zorgvuldig gebruik van cryoprotectiva en vriessnelheden om de vorming van ijskristallen en daaropvolgende barrièreschade te voorkomen. Het protocol heeft de capaciteit om de kloof te overbruggen tussen standaard macro-schaal permeatiestudies en peptide-analyse met hoge gevoeligheid. Door zowel het weefselisolatieproces als het permeatieprotocol met 3D-inserts te optimaliseren, hebben we een hogere mate van reproduceerbaarheid en gevoeligheid bereikt dan typisch wordt gerapporteerd bij FDC's. Bovendien biedt het gebruik van 3D-inserts een kader voor onderzoekers om detectielimieten te stellen voor kostbare peptidemoleculen, wat een aanzienlijke verbetering van de flexibiliteit en doorvoer van ex vivo mucosaal onderzoek vertegenwoordigt.

Deze protocollen vormen een basis voor betrouwbare metingen van permeatie van mucosaal weefsel met behulp van geneesmiddelklassen die verder gaan dan peptiden. De mogelijkheid om permeatieprofielen met hoge resolutie te genereren uit ex vivo modellen zal helpen bij voorspellingen van preklinische absorptiegegevens afkomstig van diermodellen. De GLP-1 RA ex vivo permeatie werd ook geëvalueerd met HTC's die een wattenpad bevatten met het peptide en GDC, een permeatie-versterkeroplossing. Deze toedieningsmethode zorgde voor intiem, reproduceerbaar contact tussen de admixture en het slijmvlies. Er werd een significante toename in de permeatie van GLP-1RA waargenomen met een 1:1 verhouding van GDC in transwells-nabootsende 3D-inserts. Dit is een zeer nuttig screeningsapparaat om het concept te bewijzen dat de presentatie van een peptide uit films met een permeatieversterker mogelijk is in een geconstrueerd ontwerp dat is aangepast van gekweekte monolagen van epitheelcellen naar weefselmucosae. De barrièreintegriteit van het porcine buccale epitheel kan tijdens het experiment worden gemonitord met behulp van TEER-metingen en FD4-lekkage.

Over het algemeen tonen de ex vivo permeatie- en histologische beoordelingen aan dat een betrouwbare beoordeling van buccale en sublinguale peptidetransport in aanwezigheid van een permeatieversterker afhankelijk is van weefselvoorbereiding, fluxprotocollen en analytische gevoeligheid. Onder de onderzochte isolatiebenaderingen bood de scheiding van vers gesourced porcine buccale en sublinguale epithel met behulp van de warmtemethode een goede balans tussen het behouden van epitheelintegriteit en de reproduceerbaarheid van weefsel, zoals blijkt uit stabiele baseline TEER, minimale FD4-lekkage en behouden weefselcellenstructuren. Belangrijk is dat de 3D-geprinte insert de experimentele betrouwbaarheid aanzienlijk verbeterde door de verdunning van het ontvangercompartiment te verminderen, waardoor de kwantificatie van lage peptidefluxen mogelijk werd die niet detecteerbaar waren in FDC's. Gezamenlijk ondersteunen deze bevindingen het gebruik van geïsoleerde porcine buccale epitheliale mucosae in een weefselinzetkamer als ex vivo platform voor het evalueren van buccale toediening van therapeutische peptiden voor systemische toediening.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen financiële betrokkenheid of belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Ben Shovlin (UCD School of Veterinary Medicine) voor de technische hulp. We danken ook Dr. Hans Eckhardt (UCD School of Chemistry) voor de ondersteuning bij uHPLC-analyse. Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon Europe onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidienummer 101071054. We erkennen ook aanvullende financiering van Subsidie Nummer 13/RC/2073_P2, het Research Ireland CURAM Center for Medical Devices en het Europees Ontwikkelingsfonds. De auteurs willen Kenneth McNamara van Rosderra Irish Meats bedanken voor het aanleveren van varkenswangen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Computer / LaptopGenericElk standaard systeem≥8 GB RAM aanbevolen
Data acquisitie scriptAangepastcollect.pyPython-gebaseerd acquisitie script
Wegwerp gel elektrodenGenericVoorgevulde Ag/AgCl elektrodenVoor eenmalig gebruik, zelfklevend
EEG acquisitie moduleUpside Down LabsBioAmp EXG PilAnaloge front-end voor biopotentiaal signalen
Elektrode gel (indien herbruikbare elektroden worden gebruikt)GenericGeleidende gelVerbetert geleiding van signalen
Interactieve applicatie (spel)GenericElk eenvoudig spel (bijv. racen)Toetsenbord-gestuurde interface
Jumper dradenGenericMannelijk–Vrouwelijk connectorenStandaard breadboard draden
Matplotlib / SeabornOpen-sourceLaatste versiesVisualisatie bibliotheken
Microcontroller boardArduinoUno / Maker Uno10-bit ADC, USB interface
Python programmeeromgevingPython Software FoundationPython ≥3.8Open-source programmeertaal
PyTorch bibliotheekMeta AIVersie ≥1.12Deep learning framework
Scikit-learnOpen-sourceLaatste stabiele versieML hulpmiddelen
Signaal verwerking bibliothekenSciPyLaatste versieFiltering, STFT
USB kabelGenericUSB Type-A naar BGegevensoverdracht kabel

Referenties

  1. Karki, S., et al. Oromucosal films for peptide delivery: formulation strategies using permeation enhancers and polymers. Drug Deliv Transl Res. , (2025).
  2. Karavasili, C., Eleftheriadis, G. K., Gioumouxouzis, C., Andriotis, E. G., Fatouros, D. G. Mucosal drug delivery and 3d printing technologies: a focus on special patient populations. Adv Drug Deliv Rev. 176, 113858(2021).
  3. Brayden, D. J., Hill, T., Fairlie, D., Maher, S., Mrsny, R. Systemic delivery of peptides by the oral route: formulation and medicinal chemistry approaches. Adv Drug Deliv Rev. 157, 2-36 (2020).
  4. Al Musaimi, O. FDA's stamp of approval: unveiling peptide breakthroughs in cardiovascular diseases, ACE, HIV, CNS, and beyond. J Pept Sci. 30 (11), e3627(2024).
  5. Lewis, A. L., McEntee, N., Holland, J., Patel, A. Development and approval of Rybelsus (oral semaglutide): ushering in a new era in peptide delivery. Drug Deliv Transl Res. 12 (1), 1-6 (2022).
  6. Zhang, Y., Zhang, H., Ghosh, D., Williams, R. O. Just how prevalent are peptide therapeutic products? a critical review. Int J Pharm. 587, 119491(2020).
  7. Wanasathop, A., Patel, P. B., Choi, H. A., Li, S. K. Permeability of buccal mucosa. Pharmaceutics. 13 (11), 1814(2021).
  8. Mazzinelli, E., et al. Oral mucosa models to evaluate drug permeability. Pharmaceutics. 15 (5), 1559(2023).
  9. Djekic, L., Martinovic, M. In vitro, ex vivo and in vivo methods for characterization of bioadhesiveness of drug delivery systems. Bioadhesives Drug Deliv. , (2020).
  10. Mura, P., et al. A preliminary study for the development and optimization by experimental design of an in vitro method for prediction of drug buccal absorption. Int J Pharm. 547 (1-2), 530-536 (2018).
  11. Majid, H., Bartel, A., Burckhardt, B. B. Development, validation and standardization of oromucosal ex-vivo permeation studies for implementation in quality-controlled environments. J Pharm Biomed Anal. 194, 113769(2021).
  12. Wakchaure, R. S., Dhial, K., Pathak, A. Ethical and Safety Considerations in Drug Delivery Systems. Next-Generation Drug Delivery Systems. , Springer, Humana. New York, NY. (2025).
  13. Wang, S., Zuo, A., Guo, J. Types and evaluation of in vitro penetration models for buccal mucosal delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 61, 102122(2021).
  14. Sa, G., et al. Histological features of oral epithelium in seven animal species: as a reference for selecting animal models. Eur J Pharm Sci. 81, 10-17 (2016).
  15. Patel, V. F., Liu, F., Brown, M. B. Modeling the oral cavity: in vitro and in vivo evaluations of buccal drug delivery systems. J Control Release. 161 (3), 746-756 (2012).
  16. Tian, Y., et al. Oromucosal films: from patient centricity to production by printing techniques. Expert Opin Drug Deliv. 16 (9), 981-993 (2019).
  17. Malhotra, S., Lijnse, T., O'cearbhaill, E., Brayden, D. J. Devices to overcome the buccal mucosal barrier to administer therapeutic peptides. Adv Drug Deliv Rev. 220, 115572(2025).
  18. De Vries, M. E., et al. Localization of the permeability barrier inside porcine buccal mucosa: a combined in vitro study of drug permeability, electrical resistance and tissue morphology. Int J Pharm. 76 (1-2), 25-35 (1991).
  19. Diaz Del Consuelo, I., Pizzolato, G. P., Falson, F., Guy, R. H., Jacques, Y. Evaluation of pig esophageal mucosa as a permeability barrier model for buccal tissue. J Pharm Sci. 94 (12), 2777-2788 (2005).
  20. Pather, S. I., Rathbone, M. J., Şenel, S. Current status and the future of buccal drug delivery systems. Expert Opin Drug Deliv. 5 (5), 531-542 (2008).
  21. Junginger, H. E., Hoogstraate, J. A., Verhoef, J. C. Recent advances in buccal drug delivery and absorption—in vitro and in vivo studies. J Control Release. 62 (1-2), 149-159 (1999).
  22. Goswami, T., Jasti, B. R., Li, X. Estimation of the theoretical pore sizes of the porcine oral mucosa for permeation of hydrophilic permeants. Arch Oral Biol. 54 (6), 577-582 (2009).
  23. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D., Grizzle, W. A. Standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotech Histochem. 91 (5), 309-326 (2016).
  24. Franz-Montan, M., et al. Evaluation of different pig oral mucosa sites as permeability barrier models for drug permeation studies. Eur J Pharm Sci. 81, 52-59 (2016).
  25. Pegg, D. E. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2014).
  26. Hoogstraate, A., et al. In vivo buccal delivery of fluorescein isothiocyanate-dextran 4400 with glycodeoxycholate as an absorption enhancer in pigs. J Pharm Sci. 85 (5), 457-460 (1996).
  27. Karki, S., et al. A pullulan-based bilayer film for buccal delivery of a GLP-1 peptide analogue. Carbohydr Polym. 380, 125064(2026).
  28. Shu, W., et al. Computational and experimental analysis of drug-coated microneedle skin insertion: the mode of administration matters. Adv Mater Interfaces. 12 (17), 2500202(2025).
  29. Marxen, E., Axelsen, M. C., Pedersen, A. M. L., Jacobsen, J. Effect of cryoprotectants for maintaining drug permeability barriers in porcine buccal mucosa. Int J Pharm. 511 (1), 599-605 (2016).
  30. Rebollo, R., et al. Salcaprozate-based ionic liquids for GLP-1 gastric delivery: a mechanistic understanding of in vivo performance. J Control Release. 377, 267-276 (2025).
  31. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat Protoc. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  32. Brayden, D. J., Stuettgen, V. Sodium glycodeoxycholate and sodium deoxycholate as epithelial permeation enhancers: in vitro and ex vivo intestinal and buccal bioassays. Eur J Pharm Sci. 159, 105737(2021).

Herprints en machtigingen

Tags

Peptidepermeatieex vivo modelbuccale mucosaFranz diffusiecellen3D geprinte insertspermeatiebevorderaartransepitheliale elektrische weerstandmucoadhesieve filmsultra hogedrukvloeistofchromatografie
Een gestandaardiseerd ex vivo porcine oromucosale model voor het evalueren van peptidefluxen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.