Onderzoek naar de ovariummicroomgeving: Methoden voor isolatie, 2D-kweek en organoïde kweek van somatische cellen van muis eierstokcellen

Samenvatting

We beschrijven methoden om somatische cellen van muis-ovariumcellen te isoleren uit een stroma-verrijkte fractie van de eierstok en om somatische organoïden van muis-ovarium te genereren met een steigervrije benadering.

Samenvatting

De eierstok bestaat uit heterogene populaties van somatische cellen, zowel binnen de follikel als in het omliggende stroma, die cruciaal zijn voor het ondersteunen van de eierstokfunctie en voor de vorming van hoogwaardige gameten. We rapporteren methoden om somatische cellen te isoleren uit muiseierstokken, waaronder endotheel-, epitheel-, sterosterogene, stromale en immuuncellen. Wanneer deze primaire ovariumsomatische cellen worden geplateerd en gekweekt in een traditioneel 2D-kweeksysteem, gaan de cellulaire heterogeniteit, organisatie en cel-cel en cel-matrix interacties die typisch in de eierstok worden aangetroffen, verloren. Zo beschrijven we ook hoe we muis-ovarium-somatische organoïden kunnen genereren met een scaffold-vrije benadering. Deze organoïden assembleren zichzelf, onderhouden diverse celpopulaties en produceren extracellulaire matrix en afgescheiden factoren, waaronder cytokines. Organoïden kunnen worden gebruikt voor co-kweekexperimenten en kunnen minstens 3 weken in cultuur worden gehouden met een hoge levensvatbaarheid. Over het algemeen maken deze modellen het mogelijk om de fysiologie en pathologie van de eierstokken vanuit het perspectief van somatische cellen te onderzoeken.

Inleiding

Hoewel de oocyt, of vrouwelijke gamet, essentieel is voor de voortkomst van de volgende generatie, spelen somatische celpopulaties in de eierstok een cruciale rol in de ontwikkeling van gameten, de productie van steroïdenhormonen en de homeostase van de eierstok. Oocyten, omgeven door somatische granulosa en thecacellen, vormen de functionele eenheden van de eierstok die bekend staan als follikels. Granulosa-cellen zijn fysiek verbonden met de oocyt door transzonale projecties en bieden metabole en voedingsondersteuning aan de eicel, naast het reguleren van meiotische arrest ^1,2. Bovendien produceren granulosa- en thecacellen als reactie op gonadotropinen steroïdenhormonen, waaronder oestrogeen, progesteron en androgeneren, die effecten hebben buiten het voortplantingssysteem en invloed hebben op het cardiovasculaire, musculoskeletale en zenuwstelsel, en daarmee de algehele vrouwelijke gezondheid^beïnvloeden. Ovariumfollikels ontwikkelen zich binnen een heterogeen ovariumstroma bestaande uit vaat- en immuuncellen, verschillende populaties interstitiële fibroblasten en mesenchymale cellen, evenals een sterk geordende extracellulaire matrix (ECM)⁴. Deze stromale micro-omgeving geeft fysieke en chemische signalen die de groei van follikels, ovulatie en luteinisatie^beïnvloeden.

Er bestaan verschillende methoden om gameten en follikels in vitro te isoleren en te kweken, en deze methoden hebben ons begrip van oogenese en folliculogenese^verder ontwikkeld. Het somatische compartiment van de eierstok is echter relatief onderbelicht, deels door het ontbreken van robuuste in vitro modellen. Huidige modellen van het ovarium somatisch compartiment zijn grotendeels beperkt tot één celtype, zoals fibroblasten, ovariumoppervlakepitheelcellen, endotheelcellen, immuuncellen of granulosacellen 6,7,8,9,10,11. De kweek van breed gedefinieerde primaire ovariumsomatische cellen in 2D bevoordeelt macrofagenpopulaties in de loop van de tijd, wat resulteert in verlies van cellulaire heterogeniteit¹². Bovendien houdt traditionele tweedimensionale (2D) monolaagcultuur geen rekening met de diverse cel-cel- en cel-matrixinteracties die in de eierstok aanwezig zijn. Ovariumweefsel-explants behouden de cellulaire en structurele complexiteit van het oorspronkelijke weefsel, maar variëren in samenstelling afhankelijk van waar binnen de eierstok ze afkomstig zijn^13,14.

Organoïden zijn driedimensionale (3D), meercellige, geminiaturiseerde versies van organen of weefsels die in vivo organisatie en functies replicitueren^15,16. Organoïden kunnen worden aangemaakt uit stamcellen of primaire cellen die geïsoleerd zijn uit normaal of ziek weefsel¹⁵. In de context van het vrouwelijke voortplantingssysteem zijn organoïden gegenereerd om het endometrium, de eileider, de baarmoederhals en placenta¹⁷ te modelleren. Wat betreft de eierstok waren organoïde modellen tot voor kort beperkt tot één celtype, zoals epiteelcellen of kankercellen aan het ovariumoppervlak, of zijn ze gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen om follikelstructuren te lijken in plaats van het eierstokstroma^17,18. Recente studies hebben organoïden gegenereerd en gekarakteriseerd met behulp van heterogene populaties van somatische cellen geïsoleerd uit muis-, rhesusmakaak- en menselijk eierstokweefsel 19,20,21. Deze organoïde modellen hebben onderzoek mogelijk gemaakt naar cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan eierstokveroudering, evenals de effecten van ftalaatblootstelling op de samenstelling van ECM^19,21.

Gezien het cruciale belang van somatische cellen, zowel in de follikel als in stroma, voor de ovariumfunctie, beschrijven we methoden om somatische cellen te isoleren uit een stroma-verrijkte fractie van muiseierstokken en om deze in vitro te kweken met behulp van traditionele monolaagkweek of in een organoïdemodel. Met behulp van scaffoldvrije agarose-microschimmels vormen ovariumsomatische cellen organoïden binnen 1–3 dagen. Organoïden behouden belangrijke ovariumcelpopulaties, waaronder fibroblasten, macrofagen en steroïdogene cellen, en kunnen tot 3 weken met een hoge levensvatbaarheid worden gekweekt. Ovariumsomatische organoïden zijn bevorderlijk voor transcriptomische en histologische beoordelingen, analyse van geconditioneerde media, co-kweek met andere celtypen en chemische screeningsmethoden. Al met al vormen deze organoïden een robuust model voor in vitro onderzoeken en moduleren van het somatisch compartiment van de eierstoken en kunnen ze worden toegepast op de studie van de ontwikkeling, veroudering, fysiologie en pathologie van de eierstoken.

Protocol

Het gebruik van dieren om dit protocol te ontwikkelen was in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee van Northwestern University en de National Institutes of Health Guidelines for Care and Use of Laboratory Animals (Northwestern University Animal Welfare Assurance Number: A3283-01; IACUC Protocol ID: IS00013082_IM12). Fabrikantinformatie en catalogusnummers voor alle materialen, inclusief siliconen gietsels voor agarose micromalls, media en supplementen, worden vermeld in de Materiaaltabel. Een overzicht van de protocolstappen is te vinden in Figuur 1. Alle protocolstappen moeten worden uitgevoerd met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, in overeenstemming met alle institutionele bioveiligheids- en milieugezondheids- en veiligheidsvoorschriften, en, tenzij anders gespecificeerd, in een Klasse II bioveiligheidskast.

Figuur 1: Schema van de somatische celisolatie van de eierstokken, de vorming van somatische organoïden bij de eierstok en de toepassingen van latere organoïden. De eierstokken van de muizen worden geïsoleerd en de stromale fractie wordt verrijkt. De verrijkte stromale fractie wordt enzymatisch en mechanisch verteerd. Onverteerd weefsel wordt uitgezuit. Cellen worden gepelleteerd, gewassen, geteld en geplateerd voor 2D-kweek. Voor organoïdegeneratie worden cellen na 2D-kweek van de ene op de andere dag geoogst met trypsine en worden ze gepelleteerd, gewassen en geteld. Cellen worden gezaaid in agarose-microschimmels voor organoïdecultuur. Organoïden kunnen worden gebruikt voor histologie, RNA/eiwitextractie, analyse van conditionele media, behandelingen en geneesmiddelscreening, evenals co-kweek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Bereiding van media voor de somatische celisolatie en kweek van de eierstokken

OPMERKING: De vertering van eierstokweefsel en de daaropvolgende isolatie en kweek van primaire somatische cellen vereist vier typen media: Dissectiemedia (DM; gebruikt in stappen 2.3–2.4 voor dissectie en punctie van muiseierstokken), enzymatische media (EM; gebruikt in stappen 2.5–2.8 voor enzymatische vertering van stroma-verrijkte muiseierstokken), afkoelmedium (QM; gebruikt in stap 2.9 om enzymatische vertering te vertragen), en plateringsmedia (PM; gebruikt in stappen 2.11–2.14 en stap 4.6 voor wassen, plateren en 2D-kweek van primaire ovariumsomatische cellen, evenals inactivatie van trypsine bij het oogsten van de cellen uit 2D-kweek). Alle media moeten worden voorbereid in een gesteriliseerde, klasse II biologische veiligheidskast of laminaire stroomkap. De hieronder vermelde mediarecepten zijn voldoende voor het verwerken van eierstokken van 5–6 muizen, maar moeten indien nodig worden geschaald. Alle media kunnen tot een week van tevoren worden bereid en bij 4 °C worden bewaard, maar de enzymen voor de EM moeten vers worden toegevoegd op de dag van celisolatie.

1. Bereid DM (15 mL) met 1% foetaal rundserum (FBS) en 0,5% penicilline-streptomycine (PS) in Leibovitz' L-15 medium. Steriliseer het medium met een steriel filter.
   OPMERKING: DM wordt gebufferd voor omgevingsluchtuitwisseling en gebruikt tijdens microdissectie van de eierstok uit omliggende weefsels, evenals bij verrijking van de stromale fractie.
2. Bereid EM (10 mL) voor met 1% FBS en 0,5% PS in αMEM. Voeg 82 enzymatische eenheden/mL Collagenase IV toe en 0,2 mg/mL DNase I (≥400 enzymatische activiteitseenheden/mg). Los de enzymen op door te inverteren en steriliseer vervolgens het medium met een steriel filter.
   OPMERKING: Enzymatische media zijn natriumbicarbonaatgebufft voor luchtuitwisseling met 5%_CO2 en worden gebruikt voor enzymatische vertering van eierstokweefselstukken.
3. Bereid QM (20 mL) voor met 10% FBS en 0,5% PS in αMEM-medium. Steriliseer het medium met een steriel filter.
   OPMERKING: QM wordt natriumbicarbonaatgeborreld voor luchtuitwisseling met 5%_CO2 en gebruikt voor het afkoelen van de enzymatische vertering.
4. Bereid PM (30 mL) voor met 10% FBS en 1% PS in RPMI 1640 (met 25 mM HEPES en 2 mM L-Glutamine). Steriliseer het medium met een steriel filter.
   OPMERKING: PM is natriumbicarbonaatgeborster voor luchtuitwisseling met 5%_CO2 en wordt gebruikt voor het plateren van primaire ovariumsomatische cellen, evenals voor kweek in 2D.

2. Vertering van eierstokweefsel en isolatie van primaire somatische cellen

OPMERKING: Muizeneierstokken worden zowel enzymatisch als mechanisch geïsoleerd en verteerd om primaire somatische cellen te isoleren. Eierstokken van 5–6 muizen kunnen samen in hetzelfde gerecht worden verwerkt. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van een aseptische techniek, bij voorkeur met een dissectiemicroscoop in een laminaire stromingskap.

1. Voeg 10 ml EM, 20 ml QM en 20 ml PM toe aan aparte 100 mm petrischaaltjes. Houd de schalen in evenwicht in een weefselkweekincubator (bevochtigde omgeving, 37 °C met 5%_CO-2) minimaal 1 uur voor gebruik.
2. Verwarm DM in een waterbad (37 °C) vóór gebruik.
3. Ontleed de eierstokken van de muis in een 35 mm petrischaal met 3 mL DM. Scheid de eierstokken van het aanhechte vetweefsel, eileider en eierstokbursa met fijne pincet en/of microschaar (Figuur 2Ai,ii). Gebruik indien nodig een dissectiemicroscoop voor microdissectie.
4. Breng de gedissecte eierstokken over op een horlogeglas van 45 mm met 2–3 mL DM. Onder een dissectiemicroscoop veranker en prik je alle delen van de eierstokken met respectievelijk 28-G insulinenaalden met de niet-dominante en dominante hand, ongeveer 10 minuten. Roteer het eierstokweefsel regelmatig om ervoor te zorgen dat alle gebieden worden verstoord.
   OPMERKING: Het doorprikken van de eierstokken verrijkt de stromale fractie door preantrale follikels evenals cumulus-oocytcomplexen en granulosacellen uit antrale follikels vrij te laten (Figuur 2Aiii–iv).
5. Gebruik fijnpuntige pincetten om stroma-verrijkte muiseierstokken naar de petrischaal te verplaatsen met gebalanceerde EM (Figuur 2Bi).
6. Snel werken om temperatuur- en pH-veranderingen in het medium te minimaliseren, scheuren de door stroma verrijkte eierstokken in ongeveer 2–3 mm stukken met fijne pincetten (Figuur 2Bii).
7. Houd de petrischaal schuin en pipetteer herhaaldelijk EM met eierstokweefsel met een p1000 pipet, ingesteld op 1 mL, 100× of gedurende 3 minuten, afhankelijk van wat het eerst komt (Figuur 2Biii). Draai de petrischaal indien nodig om ervoor te zorgen dat alle weefselstukken gepipetteerd zijn.
   OPMERKING: Als het weefsel te groot is om met een p1000-tip te worden gepipetterd, kan de tip met een steriel scalpel worden doorgesneden om de opening breder te maken. De boring moet breed genoeg zijn om de meeste (>50%), maar niet alle weefselstukken binnen te laten, wat een afschuifeffect creëert.
8. Breng de Petrischaal met EM en stukjes eierstokweefsel over in een weefselkweekincubator (bevochtigde omgeving, 37 °C met 5%_CO2) en incubeer in totaal 30 minuten, verwijder de schaal en pipette herhaaldelijk (100× of 3 minuten) na 15 minuten, en daarna opnieuw aan het einde van de 30 minuten incubatie (Figuur 2Biii).
   OPMERKING: Na de eerste 15 minuten incubatie moeten de weefselstukken voldoende verteerd zijn zodat >80% door een p1000 pipettip past zonder dat de tip hoeft te snijden om de opening breder te maken. De totale duur van de vertering en de hoeveelheid pipetten die nodig is, hangen af van de begingrootte van de gescheurde weefselstukken. Bovendien kunnen de leeftijd en belasting van de muis, de variabiliteit van enzymen per batch en de grootte van de pipetboring allemaal invloed hebben op de snelheid van weefselafbraak. De spijsvertering moet worden gedempt wanneer de stukjes eierstokweefsel worden afgebroken tot ongeveer 1 mm grote fragmenten die nog zichtbaar zijn voor het oog (Figuur 2Biv). Oververtering kan leiden tot celverlies en verminderde levensvatbaarheid van cellen.
9. Verdun de enzymen om de weefselvertering te vertragen door 20 mL pre-equilibrated QM toe te voegen (Figuur 2Ci).
10. Laat de celsuspensie door een 40 μm celzeef lopen die over een 50 mL conische buis wordt geplaatst om onverteerde weefselstukken te verwijderen (Figuur 2Cii). Centrifugeer het filtraat op 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleten (Figuur 2Ciii).
11. Was de cellen door het supernatant te verwijderen door aspiratie, de celpellet opnieuw te suspenderen in 1 mL voorgeequilibreerd PM, de celsuspensatie over te brengen naar een 1,5 mL microcentrifugebuis, en centrifugeren op 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen opnieuw te pelleten (Figuur 2Civ).
12. Verwijder het supernatant, suspendeer de celpellet opnieuw in 1 mL PM, kleurt een 10 μL aliquot van cellen met trypanblauw om de levensvatbaarheid van de cel te beoordelen, en telt de cellen met een hemocytometer.
    OPMERKING: Zie Tabel 1 voor het verwachte aantal primaire ovariumsomatische cellen, afhankelijk van muizenstam en leeftijd, in dit stadium van het isolatieprotocol. De levensvatbaarheid van cellen in dit stadium zou >80% moeten zijn.
13. Plat de cellen op een met weefselkweek behandeld vat met een dichtheid van ongeveer 1,25 × 10 5-1,5 × 10⁵/cm^² (bijvoorbeeld bij celtellingen van ongeveer 3 × 10⁶, plaatcellen op een met weefselkweek behandelde 60 mm schaal, en voor celtellingen van ongeveer 1 × 10⁶, plaatcellen op één put van een met weefselkweek behandelde 6-put plaat).
    1. Voeg extra PM toe afhankelijk van het totale volume van het bord of schotel (bijvoorbeeld 4 ml PM als je een schotel van 60 mm gebruikt, of 2 ml PM als je een put van een 6-well plaat gebruikt).
       OPMERKING: De hierboven genoemde platingdichtheid wordt aanbevolen als de cellen worden gebruikt voor organoïdegeneratie na 2D-kweek van de ene op de andere dag. Voor een langere 2D-kweek kunnen cellen met een lagere dichtheid worden geplateerd. Extra platingmedia dat niet in balans is gebracht, kan tot 1 week op 4 °C worden bewaard. PM is nodig zowel voor de aanmaak van organoïden als voor het behouden van ovariumsomatische cellen in 2D-kweek. Op dit punt in het protocol kunnen de somatische ovariumcellen worden onderhouden in een 2D-monolaagcultuur (stap 2.14) of worden gebruikt om organoïden te genereren (ga verder met Sectie 3). 2D-kweek een nacht vóór organoïde generatie is noodzakelijk om eventuele oöcyten uit vroege follikels te verwijderen die mogelijk door de 40 μm celzeef zijn gegaan.
14. Na een nacht (minimaal 16 uur) te plateren, spoel je de cellen met fosfaatgeborduurde zoutoplossing (PBS; Mg/Ca-vrij, pH 7,0–7,3) om dode cellen en vuil te verwijderen (Figuur 3A). Voeg verse PM toe na het wassen en vervang media door verse PM om de dag gedurende de kweek (Figuur 3B).
    OPMERKING: Ondanks een hoge levensvatbaarheid van cellen na isolatie, wordt na plating 's nachts een groot verlies in het totale aantal cellen waargenomen, door celdood of het onvermogen om zich aan het weefselkweekvat te hechten (Figuur 3A).

Figuur 2: Schema van de somatische celisolatie van de muis ovarium. (A) Representatieve beelden van (i,ii) de dissectie van de eierstok van de muis en (iii,iv) stroma-verrijking. De eierstok van de muis is omlijnd met een stippellijn in Ai. (B) Representatieve afbeeldingen van eierstokweefselstukken gedurende de mechanische en enzymatische spijsvertering. Stroma-verrijkte eierstokken (i) voor en (ii) na het scheuren, (iii) stukjes eierstokweefsel tijdens het pipetten, en (iv) stukjes eierstokweefsel na de spijsvertering. (C) Representatieve beelden van (i) het afkoelen van de spijsvertering, (ii) het filteren van de celsuspensie, en (iii,iv) het pelleteren van de primaire somatische cellen van de eierstokken van de muis. Insets in Cii en Ciii tonen ongedigesteerde weefselstukken die respectievelijk na centrifugatie door de celsif en celpellet zijn opgevangen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Primaire somatische ovariumcellen kunnen in 2D worden gekweekt. (A) Vertegenwoordigende lichtbeelden van primaire ovariumsomatische cellen die 16 uur na het plateren in een schaal van 60 mm werden geplaatst, vóór en na het wassen met PBS. (B) Representatieve getranszentreerde lichtbeelden van primaire ovariumsomatische cellen, verplat in een 24-wellplaat over 3 dagen in cultuur. Schaalbalken = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Bereiding van agarose-micromallen en media voor de generatie en teelt van organoïden

OPMERKING: Ovariumsomatische organoïden worden gegenereerd en gekweekt in scaffoldvrije agarose-micromallen met ovariumorganoïde media. Agarose-micromallen en ovariumorganoïde media moeten worden voorbereid met aseptische techniek in een gesteriliseerde, biologische veiligheidskast van klasse II of laminaire stroomkap.

1. Bereiding van agarose-micromalls
   1. Plaats siliconen afgietsels voor micromallen en Graefe-tangen in een sterilisatiezak en autoclaaf met behulp van een droogcyclus om te steriliseren (manteldruk: 20 psi, kamertemperatuur: 250 °F (121,11 °C), sterilisatietijd: 15 min).
      OPMERKING: Verschillende siliconengietsels kunnen geautoclaveerd worden en tegelijk worden gebruikt voor snellere generatie van agarose-micromallen.
   2. Voeg 1 ml PBS met 1% PS toe aan elke put van een 24-put weefselkweekplaat voor opslag van de agarose-micromallen.
   3. Los 1,5% (w/v) steriele agarose op in PBS door te verwarmen in een magnetron, in een warmwaterbad of op een kookplaat.
      OPMERKING: Het oplossen van de agarose door het in de magnetrongolf in een 50 mL conische buis geplaatst in een 100 mL bekerglas gevuld met water werkt goed (Figuur 4Ai). Naast het mogelijk maken van gecontroleerd koken, vertraagt het warmwaterbad dat in de beker wordt gecreëerd de herverharding van de agarose.
   4. Laat de vloeibare agarose afkoelen tot ongeveer 50 °C totdat de buis comfortabel kan worden hanteerd.
   5. Pipetteer langzaam 300–350 μL van 1,5% agarose in de siliconen gietsel, waarbij je erop let dat je de giet niet te veel of te laag vult en belletjes vermijdt (Figuur 4Aii). Zorg ervoor dat de agarose een vlakke laag aan de bovenkant van de afgietsel vormt in plaats van een holle of bolle rand (Figuur 4Aiii,iv). Laat de bubbels knappen met een steriele p10-pipettip voordat de agarose begint te stollen (Figuur 4Bi–iii).
   6. Laat de agarose 2–3 minuten bij kamertemperatuur in de siliconengietsel stollen (Figuur 4Biv).
   7. Zodra het stevig is, draai je het siliconen om dat is gegoten over een put van de 24-put weefselcultuurplaat met PBS + 1% PS. Buig het siliconen voorzichtig om de agarose-micromal in de plaat vrij te geven (Figuur 4Ci).
      OPMERKING: Agarose-micromallen ondergedompeld in PBS +1% PS in een 24-well weefselkweekplaat omwikkeld met parafilm kunnen tot 1 maand voor gebruik bij 4 °C worden bewaard (Figuur 4Cii). Agarose-micromallen moeten minstens 16 uur voor gebruik worden voorbereid, omdat microwells vaak luchtbellen direct na het gieten en onderdompelen in PBS + 1% PS bevatten (Figuur 4Ciii). Deze luchtbellen verdwijnen echter tijdens opslag (Figuur 4Civ). Voor gebruik voor organoïde kweek moeten agarose-microwell-inserts zorgvuldig onder een microscoop worden onderzocht om te bevestigen dat microwells niet zijn samengevoegd of verstoord tijdens het gieten (Figuur 4Di–iv). Defecte micromallen worden niet aanbevolen voor de generatie en kweek van organoïden. Het wordt aanbevolen een overschot aan agarose-micromallen te bereiden om ~25% te verklaren die defecten zullen vertonen
2. Bereiding van organoïde media van de eierstokken
   1. Voeg in een bioveiligheidskast organoïde groeimedium (muis) supplementen 1 en 2 en 1% PS toe aan basaal medium volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het voorbereide organoïde ovariummateriaal tot 2 weken voor gebruik bij 4 °C.
      OPMERKING: Supplementen 1 en 2 kunnen worden gealiquoteerd en opgeslagen bij -20 °C.

Figuur 4: Schema dat de voorbereiding van agarose-micromallen toont. (A) Representatieve beelden van (i) 1,5% agarose-bereiding, (ii) pipetten in siliconengietsels, (iii) correct gevulde, en (iv) overgevulde siliconengietsels. Gestreepte lijnen in Aiii en Aiv tonen respectievelijk vlakke en bolle bodems van agarose micromallen. (B) Representatieve afbeeldingen van (i,ii) gevulde siliconen afgietsels met bellen in de agarose, (iii) het plukken van bellen met een pipetpunt vóór de agarose-stolling, en (iv) een gestolde agarose-micromal binnen de siliconenafgietsel. (C) Representatieve beelden van (i) verwijdering van gestolde agarose-micromallen uit siliconenafgietsels, (ii) opslag van agarose-micromallen in 24-wells platen met PBS + 1% PS, (iii) bubbels die direct na het gieten aanwezig zijn in microwells, en (iv) bubbelvrije, correct gegoten agarose-micromal na 16 uur opslag. (D) Representatieve beelden van micromallen met (i,ii) gecombineerde putten, (iii) verstoorde putten, of (iv) schade. Afkortingen: PBS = fosfaatgeborduurde zoutoplossing; PS = penicilline-streptomycine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Generatie en cultuur van organoïden

OPMERKING: Na een 2D-kweek van de ene op de andere dag worden primaire ovariumsomatische cellen uit de 2D-cultuur gehaald en in agarose-micromallen gezaaid om organoïden te genereren. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van aseptische techniek in een gesteriliseerde, klasse II biologische veiligheidskast.

1. Verwarm PM en organoïde media tot 37 °C in een waterbad en verwarm 0,05% trypsine tot kamertemperatuur.
2. Met Graefe-tang zet u de micromallen voorzichtig in de putjes van een nieuwe 24-put plaat (Figuur 5Ai).
3. Voeg 500 μL ovariumorganoïde media toe aan elke put van de 24-put plaat met een agarose-microschimmel (Figuur 5Aii). Zorg ervoor dat micromalls volledig in het medium zijn ondergedompeld en houd de micromallen en media minstens 30 minuten in evenwicht in een broedmachine (bevochtigde omgeving, 37 °C met 5% CO₂).
4. Verwijder PM uit hechtende ovariumcellen door aspiratie en was de cellen met Mg/Ca-vrije PBS.
5. Voeg 0,05% trypsine toe (1–2 ml trypsine voor een 6-well plaat of 60 mm schotel) om de cellen uit de 2D-cultuur te oogsten. Incubeer de cellen met trypsine gedurende 2–3 minuten bij 37 °C in een broedmachine.
6. Controleer onder een microscoop of de cellen zijn losgekomen en inactiveer de trypsine door twee volumes verwarmde PM toe te voegen voor elk volume trypsine dat wordt gebruikt.
7. Breng de celsuspensie over in een 15 mL conische buis en pellet de cellen door centrifugatie op 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
8. Susse de cellen opnieuw in 1 ml verwarmde PM, kleur een aliquot van cellen met trypanblauw om de levensvatbaarheid van de cel te beoordelen, en tel de cellen met een hemocytometer.
   OPMERKING: Zie Tabel 1 voor het verwachte aantal primaire ovariale somatische cellen, afhankelijk van muizenstam en leeftijd, na 2D-kweek 's nachts en daaropvolgende trypsinisatie. De levensvatbaarheid van trypsiniseerde cellen is doorgaans groter dan 90%.
9. Pellet de cellen door centrifugatie (300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur) en de celpellet opnieuw ophangen in ovariumorganoïde media tot een dichtheid van 3,33 × 10^{6 levende} cellen per 1 mL medium, dat wil zeggen 2,5 × 10⁵ levende cellen per 75 μL media.
   OPMERKING: Hier worden 2,5 × 10 à⁵ cellen gezaaid per agarose microschimmel. Het totale aantal micromalls dat kan worden gegenereerd hangt dus af van het totale aantal cellen. Organoïden kunnen worden gegenereerd met minder dan 2,5 × 10^{à 5} cellen per agarose-microschimmel, maar de grootte van organoïden, aggregatiekinetiek, relatieve cellulaire samenstelling en functies, inclusief hormoonproductie, kunnen worden beïnvloed.
10. Verwijder de in balans geraakte agarose-micromallen uit de broedmachine, zorg ervoor dat de micromallen zo zijn georiënteerd dat de zaaikamer naar boven wijst, en verwijder het organoïde ovariummateriaal uit de celzaaikamers (Figuur 5Aiii).
    1. Verwijder het medium uit de celzaaikamers van de micromallen door Graefe-tangen te gebruiken om de micromallen op te tillen en te kantelen, of door te pipetten. Om het medium uit de zaaikamers van cellen te verwijderen door te pipetten, houd je de pipetpunt voorzichtig boven de hoek van de zaaikamer terwijl je het medium optrekt. Maak geen direct contact met de agarose-microschimmel om te voorkomen dat de microwells worden verstoord.
       OPMERKING: Celzaaikamers moeten zo droog mogelijk zijn, zodat microwells zichtbaar zijn met het oog, maar de buitenkant van de micromallen moet nog steeds omgeven zijn door ovariumorganoïde media (Figuur 5Aiii).
11. Doseer 75 μL van de celsuspensie (d.w.z. 2,5 × 10⁵ cellen) direct in de celzaaikamer van elke agarose-microschimmel en voorkom het creëren van bellen (Figuur 5Bi). Stuur de 24-put plaat terug naar de broedmachine.
12. Voeg één tot twee uur na celzaaien extra 250 μL verwarmd ovariumorganoïde materiaal toe rond de buitenkant van agarose-microschimmels, waarbij je voorzichtig bent om de zaaikamers niet te verstoren (Figuur 5Bii).
    OPMERKING: Primaire ovariumsomatische cellen zouden binnen 1–24 uur na het zaaien moeten beginnen met samenvoegen in agarose-microschimmels (Figuur 5Biii).
13. Vervang het medium rondom de agarose-micromallen door 750 μL verse ovariumorganoïde media de dag na celzaaiden en vervolgens om de dag gedurende de cultuur.
    1. Om het medium te vervangen, houd je de plaat iets schuin om het gebruikte medium rondom de agarose-micromallen te verwijderen. Verwijder geen media uit de zaaikamers van de cel. Pipetteer verse media voorzichtig richting de wand van de put om te voorkomen dat de zaaikamers van de cel worden verstoord.
       OPMERKING: Geconditioneerde media van mediawisselingen kunnen worden opgeslagen en opgeslagen bij -80 °C voor de analyse van organoïde afgescheiden factoren. Zodra organoïden zijn gevormd (1–3 dagen na celzaaien), kunnen media worden vervangen door media met recombinante eiwitten, remmers, enzovoort, om de effecten van verschillende behandelingen op de functie van organoïden te onderzoeken of voor het testen van verbindingen.

Figuur 5: Schema van de somatische organoïde generatie van de eierstokken. (A) Representatieve beelden van (i) het overbrengen van agarose-micromallen naar de kweekplaat met Graefe-tang, (ii) het evenwicht van agarose-micromallen in ovariumorganoïde media, en (iii) het verwijderen van media uit celzaaikamers. Pijl in Aiii geeft een lege celzaaikamer aan. (B) Representatieve beelden van (i,ii) het zaaien van cellen in agarose-micromallen en (iii) een doorgelatene lichtscan van een agarose-micromal met zich samenvoegende ovariumsomatische cellen. Schaalbalk (Biii): 2500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Gebruik van organoïden voor downstream toepassingen

OPMERKING: Organoïden kunnen worden ingezet voor diverse downstream toepassingen, waaronder histologie, moleculaire biologie (bijv. RNA/eiwitanalyses), conditioneringsmedia-analyse en co-cultuur.

1. Histologie
   OPMERKING: Organoïden kunnen worden verwerkt voor histologische eindpunten zonder verwijdering uit de agarose-micromallen. In feite werken organoïden binnen agarose-micromallen vergelijkbaar met weefselmicroarrays, waardoor een hoog-doorzettingshistologische beoordeling van verschillende, consistent gespreide organoïden tegelijk mogelijk is.
   1. Los 1,5% (w/v) steriele agarose op in PBS door te koken.
   2. Na de kweek van ovariale somatische organoïden houd je de plaat schuin en verwijder je het medium rondom de agarose-micromallen.
   3. Verwijder onder een dissectiemicroscoop het medium uit de zaaikamers door voorzichtig een pipetpunt boven de hoek van elke celzaaikamer te laten zweven en het medium voorzichtig op te trekken zonder de organoïden te verstoren of de microschimmel zelf te verstoren.
   4. Pipetteer voorzichtig 100–125 μL vloeibare 1,5% agarose afgekoeld tot ongeveer 50 °C in de hoek van elke zaaikamer om de zaaikamers te vullen en af te sluiten, waarbij de organoïden niet worden verstoord (Figuur 6Ai).
   5. Laat de agarose 2–3 minuten bij kamertemperatuur stollen.
   6. Voeg 750 μL gemodificeerde Davidson's of 4% paraformaldehyde toe aan elke put en fixeer de organoïden in de verzegelde agarose-micromallen 's nachts bij 4 °C.
   7. Na fixatie verwijder je het fixatiemiddel en was je de agarose-micromallen met 70% ethanol.
      OPMERKING: Micromallen kunnen worden bewaard in 70% ethanol bij 4 °C tot weefselverwerking (uitdroging, clearing en waxinfiltratie). Houd tijdens de weefselverwerking de oriëntatie van de agarose-micromallen bij.
   8. Na weefselverwerking worden de agarose-micromallen in paraffine ingebed, zodat de micromallen plat zijn binnen de paraffineblokken en de onderkanten van de micromallen als eerste worden doorgesneden (Figuur 6Aii).
   9. Paraffine blokken op 5 μm en plaatsen de weefselsecties op geladen microscoopglaasjes.
      OPMERKING: De aanwezigheid van microwells kan met het oog worden waargenomen tijdens het doorsnijden, zowel in weefseldoorsneden als in paraffineblokken (Figuur 6Aiii,iv). De aanwezigheid van organoïden in microschimmelsecties kan worden geverifieerd door gesneden preparaten onder een microscoop te onderzoeken (Figuur 6Av). In plaats van 2–3 opeenvolgende secties op dezelfde dia te plaatsen, verhoogt het plaatsen van 2–3 secties die elk 50 μm uit elkaar liggen (d.w.z. elke 10e^sectie) op één dia de kans dat de meeste organoïden in ten minste één sectie op elke dia worden weergegeven. Organoïden worden consequent in weefselsecties geplaatst, wat het gemak van beeldvorming na histologische kleuring vergroot (Figuur 6Avi).
   10. Laat de dia's een nacht in de oven drogen op 37 °C.
   11. Ga verder met histologische of immunohistochemische kleuring of bewaar preparaten op kamertemperatuur¹⁹.
2. Organoïden oogsten voor moleculaire toepassingen
   OPMERKING: Na kweek kunnen organoïden uit de agarose-micromallen worden verwijderd en verwerkt voor diverse downstream moleculaire biologische toepassingen, waaronder RNA- of eiwitextractie om gen- of eiwitexpressie te beoordelen.
   1. Houd de plaat met de agarose-micromallen onder een lichte hoek en verwijder het medium rondom de agarose-micromallen door te pipetteren.
   2. Voeg 750 μL PBS op kamertemperatuur toe aan de putten met de agarose-micromallen.
   3. Gebruik Graefe-tang om de agarose-micromallen om de organoïden in het omliggende PBS te laten stromen en te bewegen. Controleer de vrijgave van de organoïden uit de agarose-micromallen onder een microscoop.
   4. Verwijder de lege agarose-micromallen met Graefe-tang en breng de PBS met de organoïden over in microcentrifugebuizen door te pipetteren.
   5. Pellet de organoïden door centrifugatie op 10.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Verwijder het supernatant door aspiratie en ga over tot RNA- of eiwitextractie. Of vries de celpellet snel in en bewaar het bij -80 °C¹⁹.
3. Bewaren organoïde geconditioneerde media voor analyse
   OPMERKING: Geconditioneerde media van organoïden kunnen gedurende de hele cultuur worden bewaard voor de analyse van organoïde afgescheiden factoren, waaronder hormonen, cytokines en groeifactoren. Representatieve resultaten van de analyse van cytokines in organoïde geconditioneerde media zijn weergegeven in Figuur 7A.
   1. Houd de plaat met de agarose-micromallen iets schuin en verwijder het geconditioneerde medium rondom de micromallen door te pipetteren. Verwijder geen media uit de zaaikamers van de cel om organoïden niet te verstoren.
   2. Breng het geconditioneerde medium over in microcentrifugebuizen en ga over tot mediaanalyse of flitsbevriezing en bewaar bij -80 °C^19,22.
      OPMERKING: Centrifugeer optioneel het geconditioneerde medium op 10.000 × g gedurende 5 minuten om dode cellen of vuil te pelletten. Breng het supernatant over naar nieuwe microcentrifugebuizen voorafgaand aan media-analyse of opslag.
4. Organoïde co-cultuur
   OPMERKING: Ovariumsomatische organoïden kunnen op verschillende manieren worden gekweekt met andere cellen en weefsels. Representatieve resultaten van organoïde co-kweek met eierstokkankercellen en follikels, met de methoden beschreven in stappen 5.4.1 en 5.4.3, worden getoond in Figuur 7B,C.
   1. Om organoïden te genereren met een combinatie van primaire muis-ovariumcellen en andere celtypen om de effecten van directe cel-celinteracties te onderzoeken, volg de stappen 5.4.1.1–5.4.1.4.
      1. Volg stappen 4.1–4.9 om primaire somatische ovariumcellen na 2D-kweek van de nacht te wassen, de cellen uit 2D-kweek te oogsten met 0,05% trypsine, pellet, tellen, en de cellen opnieuw te suspenderen in ovariumorganoïde media met een dichtheid van 2,5 × 10⁵ levende cellen per 75 μL media.
      2. Als het andere celtype van interesse hechtend is, oogst je de cellen uit een 2D-cultuur. Tel de cellen, pellet ze door centrifugatie en sussen ze opnieuw in ovariumorganoïde media met een dichtheid van 2,5 × 10⁵ levende cellen per 75 μL medium.
      3. Combineer de suspensie van primaire ovariumsomatische cellen met de suspensie van het andere celtype dat geïnteresseerd is, in een bekende verhouding.
      4. Volg stappen 4.10–4.13 om de resulterende celsuspensie in agarose-micromallen te zaaien en organoïden te kweken.
   2. Om agarose-micromallen met gevormde organoïden over te brengen naar 24-wellplaten met andere cellen of organoïden, volgt u stappen 5.4.2.1–5.4.2.4.
      OPMERKING: Om de effecten van organoïde-afgeleide afscheidingsfactoren op andere celtypen en omgekeerd te beoordelen, kunnen gevormde organoïden in de agarose-micromallen blijven, en kunnen hele agarose-micromallen worden overgebracht naar een 24-wellplaat met andere cellen of organoïden. Deze co-kweekmethoden kunnen worden gebruikt wanneer ovariumorganoïde media worden gebruikt om zowel cel- als weefseltypen te kweken.
      1. Verwarm ovariumorganoïde tot 37 °C in een waterbad.
      2. Houd de plaat met de agarose-micromallen schuin en verwijder het medium rondom de agarose-micromallen door te pipetten.
      3. Met Graefe-tang wordt de micromalls zorgvuldig overgebracht in 24-wellplaten met andere cellen of organoïden.
      4. Voeg 750 μL verse eierstokorganoïde media toe om de agarose-micromallen te omringen.
   3. Om gevormde organoïden uit de agarose-micromallen te verwijderen en over te brengen naar nieuwe agarose-micromallen, volg stap 5.4.3.1–5.4.3.13.
      OPMERKING: Als organoïde media van eierstokken niet het gewenste medium zijn voor co-kweekexperimenten, vormt het paradigma beschreven in stap 5.4.2 de uitdaging van significante mediaoverdracht, aangezien agarose-micromallen verzadigd zijn met organoïde media van eierstokken. Gevormde organoïden (1-3 dagen na de eerste celzaaiing) kunnen uit hun agarose-micromallen worden verplaatst en overgebracht naar nieuwe agarose-micromallen voor extra kweek of co-cultuur om mediaoverdracht te voorkomen.
      1. Verwarm het gewenste medium voor co-teelt tot 37 °C in een waterbad.
         OPMERKING: DMEM-, αMEM- en F12-gebaseerde media zijn met succes gebruikt voor co-kweekexperimenten met ovariumsomatische organoïden.
      2. Met behulp van Graefe-tangen wordt de nieuwe agarose-micromallen van PBS +1% PS zorgvuldig overgebracht naar putten van een 24-wellplaat met andere cellen of organoïden voor co-cultuur.
      3. Zorg ervoor dat micromallen volledig in media worden ondergedompeld, voeg indien nodig extra gewenst medium toe voor co-cultuur, en houd de micromallen en media minstens 30 minuten in evenwicht in een incubator (bevochtigde omgeving, 37 °C met 5% CO₂).
      4. Houd de plaat met de agarose-micromallen met gevormde organoïden onder een lichte hoek en verwijder het medium rondom de agarose-micromallen door te pipetteren.
      5. Voeg het gewenste medium voor co-cultuur toe rondom de agarose-micromallen met de gevormde organoïden.
      6. Gebruik Graefe-tangen om de agarose-micromallen om te keren en te bewegen, zodat de organoïden in het omliggende medium worden vrijgegeven. Controleer de afgifte van organoïden uit de agarose-micromallen onder een microscoop.
         OPMERKING: Als primaire somatische cellen van de eierstokken niet adequaat zijn geaggregeerd, kunnen organoïden niet intact blijven wanneer ze uit agarose-micromallen worden verwijderd. De organoïde assemblage kan 1–3 dagen duren, afhankelijk van de stam en leeftijd van de muizen waaruit de ovariumsomatische cellen zijn geïsoleerd.
      7. Verwijder de lege agarose-micromallen met Graefe-tang en breng het medium met de organoïden over in microcentrifugebuizen door te pipetteren.
      8. Centrifugeer de organoïden op 300 × g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
      9. Verwijder onder een dissectiemicroscoop het supernatant door pipetten, waarbij 50–75 μL medium met organoïden overblijft.
      10. Verwijder de gebalanceerde micromallen uit de incubator en zorg ervoor dat de micromallen zo zijn georiënteerd dat de zaaikamer van de cel naar boven wijst.
      11. Verwijder het medium uit de zaaikamers van de cel met Graefe-tang of door te pipetteren.
          OPMERKING: putten mogen niet meer dan 500 μL media bevatten zodat de zaaikamers van micromallen kunnen worden geleegd.
      12. Breng de organoïden direct over naar de celzaaikamer van elke nieuwe agarose-microschimmel door te pipetten. Stuur de 24-put plaat terug naar de broedmachine.
      13. Voeg na 1–2 uur nog eens 250 μL van het gewenste medium toe aan de buitenkant van agarose-micromallen, waarbij men voorzichtig is om de zaaikamers van de cel niet te verstoren.

Figuur 6: Belangrijke ovariumcellen zijn bewaard gebleven in ovariumsomatische organoïden. (A) Representatieve afbeeldingen van (i) het afsluiten van een microschimmel met agarose aan het einde van de kweek, (ii) een ongesneden microschimmel, en (iii) een gesneden micromal ingebed in een paraffineblok. Microwells kunnen worden weergegeven in (iv) gemonteerde secties, en de aanwezigheid van organoïden in gesneden micromallen kan (v) onder een microscoop worden bevestigd voorafgaand aan (vi) histologische kleuring. (B) Representatieve beelden van muis-ovariumweefseldoorsneden en ovarium-somatische organoïde doorsneden na immunohistochemische kleuring met antilichamen tegen Vimentin, F4/80, Foxl2 en 3β-HSD. Schaalbalken = 20 μm. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine. Deze figuur is met toestemming aangepast van Dipali et ^al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Co-kweek van ovariumsomatische organoïden met follikels en eierstokkankercellen. (A) Organoïde cytokinesecretie werd gemeten per agarose-microschimmel op dag 5 van de kweek en werd genormaliseerd naar geconditioneerde media van agarose-microschimmels zonder organoïden. N = 4 agarose micromallen. (B) Vertegenwoordigende lichtbeelden van eierstokfollikels op dag 0, 4 en 8 van kweek met of zonder (controle)organoïden en (i) een schema van het co-cultuurparadigma. Schaalbalken = 400 μm. Kwantificering van (ii) follikeloverleving en (iii) groei over 8 dagen kweek met of zonder (controle) organoïden. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Sommige foutbalken zijn te klein om te visualiseren. N = 56 follikels per groep. **P < 0,01. (C) Representatieve doorgezonden licht- (boven) en fluorescentiebeelden (onder) van primaire ovariumsomatische cellen, gekweekt in een verhouding van 10:1 met roodfluorescerend eiwitgetagd eierstokkankercellen (OVCAR8-RFP) in organoïden op dag 1, 3 en 5 van de kweek. Schaalbalken = 400 μm. Afkorting: RFP = rood fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Tips voor probleemoplossing

1. Probleem 1: Het aantal geïsoleerde primaire ovariumcellen is lager dan verwacht.
   OPMERKING: Als eierstokweefselfragmenten consequent kleiner zijn dan 1 mm of niet zichtbaar zijn voor het oog na enzymatische vertering, kan het aantal geïsoleerde cellen laag zijn vanwege verminderde levensvatbaarheid door oververtering. Als eierstokweefselfragmenten groter zijn dan 1 mm na enzymatische vertering, kan het aantal geïsoleerde cellen laag zijn door onvoldoende vertering van het eierstokweefsel.
   1. Als eierstokweefselfragmenten groter zijn dan 1 mm na enzymatische vertering, volg dan stappen 6.1.1.1–6.1.1.2.
      1. Bevestig dat Collagenase IV en DNase I binnen hun aanbevolen houdbaarheid vallen en geen enzymatische activiteit hebben verloren door onjuiste opslag of, in het geval van DNase I, herhaalde vries-dooicycli.
      2. Verhoog de hoeveelheid herhaalde pipettie van het eierstokweefsel, verklein de boring van de p1000-tip als deze is gesneden om de opening breder te maken, en/of verleng de incubatietijd in EM.
   2. Als eierstokweefselfragmenten na enzymatische vertering consequent veel kleiner dan 1 mm zijn, verminder dan de hoeveelheid herhaalde pipetten van het eierstokweefsel, vergroot de boring van de p1000-tip door te snijden om de opening breder te maken, en/of verminder de totale incubatie in EM.
2. Probleem 2: Meer dan ~25% van de gegoten agarose-micromallen heeft defecten
   1. Controleer of de siliconen gietsel vrij is van achtergebleven agarose en vuil. Indien nodig, was de siliconen gipsafgietsels in PBS en steriliseer ze opnieuw door autoclaven. Verwarm indien nodig de 1% agarose die voor het gieten is gebruikt, omdat agarose die aan het stollen is mogelijk niet gelijkmatig gevuld is en/of bellen veroorzaakt.
   2. Zodra de agarose in de siliconengietsel is gepipetteerd, laat deze volledig stollen, omdat het voortijdig verwijderen van de agarose-micromal uit de gietsel kan leiden tot verstoorde microputten.
   3. Controleer of siliconengietsels niet ondergevuld zijn, omdat dit de structurele integriteit van de agarose-micromal kan verminderen, wat schade kan veroorzaken wanneer het siliconen wordt gebogen om de agarose-micromal te verwijderen.
   4. Daarnaast raadt de fabrikant van de siliconen gipsen aan om ze niet meer dan 12 keer te autoclaven. Als het siliconenafgietsel te veel is gesteriliseerd, vervang het dan.
3. Probleem 3: Organoïden ontstaan in meer dan 10% van de microwells
   1. Controleer of de siliconenafgietsels niet overvol zijn bij het gieten van de agarose-micromallen, omdat dit kan leiden tot een onregelmatige verdeling van cellen in de microwells, waardoor de centrale microwells in de agarose-micromal worden bevoordeeld boven de buitenste microwells.
   2. Vermijd het creëren van bellen wanneer je de celsuspensie in de zaaikamer van de agarose-micromallen geeft, omdat bellen de verdeling van cellen in microwells kunnen verstoren.
   3. Indien nodig, begin met meer dan 75 μL celsuspensie (met een dichtheid van 3,33 × 10^{6 levende} cellen per 1 mL) per micromal om te voorkomen dat er belletjes ontstaan door onvoldoende volume in de pipettip.
   4. Verhoog het interval tussen celzaaien en het toevoegen van ovariumorganoïde media aan de buitenkant van de agarose-microschimmel om voldoende tijd te garanderen voor cellen om zich in microwells te vestigen.

Resultaten

Om de cellulaire samenstelling van ovariumsomatische organoïden te bepalen, voerden we na 6 dagen kweek immunohistochemie uit van organoïde weefseldoorsneden met antilichamen tegen belangrijke ovariumceltypen. Organoïden bevatten vimentine-positieve fibroblasten, F4/80-positieve macrofagen, evenals steroïdogene celpopulaties (Figuur 6B)¹⁹. We gebruikten een antilichaam tegen Foxl2 om granulosa- en granulosa-luteïnecellen te markeren, ...

Discussie

Dit artikel beschrijft methoden om primaire somatische cellen van de eierstok van de muis te isoleren uit een stroma-verrijkt deel van de eierstok, op een manier die de heterogeniteit van het somatische compartiment van de eierstok behoudt. Primaire somatische cellen van de eierstokken van de muis kunnen worden gekweekt in een 2D-monolaag of worden gebruikt om somatische organoïden van de eierstokken te genereren met behulp van scaffold-vrije, agarose-micromalls. Agarose-micromallen beva...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.2 μm, Polyethersulfone syringe filter	Corning	431229
1.5 mL microcentrifuge tubes	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL glass beaker	Fisherbrand	FB100100
100 mm Petri dishes	Corning	351029
15 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	339651
24-well plates (TC-treated)	Corning	353047
28-gauge insulin needles	Exel International	26027
35 mm Petri dishes	Corning	351008
3β-HSD antibody	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	1574100
40 µm cell strainer	Corning	431750
45 mm watch glass	Electron Microscopy Sciences	7054345
50 mL concial tubes	ThermoFisher Scientific	339652
60 mL sterile syringe	Air-Tite	ML60
60 mm TC-treated plates	Corning	353037
6-well plates (TC-treated)	Corning	353046
Agarose	Hoefer	GR140-500	Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 °C
Autoclave sterilization pouch	Fisherbrand	01-812-55
Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Bluing reagent	Fisherbrand	23-245681
Centrifuge with swing bucket rotor for 50 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Class II biosafety cabinet	The Baker Company	SG403A
Cleaved Caspase-3 (CC3) antibody	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
Collagenase, Type IV, powder	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Dissecting microscissors	World Precision Instruments	WPI-14003
Dissecting scissors	World Precision Instruments	WPI-15922
Dissection microscope	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosin	Fisherbrand	23-314631
F4/80 antibody	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Fine-tipped dissecting forceps	World Precision Instruments	WPI-14098
FOXL2 antibody	Abcam	ab246511	1:200
Graefe Forceps	Fine Science Tools	1105010
Hematoxylin	EK Industries	EKI 47971GL
Hemocytometer	MedOne	DHCN015
Imaging System	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Basal medium, Supplements 1 and 2
Laminar flow hood	IVFtech	IVFtech sterile workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Microscope slides	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silicone casts for agarose micromolds
Modified Davidson's Fixative	Electron Microscopy Sciences	6413350
OVCAR8-RFP cells			Gift from Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicago
Penicillin-Streptomycin	Millipore Sigma	P4333-100ML
Picrosirius Red staining solution	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Tabletop centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Vimentin antibody	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, GlutaMAX Supplement, no nucleosides	Gibco, Fisher Scientific	32561102