Onderzoeksvoortgang naar strategieën voor efficiëntiebeoordeling van DNA-schade

Xiao Liu; Yiwei Zhu; Ling Li; Siyu Hang; Sipei Wu; Song-Bai Liu

doi:10.3791/71031

Reviewartikel

Onderzoeksvoortgang naar strategieën voor efficiëntiebeoordeling van DNA-schade

DOI:

10.3791/71031

⸱

23 juni 2026

Xiao Liu^*¹^,² , Yiwei Zhu^*³ , Ling Li¹^,² , Siyu Hang¹ , Sipei Wu⁴ , Song-Bai Liu¹^,²

¹Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, ²School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, ³Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, ⁴Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-schadeherstel-efficiëntie-assays kunnen grofweg worden ingedeeld in drie groepen: celgebaseerde functionele assays, in vitro biochemische assays en moleculaire marker-assays. Deze benaderingen maken kwalitatieve of kwantitatieve evaluatie van de herstelefficiëntie mogelijk over meerdere DNA-schadeherstelroutes.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellulair genomisch DNA wordt continu blootgesteld aan endogene en exogene factoren die verschillende vormen van DNA-schade veroorzaken. In zoogdiercellen kan de dagelijkse last van DNA-schade oplopen tot 10,⁴–10^laesies per cel. DNA-schade die aanhoudt tot in de S-fase kan leiden tot mutaties. Wanneer dergelijke mutaties optreden in oncogenen, tumorsuppressorgenen of genen die betrokken zijn bij celproliferatie, kunnen ze cellulaire transformatie en carcinogenese bevorderen. Daarom speelt DNA-schadeherstel een cruciale rol bij het behouden van genomische stabiliteit en het voorkomen van kankerontwikkeling. De beoordeling van de DNA-reparatiecapaciteit wordt het beste bereikt door de functionele activiteit van DNA-reparatiesystemen te meten. DNA-schadeherstelroutes en hun herstelefficiëntie zijn zeer relevant voor de ontwikkeling van chemotherapeutische geneesmiddelen, validatie van genfunctie en kankertherapie. Daarom heeft onderzoek naar de herstelefficiëntie van individuele DNA-schadeherstelroutes een belangrijke theoretische en praktische betekenis. Deze review vat de belangrijkste DNA-schadeherstelroutes samen, de methoden die worden gebruikt om de herstelefficiëntie te beoordelen, en de voordelen en beperkingen van deze benaderingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het DNA-schadeherstelsysteem is een cruciaal cellulair verdedigingsmechanisme dat de genomische stabiliteit handhaaft door de frequentie van mutaties te verminderen en carcinogenese¹ te onderdrukken. Verschillende soorten DNA-schade worden gerepareerd via verschillende maar onderling verbonden herstelroutes². Zo worden basenmismatches die tijdens DNA-replicatie worden gegenereerd gecorrigeerd door mismatch repair (MMR), terwijl chemisch gemodificeerde basen, zoals alkyleerde basen, voornamelijk worden hersteld door base excision repair (BER)³. Ultraviolet (UV)-geïnduceerde 6-4 fotoproducten en omvangrijke nucleotide-adducten die door bepaalde chemische agentia worden gegenereerd, worden verwijderd via nucleotide excisiereparatie (NER). Interstrand crosslink (ICL) schade wordt hersteld door gecoördineerde activiteiten van eiwitten die geassocieerd zijn met de Fanconi-anemieroute⁴. Enkelstrengbreuken (SSB's) worden gerepareerd via het enkelstrengige breukherstel (SSBR)-pad, terwijl dubbelstrengbreuken (DSB's) voornamelijk worden gerepareerd door niet-homoloog eindverbindingen (NHEJ) of homologe recombinatie (HR). In de meeste gevallen worden complexe DNA-laesies opgelost door gecoördineerde interacties tussen meerdere DNA-reparatieroutes⁵.

De beoordeling van DNA-schade en reparatie-efficiëntie in cellen is doorgaans gebaseerd op een combinatie van experimentele benaderingen, waaronder de Comet assay, immunofluorescentie (IF), Western blotting (WB), gastheercelreactivatie (HCR) en plasmide-gebaseerde reparatieassays. Deze methoden evalueren DNA-schade en -reparatie door DNA-strengbreuken, DNA-schademarkers en de expressie of lokalisatie van herstel-geassocieerde eiwitten te detecteren⁶. Nauwkeurige kwantificering van cellulaire reparatie-efficiëntie vereist echter doorgaans dynamische, uitdagingsgebaseerde assays. Bij deze benaderingen worden specifieke DNA-laesies experimenteel geïnduceerd en worden cellen op opeenvolgende tijdstippen bemonsterd om de vorming en het verwijderen van schadesignalen te monitoren. De vergelijking van restschadeniveaus in de tijd ten opzichte van de initiële schadelast maakt kwantitatieve beoordeling van de reparatiekinetiek en de functionaliteit van het pad mogelijk.

Om systematisch de kenmerken en toepassingen van momenteel beschikbare DNA-schadeherstel-efficiëntietests te vergelijken, vat deze review belangrijke detectiemethoden samen volgens vijf parameters: specificiteit van laesies/substraat, analytische resolutie, gevoeligheid, kwantitatieve capaciteit en instrumentatievereisten (Tabel 1). Deze review heeft als doel een praktische methodologische gids te bieden voor het selecteren van geschikte benaderingen om DNA-schadeherstelroutes te onderzoeken in basis, translationeel en klinisch onderzoek.

Detectiemethode	Lesie/substraatspecificiteit	Analytische resolutie	Gevoeligheid/detectiedrempel	Kwantitatief versus kwalitatief resultaat	Instrumentatievereisten
Westelijk vlek	CPD's, 6-4PP's, herstellende eiwitten (bijv. MGMT, RAD51)	Bevolking	Gematigd	Semi-kwantitatief	Eiwitelektroforese, membraanoverdracht, chemiluminescentiebeeldvormingssysteem
Immunofluorescentie	CPD's, DSB-focussen (bijv. γ-H2AX, RAD51)	Enkelcel	Gematigd	Semi-kwantitatief	Fluorescentiemicroscoop
HPLC-MS/MS	CPD's, 6-4PP's, oxidatieve en alkylatieve basisschade	Populatie/In vitro	Extreem hoog	Kwantitatief	HPLC-MS/MS
MGMT-enzymactiviteitsassay	O⁶-meG alkylatieschade	Populatie/In vitro	Hoog	Kwantitatief	Microplaatlezer
Komeetassay	SSB's, DSB's, geoxideerde basen (met FPG/OGG-voorbehandeling)	Enkelcel	Hoog	Kwantitatief	Fluorescentiemicroscoop/elektroforesesysteem
Incisie-assay	AP-plaatsen, NER-incisies, BER-incisies	Populatie/In vitro	Hoog	Kwantitatief	Gelbeeldvorming, radiolabeling/fluorescentiedetectie
Heropgericht reparatiesysteem	Locatie-specifieke basisschade, AP-locaties, strandbreuken	In vitro	Hoog	Kwantitatief	Gelelektroforese, fluorescentie/MS-detectie
Plasmide-gebaseerde reparatie-assay	Locatie-specifieke schade	Bevolking	Gematigd	Kwantitatief	Microplaatlezer, flowcytometer, kolonietelling
Verslaggever-assay	Locatie-specifieke schade; BER, NER, HR, NHEJ, MMR	Bevolking	Hoog	Kwantitatief	Microplaatlezer, flowcytometer, fluorescentiemicroscoop
HCR/FM-HCR	UV-schade, platina crosslinks, site-specifieke schade	Bevolking	Hoog	Kwantitatief	Flowcytometer, fluorescentie/chemiluminescentiedetector
RADD	Breedspectrum-DNA-schade	Enkelcel	Extreem hoog	Kwantitatief	Enkelmolecuul fluorescentiemicroscoop
qPCR	UV-schade, ketenblokkerende laesies	Bevolking	Gematigd	Kwantitatief	Real-time qPCR-instrument
MSI-detectie	MMR-deficiëntie-geassocieerde microsatellietinstabiliteit	Bevolking	Gematigd	Kwalitatief	PCR-instrument/capillaire elektroforese
DR-GFP/EJ5-GFP	HR- en NHEJ-gemedieerde DSB-reparatie	Bevolking	Hoog	Kwantitatief	Flowcytometer/fluorescentiemicroscoop
ZEGEN/GELUKZALIGHEID	Genoombrede DSB-mapping	Enkelcel	Extreem hoog	Kwantitatief	Sequencer met hoge doorvoer
iPOND	DDR-eiwitten bij replicatievorken/TLS-geassocieerde reparatie	Replicatievork/proteoom	Hoog	Semi-kwantitatief	Massaspectrometrie/sequencingplatform

Tabel 1: Systematische vergelijking van methoden voor het detecteren van efficiëntie van DNA-schadeherstel. Vergelijking van veelgebruikte methoden om de efficiëntie van DNA-schade te herstellen over meerdere reparatieroutes heen. De tabel vat de specificiteit van laesies of substraten, analytische resolutie, gevoeligheid, kwantitatieve capaciteit en instrumentatievereisten voor elke assay samen, inclusief biochemische, moleculaire en celgebaseerde benaderingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Review en perspectief

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Directe reparatie (DR)

Direct herstel (DR) is de eenvoudigste vorm van DNA-reparatie en verwijst naar het directe herstel van beschadigd DNA zonder het verwijderen van basen of nucleotiden⁷. DR herstelt voornamelijk twee hoofdtypen DNA-laesies. De eerste is schade door cyclobutaan pyrimidine dimeer (CPD) veroorzaakt door ultraviolet (UV) straling. In veel organismen herkent en bindt fotolyase pyrimidine-dimeren. Bij blootstelling aan zichtbaar licht wordt fotolyase geactiveerd, keert direct DNA-schade om en dissocieert vervolgens van het DNA-molecuul. Dit fotoreactivatiemechanisme is vooral belangrijk bij planten en lagere organismen. Placenta-zoogdieren, inclusief mensen, missen echter functionele fotolyase en kunnen daarom geen fotoreactivatie uitvoeren. Daardoor wordt UV-geïnduceerde CPD-schade in menselijke cellen voornamelijk hersteld door nucleotide excisieherstel (NER)⁸.

Het tweede grote type schade dat via DR wordt gerepareerd, is door alkylatie veroorzaakte basisschade. Herstel wordt gemedieerd door O 6-alkylguanine-DNA alkyltransferase (AGT), ook bekend als O^{6-methylguanine-DNA} methyltransferase (MGMT). Dit enzym brengt alkylgroepen van^de O6-positie van guanineresiduen over op zichzelf, waardoor de beschadigde DNA-basis direct wordt hersteld.

Methoden voor het detecteren van DR-efficiëntie

Detectie van reparatie-efficiëntie voor CPD-schade veroorzaakt door ultraviolette (UV) straling
1. Western blot (WB) test voor het detecteren van veranderingen in CPD-inhoud
  Met antilichamen die specifiek zijn voor CPD's kunnen onderzoekers veranderingen in CPD-abundantie op verschillende tijdstippen na UV-bestraling detecteren en de herstelefficiëntie afleiden uit het restschadeniveau. Een hogere reparatie-efficiëntie komt overeen met snellere verwijdering van CPD's. WB-gebaseerde CPD-detectie is een klassieke en effectieve benadering om DNA-reparatieactiviteit te beoordelen; er bestaan echter verschillende beperkingen. Ten eerste meet de assay het gemiddelde schadeniveau over celpopulaties en mist daarom enkelcelresolutie. Ten tweede, en belangrijker, kan de assay geen onderscheid maken tussen reparatiepaden. Omdat CPD's in menselijke cellen voornamelijk via NER worden hersteld, kan WB-analyse alleen niet onderscheiden of waargenomen reparatieactiviteit fotolyase-gemedieerde reparatie of NER-activiteit weerspiegelt zonder aanvullende experimentele context.
2. Immunofluorescentie (IF) positionerende dynamische veranderingen in de CPD-focus
  Cellen die worden blootgesteld aan UV-bestraling en fotoreparatiebehandeling kunnen worden gekleurd met CPD-specifieke antilichamen, en veranderingen in nucleaire CPD-foci kunnen worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Kwantitatieve analyse van CPD-focivorming en -clearance maakt het mogelijk om DNA-reparatiecapaciteit te beoordelen op zowel populatie- als enkelcellig niveau. Het tempo van het verdwijnen van CPD-focussen weerspiegelt direct de reparatie-efficiëntie. IF biedt ruimtelijke en temporele visualisatie van reparatiedynamiek binnen individuele cellen en maakt detectie van cel-tot-cel heterogeniteit mogelijk. Fluorescentiesignalen zijn echter gevoelig voor afkoeling, en kwantitatieve analyse is vaak gebaseerd op handmatig tellen, wat subjectiviteit introduceert. In zoogdiercellen zonder fotoreactivatie, weerspiegelt deze methode voornamelijk de door NER gemedieerde reparatie-efficiëntie.
3. Hoogwaardige vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) voor kwantitatieve CPD-analyse
  Geëxtraheerd DNA wordt enzymatisch verteerd tot nucleosiden, waarna CPD's worden gescheiden van normale nucleosiden door middel van hoogpresterende vloeistofchromatografie (HPLC). Kwantitatieve analyse wordt vervolgens uitgevoerd met behulp van tandemmassaspectrometrie (MS/MS). De reparatie-efficiëntie wordt bepaald door de CPD-overvloed voor en na reparatie^{te vergelijken 9}. HPLC-MS/MS biedt een extreem hoge specificiteit en picomolaire gevoeligheid; de methode vereist echter dure instrumentatie, complexe monstervoorbereiding en weerspiegelt niet de in situ reparatietoestand van intacte cellen. In menselijke celmonsters weerspiegelt het gemeten herstelresultaat voornamelijk de activiteit van de NER.
Effectiviteit van DNA-basenschadeherstel geïnduceerd door alkylerende middelen
1. MGMT Enzyme Activiteitstest
  De herstelefficiëntie van DNA-schade veroorzaakt door alkylerende middelen wordt vaak geëvalueerd door MGMT-activiteit¹⁰ te meten. Radioactief gelabelde gemethyleerde DNA-substraten worden gebruikt om de overdracht van methylgroepen van beschadigd DNA naar het MGMT-eiwit te monitoren, waardoor kwantitatieve beoordeling van de herstelefficiëntie mogelijk is.
2. Genanalyse voor het detecteren van O^6-meG reparatie-efficiëntie
  Verslaggeverplasmiden met O 6-methylguanine (O^6-meG) laesies kunnen worden geconstrueerd om de herstelefficiëntie te beoordelen. De geïntroduceerde laesie onderdrukt de genexpressie van de verslaggever totdat MGMT-gemedieerde reparatie de activiteit van de verslaggever herstelt. De herstelefficiëntie wordt vervolgens gekwantificeerd door het meten van de genexpressieniveaus van de reporter. Reportergenassays bieden intuïtieve en kwantitatieve evaluatie van de herstelactiviteit in levende cellen¹¹. Deze assays vereisen echter de constructie van laesie-specifieke vectoren en omvatten relatief lange experimentele cycli¹².
Schadeherstelefficiëntie bij detectie van kettingbreuk
1. Komeettoets
  De Comet-assay, ook bekend als single-cell gel elektroforese (SCGE), is een gevoelige methode om DNA-strengbreuken op enkelcelniveau te detecteren. Beschadigde DNA-fragmenten migreren tijdens elektroforese uit de kern en vormen kometachtige staarten, terwijl intact DNA geconcentreerd blijft in het nucleaire gebied. Parameters zoals de lengte van de komeetstaart, het DNA-gehalte van de staart en het staartmoment kunnen worden gekwantificeerd met behulp van fluorescentiemicroscopie- en beeldanalysesoftware. Deze meetmethoden maken kwantitatieve evaluatie van de ernst van DNA-strengbreuken mogelijk. Door komeetprofielen direct na DNA-beschadiging te vergelijken met die verkregen na reparatie, kan de reparatie-efficiëntie worden geschat^{op 13}.
  De Comet-assay biedt verschillende voordelen, waaronder eenvoudige werking, relatief lage kosten, hoge gevoeligheid en enkelcelresolutie. Verdere verfijning van deze methode heeft geleid tot de ontwikkeling van enzym-gemodificeerde varianten en komet-gebaseerde in vitro DNA-reparatietests, die kunnen worden gebruikt om BER- en NER-activiteiten te evalueren.

2. Basisexcisie-reparatie (BER)

Base excision repair (BER) is een sterk geconserveerd DNA-reparatiepad dat voornamelijk kleine baselesies verwijdert die zijn opgestaan door oxidatie, alkylatie en deaminering¹⁴. BER deelt een aanzienlijke mechanistische overlap met enkelstrengs breukreparatie (SSBR), en bepaalde SSBR-gebeurtenissen worden beschouwd als verlengingen van BER. Volgens de reparatiepatchlengte wordt BER ingedeeld in korte-patch BER (SP-BER) en lange patch BER (LP-BER).

BER wordt geïnitieerd door DNA-glycosylasen die beschadigde basen herkennen en verwijderen door de N-glycosidische binding tussen de base en deoxyribose te splijten, waardoor apurinische/apyrimidinische (AP) plaatsen¹⁵ ontstaan. AP-endonuclease 1 (APE1) splijt vervolgens de DNA-ruggengraat aan de 5′-zijde van de AP-site, waardoor 3′-OH- en 5′-deoxyribosefosfaat (dRP) termini ontstaan. Tijdens SP-BER wordt de dRP-groep verwijderd, vult DNA-polymerase β (Polβ) de enkel-nucleotide-kloof op, en voltooit DNA-ligase III (LigIII) de ligatie.

Het herstel van door alkylatie veroorzaakte enkelstrengige breuken met 3′-geblokkeerde termini volgt een vergelijkbaar mechanisme, maar vereist extra eindverwerking. Polynucleotide-kinase 3′-fosfatase (PNKP) verwijdert eerst abnormale 3′-termini om een juiste 3′-OH-groep te genereren. Polβ vult vervolgens het ontbrekende nucleotide op, en LigIII sluit het sneetje af om de reparatie te voltooien.

Methoden voor het detecteren van BER-efficiëntie

Enzymgemodificeerde komeettest
De enzym-gemodificeerde Comet-assay breidt de standaard Comet-assay uit door laesie-specifieke reparatie-enzymen te bevatten. Deze enzymen herkennen en kloven beschadigde basen, waarbij ze anders ondetecteerbare laesies omzetten in detecteerbare strengbreuken. De resulterende intensiteit van de komeetstaart weerspiegelt het niveau van DNA-schade¹⁶˒¹⁷.
Om de efficiëntie van BER te evalueren, wordt formamidopyrimidine DNA-glycosylase (FPG) of zijn zoogdierhomoloog 8-oxoguanine DNA-glycosylase (OGG1) gebruikt om geoxideerde baseleesies om te zetten in enkelstrengbreuken, die vervolgens worden geanalyseerd met behulp van de Comet^{assay 18}.
Incisie-assay
De incisie-assay is een kernmethode in vitro voor het evalueren van BER-activiteit. DNA-substraten met AP-plaatsen worden geïncubeerd met gezuiverde enzymen of cellulaire extracten, en het aandeel gespleten DNA-substraten wordt gekwantificeerd. Deze assay weerspiegelt direct de activiteit van de APE1-gemedieerde incisie en biedt een hoge specificiteit en gevoeligheid, terwijl interferentie door de intracellulaire^{omgeving wordt} geminimaliseerd.
De incisie-assay reproduceert echter de BER-activiteit in levende cellen niet volledig omdat het de dynamische regulatie van het volledige herstelproces, inclusief laesieherkenning, basenexcisie, AP-plaatssplitsing, DNA-synthese en ligatie²⁰, niet kan beoordelen.
Heropgericht reparatiesysteem
Het gereconstitueerde herstelsysteem is een in vitro experimenteel platform dat DNA-reparatieroutes reconstrueert met behulp van gezuiverde herstelproteïnen. Dit systeem maakt gedetailleerde analyse mogelijk van de moleculaire functies en interacties van individuele reparatie-eiwitten en wordt veel gebruikt voor mechanistische studies en geneesmiddelscreening.
Om de efficiëntie van BER te evalueren, worden gezuiverde glycosylasen, AP-endonucleasen, DNA-polymerasen en ligasen sequentieel geïncubeerd met beschadigde DNA-substraten om laesieherkenning, excisie, synthese en ligatie te reconstrueren. Reparatieproducten worden geanalyseerd met gelelektroforese, fluorescentielabeling of massaspectrometrie²¹. Hoewel deze benadering sterk gecontroleerde mechanistische studies mogelijk maakt, houdt het geen rekening met chromatinestructuur of globale cellulaire regulatie van reparatieactiviteit²².
Plasmide-gebaseerde reparatie-assay
Plasmide-gebaseerde reparatieassays omvatten de introductie van plasmiden met gedefinieerde DNA-laesies in gastheercellen of incubatie met cellulaire extracten die reparatie-enzymen bevatten, gevolgd door beoordeling van de herstelefficiëntie met behulp van reporterassays, flowcytometrie of kolonievormingsanalyse²³.
Om de efficiëntie van BER te evalueren, worden plasmiden met oxidatieve DNA-schade geïncubeerd met cellulaire extracten en vervolgens omgezet in hersteldeficiënte bacteriële stammen, zoals Escherichia coli. De reparatie-efficiëntie wordt vervolgens geschat op basis van kolonievormingssnelheden.
Reporter gen-assay
Reportergenassays evalueren indirect de efficiëntie van DNA-reparatie of genregulatieactiviteit door het herstel van de genexpressie van de reporter te meten²⁴. In deze assays worden DNA-laesies of regulerende elementen opgenomen in de constructen van de verslaggever, en wordt de reparatie-efficiëntie gekwantificeerd door veranderingen in de activiteit van de melder na reparatie.
Voor BER-analyse kan een 8-oxoG laesie worden ingebracht in het coderende gebied van een luciferase-reportergen. Als de laesie niet gerepareerd blijft, wordt de translatie verstoord; Succesvol herstel herstelt de volledige expressie van de Reporter-eiwitten. Onbeschadigde plasmiden, zoals pRL-TK Renilla luciferasevectoren, worden vaak gebruikt als interne controles.
Reactivatie van gastheercellen (HCR)
Gastcellenreactivatie (HCR) is een klassieke assay die indirect de efficiëntie van DNA-reparatie evalueert door het vermogen van gastheercellen te meten om expressie te herstellen van beschadigde reporterplasmiden²⁵. Plasmiden met gedefinieerde laesies, zoals UV-geïnduceerde pyrimidine-dimeren of chemisch geïnduceerde kruisverbindingen, worden getransfecteerd in gastheercellen. De herstelefficiëntie wordt vervolgens gekwantificeerd door het meten van de genexpressie van de reporter.
HCR-assays bieden een hoge gevoeligheid en maken het mogelijk om de reparatieactiviteit te beoordelen voor specifieke soorten laesies. Echter, efficiënte transfectie en voorbereiding van hoogwaardige beschadigde plasmiden zijn vereist. Een belangrijke beperking van conventionele HCR is dat behandeling van plasmiden met DNA-schadelijke middelen vaak heterogene laesiepopulaties door het hele plasmide genereert, waardoor de mechanistische interpretatie²⁶ wordt bemoeilijkt.
Om deze beperkingen aan te pakken, zijn flowcytometrie-gebaseerde gastheercelreactivatie (FM-HCR) assays ontwikkeld met behulp van site-specifieke single-laesie plasmiden. FM-HCR maakt snelle kwantitatieve analyse van reparatieactiviteiten in levende cellen mogelijk, hoewel de assay gespecialiseerde instrumentatie vereist en beperkingen kent voor gelijktijdige mechanistische analyse van meerdere BER-paden²⁷.
Plaque host cell reactivatie (PL-HCR) assays gebaseerd op laesie-specifieke BER-substraten zijn ook ontwikkeld om BER-mechanismen in levende cellen te onderzoeken (Figuur 1)²⁸. Bij deze benadering worden plasmiden met één enkele 1,N 6-ethenoadenine (εA) laesie in zoogdiercellen geïntroduceerd. Na reparatie wordt plasmide-DNA teruggewonnen, verteerd met restrictie-enzymen, omgezet in E. coli en gekwantificeerd door plaque-vormingsanalyse. Volledig gerepareerde plasmiden worden na restrictievertering gelineariseerd en kunnen plaques niet meer aanmaken, terwijl niet-gerepareerde of niet volledig gerepareerde plasmiden cirkelvormig blijven en plaques vormen. De efficiëntie van BER wordt daarom bepaald door kwantificatie van plaque.
Reparatie-ondersteunde schadedetectie
Reparatie-assisted damage detection (RADD) is een methode met één molecuul om DNA-schade²⁹ te detecteren en kwantificeren. Bij deze aanpak herkennen en verwijderen laesiespecifieke reparatie-enzymen beschadigde basen, waarna DNA-polymerasen fluorescerend gelabelde nucleotiden in de resulterende openingen integreren. DNA-moleculen worden vervolgens zichtbaar gemaakt met fluorescentiemicroscopie, waardoor directe detectie en kwantificering van DNA-laesies mogelijk is (Figuur 2)³⁰.
RADD biedt zeer gevoelige kwalitatieve en kwantitatieve analyse van DNA-schade op het niveau van één molecuul. De methode meet echter vooral de last van DNA-schade in plaats van direct de reparatiekinetiek of de algehele herstelefficiëntie in celpopulaties te evalueren.

figure-protocol-1
Figuur 1: Reactivatie van de plaque-gastheercel (PL-HCR). M13mp18 circulair enkelstrengs DNA met een gedefinieerde laesie wordt getransfecteerd in competente cellen. Na transfectie worden cellen op agarplaten gekweekt om plaquevorming mogelijk te maken. Replicatieve vorm M13 DNA wordt vervolgens geïsoleerd uit plaques, verteerd met restrictie-enzymen en geanalyseerd met gelelektroforese om mutante en wildtypeproducten te onderscheiden en te bepalen of laesie heeft hersteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-2
Figuur 2: Reparatie-ondersteunde schadedetectie (RADD). Enkelstrengige gaten die tijdens DNA-reparatie ontstaan, worden opgevuld met biotine-gelabelde nucleottiden. Fluorescentie-gelabelde avidin of streptavidine wordt vervolgens gebruikt om geïntegreerde nucleotiden te detecteren, waardoor kwantitatieve beoordeling van DNA-schadeniveaus mogelijk is door fluorescentieanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Nucleotide excisieherstel (NER)

Nucleotide-excisieherstel (NER) is een belangrijk DNA-reparatiepad dat verantwoordelijk is voor het verwijderen van omvangrijke DNA-laesies die de DNA-dubbelhelix³¹ vervormen. NER-substraten omvatten UV-geïnduceerde cyclobutaanpyrimidine-dimeren (CPD's), 6-4 pyrimidine-pyrimidon fotoproducten (6-4PP's), oxidatieve purinelaesies, omvangrijke chemische adducten en cisplatine-geïnduceerde intrastreng-kruisverbindingen³². Defecten bij NER worden geassocieerd met aandoeningen zoals xeroderma pigmentosum, dat wordt gekenmerkt door extreme UV-gevoeligheid en verhoogde vatbaarheid voor kanker.

NER bestaat uit twee hoofdsubroutes: globale genoom NER (GG-NER)³³ en transcriptiegekoppelde NER (TC-NER)³⁴. GG-NER onderzoekt het gehele genoom op helix-vervormende laesies, waardoor mutagenese en carcinogenese worden onderdrukt. Daarentegen verwijdert TC-NER selectief transcriptieblokkerende laesies van actief getranscribeerde genen en is essentieel voor het behouden van transcriptionele integriteit. Defecten in TC-NER dragen bij aan aandoeningen zoals het Cockayne-syndroom en UV-sensitiv syndroom³⁵.

Methoden voor het detecteren van NER-efficiëntie

Incisie-assay
De incisietest evalueert de efficiëntie van NER door strengincisies te detecteren die door reparatie-eiwitten op DNA-beschadigingsplaatsen zijn geïntroduceerd. In deze assay worden beschadigde DNA-substraten, zoals UV-bestraald DNA met CPD's, geïncubeerd met reparatie-eiwitten of cellulaire extracten, en vervolgens worden incisieproducten gedetecteerd³⁶.
Radiolabeling of fluorescentielabeling kan worden gebruikt om de gevoeligheid te verbeteren en nauwkeurige monitoring van incisieactiviteit mogelijk te maken³⁷. De assay meet direct de activiteit van belangrijke NER-eiwitten die verantwoordelijk zijn voor schadeherkenning en excisie. Een succesvolle implementatie vereist echter de bereiding van hoogwaardige beschadigde substraten en actieve eiwitextracten.
Enzymreparatie komeet-assay
De efficiëntie van NER kan ook worden beoordeeld met enzymgemodificeerde Comet-assays. In deze benadering wordt T4-endonuclease V geïncubeerd met beschadigde cellen om pyrimidine-dimeren om te zetten in detecteerbare enkelstrengbreuken, die vervolgens worden geanalyseerd met behulp van de Comet assay³⁸.
Real-time fluorescentie kwantitatieve PCR (qPCR)
Real-time kwantitatieve PCR (qPCR) evalueert indirect de efficiëntie van DNA-reparatie door de remmende effecten van DNA-laesies op PCR-amplificatie te meten³⁹. Tijdens NER-analyse wordt UV-bestraling voor het eerst gebruikt om pyrimidine-dimeren te induceren. Deze laesies belemmeren de progressie van DNA-polymerase en verminderen de amplificatie-efficiëntie, wat resulteert in verhoogde cyclusdrempel (Ct)-waarden. Na reparatie door de NER-route wordt de DNA-integriteit hersteld en verbetert de amplificatie-efficiëntie, wat leidt tot lagere CT-waarden. De reparatie-efficiëntie kan daarom worden gekwantificeerd door versterking voor en na reparatie te vergelijken met een onbeschadigd intern controlegebied⁴⁰.
Daarnaast kan qPCR worden gebruikt om de expressieniveaus te beoordelen van genen die betrokken zijn bij DNA-schadesignalering en -reparatieroutes, waaronder ATM, ATR, BRCA1, CDKN1A en XPC, en weerspiegelt daarmee indirect de DNA-reparatiecapaciteit⁴¹.
Flowcytometrie-gebaseerde gastheercelreactivatie (FM-HCR)
FM-HCR-assays maken gebruik van locatiegebonden plasmiden die laesie bevatten en in gastheercellen zijn getransfecteerd en kwantificeren de herstelefficiëntie door middel van flowcytometrische analyse van fluorescentieintensiteit en het aandeel fluorescentiecellen (Figuur 3)⁴²˒⁴³. Verhoogde fluorescentieintensiteit weerspiegelt over het algemeen een grotere DNA-reparatiecapaciteit⁴⁴˒⁴⁵.
Excisiereparatiesequencing (XR-seq)
Excisie-reparatiesequencing (XR-seq) is een genoombrede techniek voor het in kaart brengen van NER-activiteit bij enkelvoudige nucleotideresolutie. Deze methode verrijkt en sequencet selectief oligonucleotiden die schade bevatten en tijdens NER worden verwijderd, waardoor hoogresolutiekaarten van herstelactiviteit in het genoom worden gegenereerd. XR-seq maakt kwantitatieve analyse mogelijk van reparatie-efficiëntie en distributiepatronen die samenhangen met zowel GG-NER als TC-NER paden en vertegenwoordigt een belangrijke technologische vooruitgang in NER-onderzoek.
Omdat NER bestaat uit twee mechanistisch verschillende subpaden en talrijke hersteleiwitten omvat, zijn meerdere complementaire methoden vereist voor een uitgebreide beoordeling van herstelactiviteit⁴⁶˒⁴⁷. Naast de hierboven beschreven methoden kan de efficiëntie van NER ook worden geëvalueerd met behulp van Western blotting, immunofluorescentie-assays, plasmide-gebaseerde reparatie-assays en reportergen-assays.

figure-protocol-3
Figuur 3: Detectieprincipe van flowcytometrie-gebaseerde gastheercelreactivatie (FM-HCR). Plasmiden die vier verschillende soorten DNA-schade bevatten, worden gezamenlijk getransfecteerd in gekweekte zoogdiercellen. DNA-reparatiecapaciteit (DRC) wordt vervolgens gekwantificeerd door flowcytometrie op basis van de fluorescentieintensiteit van de reporter. DRC, DNA-reparatiecapaciteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Mismatch-reparatie (MMR)

Mismatch-reparatie (MMR) is een postreplicatieve foutcorrectieroute die verantwoordelijk is voor het repareren van basismismatches, zoals G-T en A-C mispairs, evenals kleine insertion-deletielussen die ontstaan tijdens DNA-replicatie⁴⁸. MMR wordt gestart wanneer MutS mismatched bases herkent, waarna MutL downstream repair factors en exonucleases rekruteert om het herstelproces⁴⁹ te activeren. Een cruciale stap in MMR is het onderscheiden van de ouderlijke en nieuw gesynthetiseerde DNA-strengen⁵⁰.

Bij prokaryoten wordt strengdiscriminatie bereikt door DNA-methylering, die de ouderstreng markeert. Bij eukaryoten wordt de identiteit van strengen bepaald door tijdelijke sneetjes in nieuw gesynthetiseerd DNA en interacties met prolifererende celnucleaire antigeen (PCNA). MMR verbetert de replicatietrouw aanzienlijk en speelt een essentiële rol bij het behouden van genomische stabiliteit⁵¹. Defecten in BMR worden sterk geassocieerd met meerdere vormen van kanker, waaronder het Lynch-syndroom.

Methoden om de efficiëntie van MMR te beoordelen

Microsatellietinstabiliteitstesten
Defecte MMR resulteert in het niet corrigeren van replicatieslippagefouten bij microsatellietloci, wat leidt tot microsatellietinstabiliteit (MSI). MSI-testen omvatten PCR-amplificatie van representatieve microsatellietmarkers, gevolgd door fragmentanalyse gebaseerd op capillaire elektroforese. Instabiliteit op meerdere loci duidt op verminderde MMR-activiteit, terwijl stabiele microsatellietprofielen een intacte MMR-functie aangeven. MSI-testen bieden een hoge gevoeligheid en specificiteit voor het identificeren van MMR-deficiëntie; het blijft echter een indirecte maat voor de MMR-functie en beoordeelt het de reparatie-efficiëntie niet kwantitatief.
Reporterplasmiden met gedefinieerde mismatches of insertion-deletion loops kunnen ook worden gebruikt om de MMR-efficiëntie te evalueren via reportergenassays. Daarnaast kunnen westerse blotting- en immunofluorescentie-assays gericht op MMR-geassocieerde eiwitten indirecte beoordeling van de pathwayactiviteit bieden.

5. Dubbelstrengs breuk (DSB) reparatie

Dubbelstrengbreuken (DSB's) behoren tot de meest cytotoxische vormen van DNA-schade. Het niet nauwkeurig repareren van DSB's kan leiden tot mutaties, chromosomale deleties, translocaties, genomische instabiliteit en tumorgenese. DSB-reparatie vindt voornamelijk plaats via homologe recombinatie (HR) en niet-homologe eindaansluiting (NHEJ), die bij voorkeur werken tijdens verschillende fasen van celcyclus⁵².

Methoden voor het beoordelen van de efficiëntie van DSB-reparatie

gamma-H2AX foci-assay
De γ-H2AX foci-assay is een van de meest gebruikte methoden om DSB's indirect te detecteren. Na de vorming van DSB wordt histon H2AX snel gefosforyleerd bij Ser139 om γ-H2AX-brandpunten te genereren. Het aantal γ-H2AX foci correleert met de mate van DSB-vorming, en de reparatie-efficiëntie kan worden afgeleid door de snelheid van foci-verdwijning in de tijd te monitoren met behulp van immunofluorescentiemicroscopie.
Deze assay biedt verschillende voordelen, waaronder hoge gevoeligheid, enkelcelresolutie en gevestigde experimentele protocollen, waardoor het een centrale methode is in DNA-schaderespons (DDR)-onderzoek.
BLESS en BLISS
BLESS (Breaks Labeling, Enrichment on Streptavidin, and Sequencing) en BLISS (Breaks Labeling In Situ and Sequencing) zijn genoombrede DSB-mappingmethoden gebaseerd op in situ labeling en high-throughput sequencing. Beide benaderingen identificeren DSB-locaties door directe ligatie van sequencingadapters aan gebroken DNA-uiteinden, waardoor precieze, genoombrede lokalisatie en kwantificatie van DSB's mogelijk is. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om de totale kinetiek van DSB-reparatie te evalueren.
Daarnaast kunnen DSB-specifieke reportergenassays de efficiëntie van DSB-reparatie kwantitatief evalueren en HR-gemedieerde reparatie onderscheiden van NHEJ-gemedieerde reparatie (Figuur 4). Hoewel γ-H2AX assays, BLESS en BLISS effectief de globale DSB-last en reparatiekinetiek meten, kunnen ze niet bepalen of reparatie specifiek via HR- of NHEJ-paden heeft plaatsgevonden.

figure-protocol-4
Figuur 4: Reporter gen-assay voor dubbelstrengbreuk (DSB) reparatie. DSB-reporterplasmiden worden in doelcellen geïntroduceerd. Na een passende herstelperiode na transfectie wordt de rapportagegenfluorescentie gemonitord met fluorescentiemicroscopie om de efficiëntie van DSB-reparatie te evalueren. DSB, dubbele strengbreuk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Homologe recombinatiereparatie (HR)

Homologe recombinatie (HR) is een high-fidelity DNA-reparatieroute die voornamelijk functioneert tijdens de S- en G2-fasen van de celcyclus, wanneer een onbeschadigde zusterchromatide beschikbaar is als reparatietemplate⁵³. Na de vorming van DSB herkent het MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) complex DNA-uiteinden en start DNA-eindresectie in samenwerking met CtIP⁵⁴. Dit proces genereert 3′ enkelstrengs DNA (ssDNA) overhangen.

Het resulterende ssDNA wordt aanvankelijk bedekt met replicatieproteïne A (RPA), dat het DNA beschermt tegen nuclease-afbraak en de vorming van secundaire structuren^{voorkomt 55}. Vervolgens bemiddelt BRCA2 de vervanging van RPA door RAD51-recombinase, wat resulteert in de vorming van een RAD51-nucleoproteïnefilament⁵⁶. Dit filament zoekt naar homologe DNA-sequenties op de zusterchromatide en bevordert de invasie van strengen in het homologe duplex DNA-sjabloon, waardoor een displacement loop (D-lus) structuur⁵⁷˒⁵⁸ wordt gegenereerd. DNA-synthese en strenguitwisseling gaan vervolgens verder tot de voltooide reparatie.

HR-efficiëntie kan kwantitatief worden geëvalueerd met behulp van DR-GFP-rapportagesystemen in reportergenassays. Alternatief kan indirecte beoordeling worden uitgevoerd met behulp van Western blotting of immunofluorescentie-assays gericht op HR-geassocieerde eiwitten.

7. Niet-homoloog DNA-eindaansluiting (NHEJ)

Niet-homoloog eindverbindingen (NHEJ) repareren DSB's zonder uitgebreide sequentiehomologie tussen DNA-uiteinden⁵⁹ te vereisen. In plaats daarvan worden gebroken DNA-uiteinden direct verwerkt en geligeerd, waardoor NHEJ een van nature foutgevoelig hersteltraject wordt. Omdat DNA-uiteinden kunnen afbreken vóór ligatie en uiteinden van niet-verwante DSB's aan elkaar kunnen worden verbonden, kan NHEJ leiden tot mutaties, deleties en chromosomale herschikkingen⁶⁰.

Drie belangrijke vormen van niet-homologe reparatie worden erkend: klassieke NHEJ, enkelstreng-annealing (SSA) en microhomologie-gemedieerde eindverbinding (MMEJ).

Klassieke NHEJ
Klassieke NHEJ werkt gedurende de hele celcyclus. Het Ku70/Ku80-heterodimeer herkent en bindt eerst DSB-eindpunten⁶¹. Dit complex rekruteert DNA-afhankelijke eiwitkinase-katalytische subunit (DNA-PKcs), wat leidt tot activatie van kinase-signalering en het initiëren van NHEJ. Eindverwerkingsenzymen, waaronder nucleasen en fosfatasen, verwerken vervolgens beschadigde DNA-termini voordat het XRCC4-DNA-ligase IV-complex de ligatie van DNA-eindjes⁶² bemiddelt. Omdat terminale verwerking vaak leidt tot nucleotideverlies of onnauwkeurige heraansluiting, wordt NHEJ beschouwd als een mutagene reparatieroute⁶³˒⁶⁴.
Enkelstrengs gloeien (SSA)
Enkelstreng-annealing (SSA) herstelt DSB's die voorkomen tussen herhaalde homologe sequenties. Na de vorming van DSB verwijderen nucleasen de 5′ DNA-uiteinden, waardoor uitgebreide 3′ ssDNA-overhangen ontstaan. RAD52 bemiddelt het uitgloeien tussen complementaire homologe herhalingen⁶⁵. Vervolgens verwijdert het XPF-ERCC1 endonucleasecomplex ongepaarde DNA-flappen, en kan het SLX1-SLX4-complex ook deelnemen aan eindverwerking. DNA-ligase sluit vervolgens de resterende openingen. Omdat sequenties tussen homologe herhalingen tijdens de reparatie worden verwijderd, wordt SSA beschouwd als een snel maar inherent mutagene herstelmechanisme⁶⁶.
Microhomologie-gemedieerde eindaansluiting (MMEJ)
Microhomologie-gemedieerde eindaansluiting (MMEJ), ook wel alternatieve NHEJ (Alt-NHEJ) genoemd, is een andere foutgevoelige DSB-reparatieroute⁶⁷. Bij MMEJ worden korte microhomologe sequenties nabij DNA-breukuiteinden gebruikt om gebroken DNA-termini uit te lijnen voorafgaand aan reparatie. Na herkenning van deze microhomologe gebieden worden DNA-uiteinden via een recombinatie-achtig proces⁶⁸ met elkaar verbonden. Omdat MMEJ afhankelijk is van zeer korte homologe sequenties, vinden deleties en genomische herschikkingen vaak plaats tijdens de reparatie.
De efficiëntie van NHEJ kan kwantitatief worden geëvalueerd met behulp van EJ5-GFP rapportagesystemen in reportergenassays. Alternatief kan de reparatieactiviteit indirect worden beoordeeld via Western blotting en immunofluorescentieanalyse van NHEJ-geassocieerde eiwitten.

8. Interstrand crosslink (ICL) reparatie

Interstrand crosslinks (ICL's) zijn zeer toxische DNA-laesies die covalent de twee strengen van de DNA-dubbelhelix verbinden, waardoor DNA-replicatie en transcriptie worden geblokkeerd. ICL-reparatie is mechanistisch complex en omvat voornamelijk het Fanconi-anemie (FA) pad en het NEIL3-pad⁶⁹.

In de FA-route herkent FANCM ICL-laesies en bevordert het mono-ubiquitinatie van het FANCI-FANCD2-complex, waardoor downstream reparatie-eiwitten⁷⁰ worden geactiveerd. Structuurspecifieke nucleasen snijden vervolgens DNA nabij de kruisverbinding in om de twee DNA-strengen te scheiden, en de resulterende DSB's worden gerepareerd via HR- of NHEJ-routes.

In de NEIL3-route splitst de DNA-glycosylase NEIL3 glycosidische bindingen die geassocieerd zijn met de ICL-laesie, waardoor AP-plaatsen ontstaan die vervolgens worden omzeild door transletiesynthese (TLS) polymerasen⁷¹. Omdat ICL's de scheiding van strengen voorkomen die nodig is voor replicatie en transcriptie, zijn deze laesies sterk cytotoxisch en dragen ze bij aan veroudering, neurodegeneratie en kanker⁷²˒⁷³.

De efficiëntie van ICL-reparatie kan worden beoordeeld met behulp van plasmide-gebaseerde reparatieassays, reportergenassays, gastheercelreactivatie-assays en in vitro gereconstitueerde herstelsystemen.

9. Transletiesynthese (TLS)

Transletesiesynthese (TLS) is een DNA-schadetolerantiemechanisme dat replicatie mogelijk maakt over niet-gerepareerde DNA-laesies⁷⁴. TLS omvat voornamelijk gespecialiseerde DNA-polymerasen, waaronder polymerasen κ, η, ι en ζ. Wanneer DNA-replicatie stagneert op beschadigde locaties, omzeilen TLS-polymerasen de laesie en laten ze replicatie doorgaan, waardoor genoomstabiliteit⁷⁵ behouden blijft.

In tegenstelling tot BER, NER, MMR, HR en NHEJ, die DNA-laesies direct verwijderen of repareren, elimineert TLS DNA-schade niet. In plaats daarvan omzeilt het niet-gerepareerde laesies tijdens DNA-replicatie en wordt daarom geclassificeerd als een schadetolerantiemechanisme in plaats van een canoniek DNA-reparatiepad⁷⁶.

TLS kan worden onderverdeeld in foutloze en foutgevoelige bypass-paden. Foutloze TLS voegt het juiste nucleotide tegenover de laesie in, terwijl foutgevoelige TLS vaak verkeerde nucleotiden introduceert en bijdraagt aan mutagenese. Foutgevoelige TLS wordt beschouwd als een belangrijk mechanisme waarmee omgevingskankerverwekkende stoffen genomische mutaties induceren. Daarom kan modulatie van foutgevoelige TLS-routes een potentiële strategie vormen voor kankerpreventie en -therapie⁷⁷.

Methoden voor het beoordelen van de efficiëntie van TLS

Isolatie van eiwitten op onthullend DNA (iPOND)
Isolatie van eiwitten op beginnend DNA (iPOND) is een techniek die wordt gebruikt om eiwitten te analyseren die geassocieerd zijn met nieuw gesynthetiseerd DNA bij gestagneerde replicatievorken. Omdat TLS-activiteit vaak plaatsvindt bij gestagneerde vorken, maakt iPOND dynamische analyse mogelijk van de rekrutering en assemblage van TLS-polymerasen en DNA-schaderespons (DDR)-eiwitten tijdens replicatiestress. Deze methode kan daarom worden gebruikt om TLS-activiteit en replicatiegekoppelde reparatieprocessen te evalueren.
TLS-efficiëntie kan ook worden geëvalueerd met behulp van reporterplasmiden die TLS-specifieke DNA-laesies bevatten in reportergenassays. Daarnaast kunnen westerse blotting- en immunofluorescentie-assays die zich richten op TLS-geassocieerde eiwitten indirecte beoordeling van de pathwayactiviteit bieden.

10. Kwaliteitscontrole en reproductiebaarheidsoverwegingen bij experimenteel ontwerp

Biologische replicatie en technische replicatie
Een duidelijk onderscheid tussen biologische replicaten en technische replicaten is essentieel om betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid te waarborgen in DNA-reparatiestudies. In het algemeen moeten voor elk experiment ten minste drie onafhankelijke biologische replicaten worden opgenomen, terwijl het aantal technische replicaten moet worden bepaald op basis van de variabiliteit van het detectieplatform.
Voor eencel-assays, zoals de Comet-assay en immunofluorescentie-gebaseerde foci-analyse, moeten per biologische replicatie minstens 50–100 cellen worden geanalyseerd om de steekproefbias te minimaliseren. In op flow cytometrie gebaseerde rapportagetests, waaronder DR-GFP en FM-HCR assays, moeten minimaal 10.000 live-cell gebeurtenissen per monster worden verzameld om statistische robuustheid te waarborgen.
Standaardisatiestrategie
Nauwkeurige kwantitatieve vergelijking van reparatie-efficiëntie tussen verschillende monsters of experimentele batches vereist strenge normalisatieprocedures om systematische variatie te minimaliseren die voortvloeit uit verschillen in transfectie-efficiëntie, cellevensvatbaarheid, monsterbelasting en instrumentprestaties. Veelvoorkomende normalisatiestrategieën zijn onder andere:
1. Co-transfectie van normalisatieplasmiden
  Bij HCR-assays, rapportage-gebaseerde reparatie-assays en plasmide-gebaseerde reparatie-assays wordt co-transfectie met een normalisatieplasmide die niet wordt aangetast door DNA-schade aanbevolen. Veelgebruikte controles zijn onder andere pRL-TK, Renilla luciferase-plasmiden of constitutief tot expressie gebrachte GFP-vectoren. De reparatie-efficiëntie wordt genormaliseerd door de verhouding te berekenen tussen het experimentele reportersignaal en het controlereportersignaal.
2. Normalisatie met huishoudelijke eiwitten of totale eiwitkleuring
  In Western blot-analyses die de herstelproteïneexpressie of residuele CPD-niveaus beoordelen, moet normalisatie worden uitgevoerd met behulp van huishoudelijke eiwitten, zoals GAPDH, β-actine of histon H3, of via totaalproteïnekleuringsmethoden, waaronder Ponceau S of REVERT-kleuring.
3. Onbeschadigde besturing
  Bij qPCR-gebaseerde reparatietests moeten onbeschadigde genomische gebieden worden geco-amplificeerd als interne controles, en moeten relatieve schadeniveaus worden berekend met de ΔCt-methode. Evenzo moeten HCR-assays onbeschadigde plasmidecontroles bevatten die de maximale rapportage-expressie vertegenwoordigen, zodat reparatie-efficiëntie kan worden uitgedrukt ten opzichte van onbeschadigde referentieplasmiden.
4. Normalisatie van celnummers
  In flowcytometrie-gebaseerde assays, waaronder FM-HCR en DR-GFP assays, moeten gelijke aantallen levensvatbare cellen worden geanalyseerd over monsters. Reparatie-efficiëntie moet vervolgens worden gerapporteerd als het percentage positieve cellen of relatieve veranderingen in fluorescentieintensiteit.
Kinetische dimensie van reparatie-efficiëntiemeting
DNA-reparatie is een dynamisch proces, en metingen die vanaf één tijdstip worden verkregen, kunnen het verschil niet maken tussen vertraagde reparatie en volledige pathwaydeficiëntie. Daarom worden tijdverloop-experimentele ontwerpen sterk aanbevolen.
Na het inleiden van DNA-schade moeten monsters op meerdere opeenvolgende tijdstippen worden verzameld, zoals 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 en 24 uur, om de ophoping en verwijdering van schademarkers of reparatieproducten te monitoren. De kinetiek van signaalverdwijning levert belangrijke informatie over de herstelsnelheid, de integriteit van het pad en de algehele reparatie-efficiëntie.
Correctie van meerdere hypothesen:
Hoge doorvoer- en multiplexbenaderingen omvatten vaak gelijktijdige analyse van meerdere reparatieroutes of experimentele condities, waardoor het risico op vals-positieve bevindingen door meerdere statistische vergelijkingen toeneemt. Voorbeelden zijn gelijktijdige beoordeling van BER-, NER-, HR- en NHEJ-activiteiten met behulp van FM-HCR-assays; genoombrede DSB-analyse met BLESS of BLISS; en qPCR-array-gebaseerde analyse van DNA-reparatiegenexpressie.
Daarom moeten statistische correctiemethoden voor het testen van meerdere hypothesen vooraf worden gedefinieerd tijdens het experimentele ontwerp. De geselecteerde correctiemethoden en aangepaste significantiedrempels moeten duidelijk worden gerapporteerd in de secties Materialen en Methoden en statistische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Conclusies

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nauwkeurige detectie en kwantitatieve analyse van DNA-schadeherstelprocessen zijn essentieel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen achter DNA-reparatie, het evalueren van de biologische effecten van omgevingsblootstelling en het beoordelen van therapeutische responsen⁷⁸. Daarom heeft diepgaand onderzoek naar DNA-schadeherstelroutes en reparatie-efficiëntie een aanzienlijke betekenis in zowel fundamenteel onderzoek als klinische toepassingen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven aan dat er geen concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties zijn die invloed hadden kunnen hebben op het werk dat in deze studie wordt gerapporteerd.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Jiangsu Province Engineering Research Center voor Ontwikkeling en Vertaling van Sleuteltechnologieën voor Preventie en Controle van Chronische Ziekten; het Innovatieve Onderzoeksteam voor Wetenschap en Technologie van de Jiangsu Higher Education Institution (2021); het programma van het Jiangsu Vocational College Engineering Technology Research Center (2023); de Natuurwetenschappelijke Sleutelstichting van de Jiangsu Hoger Onderwijsinstellingen van China (Subsidie nr. 24KJA310008); het Sleutelprogramma van het Suzhou Beroepsgezondheidscollege (Subsidienummer szwzy202406); en het State Key Laboratory of Radiation Medicine and Protection, Soochow University (Subsidie nr. GZK1202506).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNA reparatiepaden genomische stabiliteit kankertherapie ontwikkeling van chemotherapeutische geneesmiddelen beoordeling van functionele activiteit validatie van genfunctie DNA reparatiecapaciteit cellulaire transformatie

Onderzoeksvoortgang naar strategieën voor efficiëntiebeoordeling van DNA-schade

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Review en perspectief

Conclusies

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen