Een tapemontageprotocol voor hoge-resolutie z-stack beeldvorming van Drosophila compound ogen

Summary

Het primaire doel van dit protocol is het mogelijk maken van niet-destructieve beeldvorming en kwantitatieve analyse van Drosophila-verbindingen in ogen. Het combineert een tapemontagestrategie met stereomicroscopische Z-stack acquisitie en Extended Depth of Focus reconstructie om beelden zonder hoge resolutie en artefacten te produceren.

Abstract

Hier presenteren we een niet-destructief montage- en beeldvormingsprotocol voor een fenotypische analyse van het Drosophila-compoundoog. Nauwkeurige fenotypering van het Drosophila-compoundoog wordt vaak beperkt door de convexe geometrie en mechanische kwetsbaarheid tijdens het hanteren. Om dit aan te pakken, beschrijven we een veelzijdige, niet-invasieve beeldvormingsworkflow die hoge resolutie visualisatie vanuit meerdere perspectieven mogelijk maakt. Het protocol maakt gebruik van een op maat gemaakte lijmmontagestrategie op een omgekeerd tapeplatform, waarbij vliegen aan het lichaam en de vleugels worden vastgezet terwijl het hoofd volledig onaangeroerd blijft. Cruciaal is dat deze flexibele configuratie verschillende montage-oriëntaties ondersteunt: een laterale positie om de volledige convexiteit van individuele ogen vast te leggen, en een frontale positie om de symmetrie van het hele hoofd te beoordelen. Deze methode vergemakkelijkt ook de rangschikking van arrays met hoge dichtheid, waardoor de snelle verwerking van 20–30 samples per sessie mogelijk is. Door gereflecteerd licht stereomicroscopie te integreren met Z-stack acquisitie en Extended Depth of Focus (EDF) reconstructie, genereert de workflow uniform scherpe, quasi-3D samengestelde beelden. Deze benadering behoudt natuurlijke pigmentatie en levert hoogopgetrouwe, contrastrijke beelden op die geschikt zijn voor kwantitatieve fenotypische analyse op orgaanschaal.

Introduction

Het Drosophila melanogaster compound-oog is een klassiek en krachtig model voor het bestuderen van orgaangroei, patroonvorming en robuustheid tijdens de ontwikkeling. Het vliegoog, bestaande uit ongeveer 800 hooggeordende ommatidien, biedt een gevoelige en kwantificeerbare uitlezing van genetische verstoringen die proliferatie, differentiatie en weefselorganisatie^{beïnvloeden 1,2,3}. Genetische manipulatie van de oogontwikkeling heeft historisch gezien fundamentele inzichten opgeleverd in geconserveerde signaalpaden. Spermale studies toonden aan dat de buitenbaarmoederlijke expressie van de transcriptiefactor oogloos voldoende is om oogvorming in niet-netvliesweefsels te induceren, waarmee het oog als paradigma voor orgaanspecificatie en plasticiteit wordt^{gevestigd 4}. Vervolgonderzoek identificeerde de D. melanogaster Hippo-signaalweg als een centrale regelaar van ooggrootte en celaantal via gecoördineerde controle van proliferatie en apoptose ^5,6. Parallel bleek dat Hedgehog- en BMP-signalering morfogenetische progressie, groeiprecisie en ruimtelijke patroonvorming binnen het zich ontwikkelende netvlies^{reguleerden 7,8}.

Het vastleggen van hoog-fideliteit beelden van het volwassen samengestelde oog brengt echter aanzienlijke optische uitdagingen met zich mee vanwege de bol, hemisferische geometrie. Standaard helderveldmicroscopie wordt beperkt door een geringe scherptediepte, waardoor het onmogelijk is om gelijktijdig scherp te stellen op het dorsale punt (pool) en de randranden (evenaar) van het oog in één enkele belichting⁹. Deze beperking leidt vaak tot beelden waarbij aanzienlijke delen van het netvliesoppervlak wazig zijn, wat het gebruik van hogeresolutie beeldanalyse en machine learning-tools die ontworpen zijn om variegatiefenotypes te kwantificeren, belemmert. Om het netvliesoppervlak volledig te karakteriseren, moet de volledige kromming worden weergegeven zonder optische artefacten. Daarom is een beeldvormingsmethode nodig die de oorspronkelijke oogmorfologie behoudt en tegelijkertijd een hoge resolutie visualisatie van het gehele gebogen netvliesoppervlak mogelijk maakt.

Bovendien compromitteren traditionele monstervoorbereidingsmethoden voor microscopie vaak de structurele integriteit van de vliegenhoofd. Conventionele montagetechnieken maken vaak gebruik van lijmen die oppervlakdetails kunnen verbergen of fysieke manipulatie met een pincet vereisen die druk uitoefent op de kopcapsule. Zoals opgemerkt in studies naar retinale morfogenese, is de structurele integriteit van het oog van het grootste belang. Directe druk of perforatie veroorzaakt hemolymfelekkage, wat leidt tot intern drukverlies en de daaropvolgende inzakking of "deuk" van het oogoppervlak. Deze mechanische artefacten kunnen neurodegeneratieve fenotypes of genetische defecten nabootsen, wat leidt tot vals-positieve resultaten bij grootschalige screenings. Het doel van dit protocol is het bieden van een niet-destructieve montage- en beeldvormingsworkflow voor hoge resolutie visualisatie van intacte Drosophila-compoundogen.

Hier presenteren we een snelle en reproduceerbare beeldvormingsworkflow die een hoge resolutie visualisatie mogelijk maakt van intacte Drosophila-compoundogen en de morfologie van het hele hoofd zonder direct contact met het hoofd. Bij deze methode worden volwassen vliegen geïmmobiliseerd met een flexibele lijmmontagestrategie die het lichaam en de vleugels vastzet, waardoor stabiele positie mogelijk is in een laterale oriëntatie — om de volledige kromming van één oog te vangen — of een frontale oriëntatie — om de symmetrie van de hele kop en de interoculaire kenmerken te beoordelen. Deze veelzijdige montagemethode minimaliseert mechanische schade en behoudt de natuurlijke ooggeometrie in drie dimensies. In combinatie met gereflecteerd-licht stereomicroscopie, Z-stack acquisitie en uitgebreide scherptediepte-reconstructie⁹, genereert deze aanpak uniform scherpe, hoogwaardige beelden vanuit meerdere perspectieven, geschikt voor zowel kwalitatieve inspectie als kwantitatieve fenotypische analyse. Deze methode is bijzonder geschikt voor studies naar genetische verstoringen, ontwikkelingsfenotypes en high-throughput screening van oogmorfologie bij Drosophila.

Protocol

1. Monsterverzameling en synchronisatie

OPMERKING: Om experimentele vergelijkbaarheid te waarborgen, is strikte controle van de eclosietiming vereist. Onder standaardkweekomstandigheden bij 25 °C vindt eclosion meestal 10 tot 12 dagen na het leggen van het ei plaats. Poppen moeten tijdens dit venster nauwlettend worden gemonitord, omdat het donker worden van de pop aangeeft dat de pop op handen komt.

1. Directe tapmethode (Standaardmethode)
   1. Tik voorzichtig op het standaard 24 x 95 mm plastic Drosophila-kweekflesje (afgesloten met een schuimrubberen plug) tegen een zacht kussentje om volwassen vliegen naar de bodem te krijgen.
   2. Verwijder snel de plug en lijn de opening van een verse verzamelflesje uit met het kweekflesje.
   3. Draai de opstelling om zodat het kweekflesje bovenop staat. Tik voorzichtig op de wanden om de vliegen in het verzamelbuisje over te brengen.
      OPMERKING: Deze methode wordt niet aanbevolen als het standaard maïsmeel-agar voedingsmedium vochtig is, omdat nieuw gesloten vliegen gemakkelijk gevangen en gedood worden. Om sterfte te minimaliseren, verzamel je vliegen eerst in een leeg flesje van 24 x 95 mm. Na de narcose (stap 3) worden de vliegen overgebracht op de binnenwand van een flesje van 24 x 95 mm met vers voedselmedium.
2. Negatieve geotaxis overdrachtsmethode (Anti-adhesiemethode)
   1. Haal de plug uit een nieuw verzamelflesje en draai het om op het werkblad om te voorkomen dat verdwaalde vliegen binnenkomen.
   2. Houd het kweekflesje met de opening naar beneden gericht. Vliegen klimmen omhoog naar de voedselzijde, weg van de opening.
   3. Zodra de opening vrij is van vliegen, ontkurk je snel het kweekflesje en richt je het op het omgekeerde lege 24 x 95 mm verzamelflesje op de bank.
   4. Tik voorzichtig op het aansluitpunt tegen het aanrechtblad om de vliegen in het verzamelflesje te laten vallen.
      OPMERKING: Deze methode vermindert de sterfte door voedseladhesie aanzienlijk, maar kost meer tijd dan direct tappen.
3. CO₂-anesthesiemethode (Hoogefficiëntiemethode)
   1. Draai het kweekflesje om zodat de plug naar beneden wijst.
   2. Steek voorzichtig de naald van het CO₂-anesthesiepistool tussen de plug en de buiswand.
   3. Trap voorzichtig het voetpedaal en het handventiel in om 100% CO₂ vrij te geven bij een laag, zacht debiet.
   4. Zodra vliegen zijn verdoofd en op de plug zijn gevallen, plaats je het kweekflesje horizontaal. Verwijder de plug, lijn uit met een leeg verzamelflesje en tik voorzichtig op het kweekflesje om de verdoofde vliegen in het verzamelflesje over te brengen.
      OPMERKING: Overmatige luchtstroom kan vliegen op het voedseloppervlak blazen, wat adhesie en dood veroorzaakt; handhaaf strikt een zachte_CO2-stroom die voldoende is om de vliegen te verdoven zonder ze fysiek te verplaatsen. Houd vliegen nauwlettend in de gaten op vroege tekenen van herstel, zoals subtiele trekkingen of beweging van de vleugels en poten.
4. Etikettering en onderhoud
   1. Label het verzamelflesje met het geslacht, verzameldatum, eclosiedatum, genotype en kweekcondities.
   2. Geslachtsgescheiding: Als beeldvormende vliegen ouder dan 10 dagen zijn, scheid mannetjes en vrouwtjes in verschillende kweekflesjes met voedsel om paring en het ontstaan van een F2-generatie te voorkomen, wat de experimentele omgeving kan verstoren.
      OPMERKING: Vliegen kunnen in deze voedselhoudende flesjes worden gehouden onder eerdere kweekomstandigheden (bijv. 25 °C) totdat ze de gewenste leeftijd voor beeldvorming bereiken.

2. Voorbereiding van de montageplaat

1. Koop een schoon standaard glazen microscoopobjectglas.
2. Knip een strook wit papieren schilderstape die ongeveer 2 cm langer is dan de slide.
3. Plaats de tape op de slide met de kleefzijde naar boven (niet-klevende kant tegen het glas). Zorg ervoor dat de tape aan beide uiteinden ongeveer 1 cm boven de slede uitsteekt.
4. Bevestig de overhangende uiteinden door twee extra ~5 mm stroken tape strak om de achterkant van de glijbaan te wikkelen.
5. Zorg ervoor dat het lijmoppervlak vlak, strak en vrij van rimpels is.
6. Labelen: Markeer oriëntatie-indicatoren (bijv. "Top/Up" en "Bottom/Down") of monsteridentificaties op de niet-klevende uiteinden van de tape om oriëntatie en monstertracking onder de microscoop te vergemakkelijken.
   OPMERKING: Bij het selecteren van vliegen voor beeldvorming moet u vermijden om individuen met aanzienlijke verschillen in lichaamsgrootte te kiezen. Zelfs bij identieke vergroting kunnen variaties in lichaamsgrootte resulteren in niet-vergelijkbare samengestelde oogoppervlakken.

3. Euthanasie en opzetten

1. Euthanasie
   1. Doe de vliegen over in een afgesloten en leeg verzamelflesje.
   2. Plaats het afgesloten flesje 15–20 minuten in een vriezer van -80 °C.
      VOORZICHTIG: Steek de vlieg nooit door of knijp met de scherpe punten van een fijne pincet. Zelfs kleine hemolymfelekkage veroorzaakt een snel verlies van interne hydrostatische druk, wat direct leidt tot deukvorming en onomkeerbare inklimpatie van het samengestelde oog, wat de beeldkwaliteit aantast.
2. Montage voor zijwaarts aanzicht (Enkel samengesteld oog)
   1. Positionering: Onder een standaard stereomicroscoop (bijv. Nikon SMZ745) gebruik je fijnpuntpincetten om de geëuthanaseerde vlieg in een zijwaartse (zijwaarts) positie te positioneren.
   2. Overdracht: Met fijnpuntpincet pak je de vlieg voorzichtig bij de vleugel (met behoud van de laterale houding) en breng deze over naar de voorbereide lijmbevestigingsplaat.
   3. Fixatie: Plak één kant van het lichaam van de vlieg aan het plakband. Spreid de vleugels en plak ze plat tegen de tape om de stabiliteit te vergroten.
   4. Beheer van het aanhangsel: Zorg er tijdens het bestijgen voor dat de benen het samengestelde oog niet blokkeren. Als de voorpoten het zichtveld blokkeren, gebruik dan een pincet om ze voorzichtig van het oog weg te trekken en stevig aan de tape te bevestigen (bijvoorbeeld door ze naar beneden te steken of onder de borst te stoppen).
   5. Vastzetten: Kantel de pincet en gebruik de zijkant van de tip (niet de scherpe punt) om het lichaam zachtjes tegen de tape te drukken om een stevige hechting te garanderen.
   6. Fijne afstelling: Controleer of de kop horizontaal is. Als het oog niet op één brandpunt staat, gebruik dan een pincet om de lichaamshoek micro-aan te passen.
3. Montering voor frontaal zicht (hele hoofd)
   1. Positionering: Op het anesthesiekussen oriënteer je de vlieg in een buikliggende (buikliggende) positie.
   2. Overdracht: Gebruik een pincet om één vleugel vast te pakken en de vlieg op te tillen. Breng het over op de lijmmontageplaat.
   3. Eerste fixatie: Spreid beide vleugels voorzichtig naar buiten (links en rechts) en druk ze stevig op het lijmoppervlak om de vlieg te verankeren.
   4. Lichaamsstabilisatie: Druk voorzichtig op de thorax om volledig contact met de kleefplaat te garanderen. Gebruik een pincet om de achterste buik (staart) lichtjes vast te pakken en trek zachtjes om de lichaamsas recht te maken voordat je de buik aan de tape vastzet.
   5. Hoofdoriëntatie: Stel de hoek van de kop aan met een fijne pincet om ervoor te zorgen dat het frontale vlak (vlak) parallel is aan het lijmoppervlak. Beide samengestelde ogen moeten in hetzelfde brandvlak waterpas en zichtbaar zijn.
4. Indeling
   1. Bevestig meerdere vliegen in parallelle rijen of een rasterachtige opstelling op het lijmoppervlak. Zorg ervoor dat individuele vliegen niet overlappen om Z-stack interferentie te voorkomen, hoewel dicht oppakken is toegestaan om de doorvoer te maximaliseren (bijvoorbeeld 20–30 vliegen per dia). Lijn alle vliegen uit met hun kop in dezelfde richting (zoals aangegeven door de labels in stap 2.6) om systematische beeldvorming te vergemakkelijken.
   2. Bereid aparte monsterarrays voor voor laterale en frontale beeldvorming met verschillende sets geëuthanaseerde vliegen uit dezelfde cohort. Zodra een vlieg aan het lint is vastgezet, kan deze niet veilig worden verwijderd of opnieuw geplaatst zonder ernstige mechanische schade aan het monster te veroorzaken; daarom kunnen meerdere weergaven niet achtereenvolgens worden afgebeeld door hetzelfde individu.
      OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om de monsters direct na euthanasie en montage te fotograferen om uitdroging van het weefsel te voorkomen.

4. Beeldverwerving

1. Opstart en initialisatie van gemotoriseerd stereomicroscoopbeeldsysteem
   1. Zet de pc, monitor en microscoop achter elkaar aan.
   2. Start de LAS X-software.
   3. Wanneer de prompt "Initialiseren/Zelftest" verschijnt, zorg dan dat de ruimte onder het doel vrij is van obstakels en klik op Bevestigen. Laat de microscoop de volledige Z-as kalibratiebeweging uitvoeren.
      OPMERKING: De volgende stappen zijn geoptimaliseerd voor een stereomicroscoop met het LAS X-softwaresysteem.
2. Plaatsing en verlichting van samples
   1. Breng de voorbereide montageplaat over naar het basisplatform van de gemotoriseerde stereomicroscoop, waarbij deze handmatig wordt gepositioneerd om het eerste monster in de array onder het objectief van de digitale camera te centreren.
   2. Zet de Doorgezonden Lichtbronnen (basis) en Invallend Licht (boven) aan. Voor compound oogbeeldvorming gebruik je voornamelijk gereflecteerd licht. Stel het diafragma aan om een gelijkmatige verlichting te garanderen.
3. Softwareconfiguratie
   1. Stel de acquisitiemodus in op Z-stack. Stel in de projectinstellingen de meerdimensionale bewegingsprioriteit in op 'Z-first' om een continue en stabiele motoraandrijving te garanderen.
   2. Stel de beeldvormingsmodus in op Gereflecteerd Licht.
   3. Schakel Extended Depth of Focus (EDF) in om de synthese van een volledig gefocust beeld mogelijk te maken.
   4. Schakel in de Geavanceerde Beeldinstellingen High Dynamic Range (HDR) in. Dit wordt sterk aanbevolen om de speculaire highlights en overbelichting die vaak worden veroorzaakt door het sterk reflecterende, chitineuze oppervlak van het samengestelde oog te verminderen.
4. Positionering en witbalans
   1. Stel de vergrotingsknop in op het juiste niveau (bijvoorbeeld een zoomfactor van 16x voor het laterale enkeloogbeeld en 12,5x voor het frontale hele hoofdzicht), zodat het specifieke interessegebied 1/2 tot 2/3 van het gezichtsveld beslaat.
   2. Plaats de montageplaat handmatig zodat de thorax van de vlieg in het midden van het gezichtsveld wordt gebracht.
   3. Voer witbalanskalibratie uit met behulp van de thorax om de kleurtemperatuur te corrigeren.
5. Belichtings- en beeldparameters (referentiewaarden)
   Blootstelling: 60–80 ms.
   Versterking: 0–5 (Laag blijven om ruis te minimaliseren).
   Intensiteit: 60%–80%.
   Z-stack stapgrootte: standaard: 8–12 μm.
   OPMERKING: Voor gladde, gezonde samengestelde ogen (bijv. w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4) kunnen staplengtes tot 15 μm voldoende zijn, omdat de continue en regelmatige kromming minder optische doorsneden vereist. Voor ruwe of ongelijke oogfenotypes die worden gekenmerkt door abrupte topologische veranderingen zijn echter kleinere stapgroottes nodig (zo laag als 5 μm) om fijne structurele details vast te leggen en de nauwkeurigheid van de EDF-reconstructie aanzienlijk te verbeteren.
6. Z-Stack definitie en capture
   1. Voor Zijaanzicht: Stel het Z-stackbereik in van de orbitale rand (Start) tot het centrum van ommatidien (Einde) met een stapgrootte van 8–12 μm.
   2. Voor frontaal zicht: Stel de scherpstelknop aan totdat de buitenste contour van de samengestelde ogen net scherp is (Start). Stel de focus in de tegenovergestelde richting aan totdat de centrale ocelli (gele eenvoudige ogen) bovenop het hoofd net scherp zijn (End). Klik op Einde zetten.
   3. Klik op Stop Live om de preview te bevriezen.
   4. Klik op Start Acquisitie. Het systeem zal automatisch de gedefinieerde brandpuntsvlakken vastleggen en een hoge-resolutie, volledig gefocust beeld synthetiseren.
7. Bestandsopslaan:
   1. Na voltooiing van de EDF-reconstructie klik je op het Opslaan-icoon in de software-interface (of ga je naar Bestand > Opslaan als).
   2. Selecteer de bestemmingsmap, voer de aangewezen bestandsnaam in en klik op Opslaan.
   3. Let op dat elke acquisitie drie verschillende afbeeldingsbestanden genereert: a. Raw/kanaalafbeelding (grijswaarden);b. Kleurenvoorvertoog afbeelding; c. EDF samengestelde afbeelding (met het achtervoegsel "_Composite")
      OPMERKING: Zowel de raw/kanaalafbeelding als de EDF-composietafbeelding moeten worden behouden voor analyse en documentatie

Results

De volledige experimentele pijplijn, van monsterverzameling tot beeldverwerving, wordt samengevat in Figuur 1. De efficiëntie van het aangepaste protocol wordt aangetoond door het creëren van hoogdichtheidsmonsterarrays. Zoals weergegeven in Figuur 2A kunnen 20–30 verdoofde vliegen in een rasterpatroon worden gerangschikt op één enkel omgekeerd tapeplatform. Oriëntatiemarkeringen op de niet-klevende uiteinden van de tape zorgen ...

Discussion

Het Drosophila-compoundoog dient als een krachtige fenotypische weergave voor genetische screening, waarbij waarneembare veranderingen in ooggrootte, ruwheid of pigmentatie ^2,3,8 vaak wijzen op verstoringen in fundamentele signaalroutes zoals Hippo ^5,6 of Hedgehog⁷. De efficiëntie van dergelijke schermen ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Koolstofdioxide (CO2) gasfles	Lokaal leverancier	N/A
CO2 anesthesiegeweer	T&L	DG-08
Digitale microscoopcamera	Leica	DMC6200
Fijne pincetten	VETUS	MOS-167B
Schuimpluggen	Dongpeng	N/A
Beeldverwerkingssoftware (LAS X)	Leica	3.7.1
Beeldverwerkingssoftware (FIJI/ImageJ)	NIH	Open source
LED Dome verlichting	Leica	LED5000 HDI
LED Gooseneck verlichter	cossim	LG-10
Gemotoriseerde stereomicroscoop	Leica	M205 FCA
Objectieflens	Leica	1.0x PlanApo NA0.2
Pneumatische voetpedaalklep	DELIXI	FV-320
Standaard Drosophila kweekbuisjes	LAIBOER	2424951
Standaard Drosophila voedingsmedium	N/A	Cornmeal-agar-molasses
Standaard glazen microscoopglaasjes	Citotest	10127101P-G
Standaard stereomicroscoop	Nikon	SMZ745
Witte papiermaskeringstape	UBWIN	25mm breedte