Ruimtelijk opgeloste, geïntegreerde single-cell multiomic profilering van het transcriptoom en epigenomische doelen in bevroren weefselsecties

Summary

Deze studie presenteert een ruimtelijk Trekker–CUT&Tag multioomprotocol dat directe ruimtelijke streepjescoding van een weefselsectie combineert met enkelcel-multioomanalyse. Deze aanpak maakt ruimtelijk opgeloste enkelcelprofilering van genexpressie en de histon H3K27ac-modificatie mogelijk gelijktijdig, wat mechanistische inzichten biedt in genregulatie in de context van weefselmicroanatomie.

Abstract

Ruimtelijke multiomische technologieën gecombineerd met enkelcelprofilering bieden ongekende mogelijkheden om de moleculaire en cellulaire architectuur van complexe weefsels te verduidelijken. Het combineren van ruimtelijke streepjescoding van kernen binnen individuele cryosecties die zijn voorbereid uit weefselblokken ingebed in een medium met optimale snijtemperatuur (OCT) vriesmedium met single-cell multiomic assays in een eenvoudige en efficiënte workflow kan de annotatie en ruimtelijk opgeloste moleculaire analyse van cellen in weefseltypen vergemakkelijken. Deze studie rapporteert een ruimtelijke splitsing onder targets & tagmentation (CUT&Tag) multioombenadering die tegelijkertijd histon H3K27ac-modificatie en genexpressie in een enkele bevroren hersensectie profielt. Na ruimtelijke streepjescoding worden enkele kernen geïsoleerd en onderworpen aan CUT&Tag, gecombineerde vangst van getagmenteerde DNA's, RNA's en ruimtelijke barcodes, bibliotheekvoorbereiding en sequencing. De workflow genereert ruimtelijk geannoteerde epigenomische en transcriptomische profielen van dezelfde kernen, waardoor de multiomische informatie aan anatomische coördinaten kan worden toegewezen. Het integreren van epigenomische informatie met ruimtelijke transcriptomische data verhoogt de nauwkeurigheid van celtype-identificatie en onthult ruimtelijk georganiseerde regulatieprogramma's en cel-cel interacties binnen intacte weefsels.

Introduction

Ruimtelijke biologie is een snel ontwikkelend vakgebied dat de locatie, organisatie en interacties van moleculen, cellen en weefsels binnen hun natuurlijke omgevingen in kaart brengt ^1,2,3. In tegenstelling tot bulk- of conventionele single-cell methoden die weefseldissociatie vereisen en leiden tot verlies van positionele informatie, behouden ruimtelijke benaderingen de fysieke coördinaten van analyten of cellen/kernen, waardoor direct onderzoek mogelijk is naar hoe weefselarchitectuur cellulaire identiteit, intercellulaire communicatie en biologische functie beïnvloedt 4,5,6,7 . Hoewel ruimtelijke transcriptomiek en ruimtelijke proteomica momenteel de meest gebruikte modaliteiten zijn, breidt het vakgebied zich snel uit naar ruimtelijke multi-omic profilering ^3,8,9. Het co-profileren van genexpressie en epigenomische toestanden binnen hetzelfde weefsel is bijzonder krachtig, omdat het transcriptieoutput direct koppelt aan regulerende mechanismen—zoals de toegankelijkheid van chromatine en histonenmodificaties—die de genactiviteit aansturen en bekend staan om variërend tussen ruimtelijke domeinen 10,11,12. Geïntegreerde ruimtelijke epigenoom- en transcriptoomanalyse zal dus cruciale inzichten bieden in hoe regulerende programma's de cellulaire identiteit en weefselorganisatie vormgeven.

Verschillende ruimtelijke multiomische strategieën zijn ontwikkeld om gelijktijdige epigenomische en transcriptomische profilering mogelijk te maken. Deterministische streepjescoding in weefselsequencing (DBiT-seq) maakt gebruik van microfluïdische kanalen om ruimtelijke barcodes direct of indirect te leveren, via het stempelen met gelblokken, aan weefselsecties, waardoor de ruimtelijke annotatie van analyten mogelijk is. Deze benadering faciliteert ruimtelijk opgeloste co-profilering van epigenomische en transcriptomische kenmerken 12,13,14,15. De Slide-tag-methode, gecommercialiseerd als het Takara Trekker-platform, introduceert ruimtelijke barcodes direct in intact weefsel vóór dissociatie, waardoor ruimtelijk geïndexeerde kernen kunnen worden verwerkt met standaard single-cel workflows en computationeel terug naar hun oorspronkelijke weefselcoördinaten¹⁶ worden geprojecteerd. Daarentegen gebruikt de ruimtelijke assay voor toegankelijke chromatine, cellijnen en genexpressie met sequencing (SPACE-seq) een target-out-strategie waarbij poly(A)-staarte epigenetische targets en mRNA's worden vastgelegd op een poly-dT capture-sequentie in ruimtelijke transcriptomica-tegels¹⁷.

Cleavage under targets & tagmentation (CUT&Tag) is een krachtig hulpmiddel voor het in kaart brengen van interacties tussen DNA en histon of niet-histon eiwitten uit^{monsters met} extreem lage input. CUT&Tag is afhankelijk van Tn5-transposase-gemedieerde chromatinefragmentatie en DNA-tagging (tagmentatie), waarbij antilichaamgeleide, eiwit A-geconjugeerde Tn5 wordt gebruikt voor locus-specifieke splitsing en moleculaire tagging. Hoewel de conventionele CUT&Tag-assay meerdere incubatie- en wasstappen omvat, werd een vereenvoudigde en gestroomlijnde CUT&Tag-workflow gebruikt om de efficiëntie van CUT&Tag te verbeteren in downstream single-cell multiome toepassingen¹⁹.

Figuur 1: Overzicht van workflow en kwaliteitscontrole van de ruimtelijke Trekker–CUT&Tag multioomassay. (A) Schematisch diagram van de ruimtelijke Trekker–CUT&Tag multioom-workflow. Een coronale sectie van versbevroren muizenhersenweefsel wordt op een Trekker-ruimtetegel gemonteerd en onderworpen aan ruimtelijke barcodering. Na weefsellyse worden kernen geïsoleerd en beoordeeld op opbrengst en kwaliteit. Ongeveer 50.000 kernen worden gebruikt voor H3K27ac CUT&Tag, en getagmenteerde kernen worden onderworpen aan single-cell barcoding door gebruik te maken van 10x Genomics Chromium Multiome gelkralen na tellen. Enkelcel-barcoded DNA wordt voorgeamplificeerd en verdeeld in twee fracties. De geïndexeerde CUT&Tag-bibliotheek wordt direct gegenereerd door index PCR. Voor genexpressie en ruimtelijke barcodebibliotheken wordt pre-amplified DNA verder geamplificeerd en op grootte geselecteerd. Fragmenten die overeenkomen met typische cDNA-groottes worden gebruikt voor de voorbereiding van genexpressiebibliotheek, terwijl kortere DNA-fragmenten worden gebruikt om de ruimtelijke barcodebibliotheek te genereren. Bibliotheken worden gesequenced en in kaart gebracht volgens de richtlijnen van 10x Genomics en Curio Trekker. De verwachte experimentele tijdlijn wordt links aangegeven. (B) Sleutelkwaliteitscontrolepunten (QC) en kritieke overwegingen gedurende de workflow. Nuclei QC omvat de beoordeling van opbrengst, intactheid, aggregatie en het puingehalte. Pre-sequencing QC omvat evaluatie van DNA-grootteverdelingen en primer-dimercontaminatie voor alle bibliotheken. De specificiteit van CUT&Tag-bibliotheken wordt beoordeeld met kwantitatieve PCR (qPCR), waarbij de verrijking van doelgenomische regio's over de achtergrond wordt gemeten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze studie presenteert een ruimtelijke Trekker CUT&Tag multioom-assay die tegelijkertijd histon H3K27ac-modificatie profielt die geassocieerd wordt met actieve cis-regulerende elementen en genexpressie in versbevroren weefselsecties. Dit protocol biedt stapsgewijze procedures voor Takara Trekker ruimtelijke barcoding, weefseldissociatie en kernisolatie, kerntelling en kwaliteitscontrole, low-input CUT&Tag-profilering van de H3K27ac-modificatie, het vastleggen van moleculaire doelen op 10x Genomics enkelcel Multiome gelkorrels, en bibliotheekvoorbereiding. De workflow werd aangetoond met behulp van een coronale sectie van muizenhersenweefsel. In tegenstelling tot de standaard 10x Genomics Multiome-workflow, waarbij de toegankelijkheid van chromatine wordt gemeten door een assay voor transposase-toegankelijke chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq), vervangt dit protocol CUT&Tag-afgeleide DNA-fragmenten door ATAC-fragmenten, waardoor directe ondervraging van histonmodificatielandschappen bij enkelcelresolutie mogelijk is. Om Trekker-ruimtelijke barcodes te koppelen aan 10x Genomics single-cel barcodes, worden poly(A)-tailed ruimtelijke barcodes en mRNA-transcripten vastgelegd door de poly-dT-sequenties van de Multiome gelkorrels, terwijl CUT&Tag DNA-fragmenten worden vastgelegd door de spacersequenties. Deze dual-capture strategie maakt gelijktijdig het terugvinden van epigenomische, transcriptomische en ruimtelijke informatie uit dezelfde enkele kernen mogelijk. Voor zover wij weten is dit de eerste ruimtelijke multiomische workflow die barcode-in Trekker-ruimtelijke annotatie direct integreert met een single-cell multiome-assay om de genoombrede verspreiding van een histoonmarkering en het transcriptoom te co-profileren. De resulterende ruimtelijk opgeloste multiomlandschappen, die H3K27ac-bezettings- en genexpressiegegevens integreren, maken projectie van enkelcelprofielen terug naar hun oorspronkelijke weefselcoördinaten mogelijk en bieden een directe link tussen epigenomische regulatiemechanismen en transcriptieprogramma's in relatie tot de intacte weefselarchitectuur.

Protocol

Volwassen muizen werden geëuthanaseerd door middel van CO2-inhalatie (IACUC #: A48315-15-R24) vóór weefseloogst. De hersenen werden volledig verwijderd na de sagittale craniotomie en het verwijderen van de gehalveerde calvaria. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Het monteren van een weefselsectie op de Trekker-barcodetegel voor ruimtelijke streepjescoderen

1. Bereid het volgende voor voordat je begint.
   1. Evenwicht het optimale weefselblok met snijtemperatuur (OCT) in een cryostaat vóór het snijden. Bereid de buffers voor UV-splijting, weefseldissociatie en nuclei-isolatie.
      OPMERKING: De optimale temperatuur voor het doorsnijden kan variëren afhankelijk van het weefseltype.
   2. Voor kernisolatie koel je de centrifuge vooraf met schandelemmers voor 1,5 mL buizen tot 4 °C. Koel een 12-put plaat met een Trekker O-ring op ijs voor.
   3. Stel de UV-meter in op de maximale stroomlimiet (1,2 A) en maximale vermogen.
2. Noteer de ruimtelijke barcode-tegel-ID (bijvoorbeeld U0001_001) van de Trekker-tegel die gebruikt moet worden.
   OPMERKING: Elke Trekker-tegel bevat unieke barcodecoördinaten. De tegel-ID is vereist om het juiste bestand op te halen voor ruimtelijke barcodemapping van de sequencinggegevens.
3. Snijd het weefsel in een sneep. Coronale doorsnede van 25 μm dikte op de benaderende positie van bregma -1 mm werd uitgevoerd bij −18 °C (Figuur 1A).
   OPMERKING: De dikte kan worden verhoogd tot 30 μm bij het werken met weefsels met lage cellulariteit.
4. Plaats het gedeelte (of het interessegebied) op de ruimtelijke tegel en smelt het door voorzichtig een vinger op de bodem van het glas te leggen.
   VOORZICHTIG: Controleer indien nodig de procedures via de kwaliteitscontrolemetingen van de kernen met behulp van de Trekker trainingstegel.
5. Gebruik een pincet om de tegel van de doorzichtige lijm te verwijderen en plaats deze in een put van een 12-put weefselkweekplaat op ijs bovenop de Trekker O-Ring. Pipetteer onmiddellijk 30 μL Trekker UV-spleiningsbuffer op de tegel, waarbij het hele weefsel bedekt is met buffer.
6. Plaats de UV-lamp (1,2 A-stand) direct boven de put op de plaat. Illuminate 1 minuut om de barcodes los te maken terwijl alles op ijs blijft.
   VOORZICHTIG: Draag beschermende UV-bril wanneer je met de UV-lamp werkt.
7. Zet de UV-lamp uit en laat de tegel 7,5 minuten op ijs incuberen. Tijdens de incubatie neem je een Trekker waskamer van 10 x 10 en vul je kamers 1 en 2 met 400 μL koude Trekker nuclei wash buffer voor een monster op ijs.
8. Pak de tegel voorzichtig op met een pincet zonder de kralen aan te raken en was de tegel in kamer 1 gedurende 5 seconden. Was de tegels in kamer 2 gedurende 5 seconden. Plaats de tegel voorzichtig in een put in de 12-put plaat op ijs. De weefselsectie moet blauw gekleurd zijn en goed zichtbaar zijn.

2. Weefseldissociatie en kernisolatie

1. Doseer 175 μL Invent Minute-buffer A gericht op het weefsel. Herhaal dit nog 3 keer tot een totaal van 700 μL. Richt je bij elke afgifte op verschillende delen van de tegel om het hele weefsel van de tegel los te maken.
   OPMERKING: Voorkom besmetting van de parel door het krassen van de tegels of door het loslaten van de kralen.
2. Blijf het weefsel van de tegel losmaken door de buffer van de zijkant van de put te aspireren en deze te doseren op de door weefsel bedekte delen van de tegel, waarbij de plaat zoveel mogelijk op ijs blijft. Herhaal dit totdat er geen weefsel meer op de tegel achterblijft. Zodra al het weefsel van de tegel is verwijderd, gebruik je voorzichtig een pincet om de tegel naar een lege put te brengen.
3. Gebruik een P1000-pipet om kernen mechanisch te dissociëren met herhaalde trituratie in dezelfde put. Herhaal dit tot er geen zichtbare weefselbrokken meer overblijven.
4. Breng de kernsuspensie voorzichtig over in een filterpatroon met een verzamelbuis uit de Invent Minute single-nucleus isolatiekit voor neuronale weefsels/cellen. Incubeer de buis met de dop open bij –20 °C gedurende 10 minuten. Sluit de filterpatroon af en centrifugeer onmiddellijk op 13.000 x g gedurende 30 seconden in een gekoelde microcentrifuge.
5. Gooi de filtercartridge weg en stil de pellet opnieuw door voorzichtig 10–20 keer te pipetten. Draai de buis in de voorgekoelde centrifuge met schommelende bakken op 600 x g gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 200 μL Trekker buffer C.
6. Voeg 1 mL koude Invent Minute buffer B toe aan een 1,5 mL laagbindende Eppendorf-buis en leg zorgvuldig 200 μL kernsuspensie bovenop de Minute buffer B door langzaam tegen de wand van de buis te persen om vermenging van de lagen te voorkomen. Draai de buis in de voorgekoelde centrifuge met schommelbakjes op 500 x g gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de melkachtige laag en supernatant.
7. Suspenseer de kernen voorzichtig opnieuw met 24 μL Trekker-buffer C en ga vervolgens over tot kwaliteitscontrolemetingen van geïsoleerde kernen.

Figuur 2: Kwaliteitscontrolebeoordeling van geïsoleerde kernen. Representatieve brightfield-beelden van geïsoleerde kernen uit muizenhersenweefsel. De kernen werden gekleurd met 0,4% trypanblauw en afgebeeld met 40x vergroting om de nucleaire integriteit en de aanwezigheid van puin te beoordelen. De kernpreparaat links toont hoogwaardige, intacte kernen die geschikt zijn voor downstream assays, terwijl de preparaat rechts kwalitatief slechte kernen met gedeeltelijk gelyseerde weefselaggregaten illustreert. Beschadigde of gescheurde kernen worden aangegeven door gevulde pijlpunten. De schaalbalk is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Tellen en QC-metingen van geïsoleerde kernen

1. Voor het tellen van kernen neem je 2 μL van de kernsuspensie in 8 μL Trekker-buffer C. Meng 10 μL van de verdunde kernsuspensie met 10 μL AO/PI-kleuringsoplossing. Tel de kernen volgens de instructies van de fabrikant.
2. Om de kwaliteit van geïsoleerde kernen te beoordelen, verdun 2 μL van de kernsuspensie tot 8 μL 4% trypanblauwe oplossing. Onderzoek de kernen onder de fluorescentiemicroscoop met 40x vergroting, waarbij wordt gecontroleerd op de intacte morfologie van het kernmembraan en de inhoud van niet-kernafval (Figuur 2).
3. Ga onmiddellijk door met een single-nucleus CUT&Tag multioom (CUT&Tag op H3K27ac + genexpressie) assay.
   VOORZICHTIG: Ga door met de volgende stappen als er minstens 30.000 hoogwaardige kernen zijn teruggevonden.

4. CUT&Tag-tagmentatie op geïsoleerde kernen

1. Bereid CUT&Tag incubatiebuffer I. Leg hem op ijs.
2. Bereid primaire antistoffen en transposase voor die geactiveerd worden door guidance (TAG) enzymconjugaat.
   1. Voeg 46,23 μL CUT&Tag incubatiebuffer I en 1,33 μL TAG-enzym toe aan een PCR-buis op ijs. Voeg een geoptimaliseerde hoeveelheid primaire antistoffen toe aan de buis. Meng langzaam door 10 keer te pipetten.
      OPMERKING: 2,43 μL anti-H3K27ac antilichaam werd aan de reactie toegevoegd. De antistofbatch werd gevalideerd voor bulk- en in-situ CUT&Tag-assays. Optimaliseer de hoeveelheid antilichaam voor TAG-enzymconjugatie door bulkassay. Het optimale antilichaam werd gedefinieerd als de laagste concentratie die maximale signaal-ruis-eenheid bereikte, zoals bepaald door qPCR bij positieve en negatieve doelloci.
   2. Draai kort rond en plaats de buis op een 18 rpm rotator. Broed 1 uur op kamertemperatuur. Het resulterende mengsel kan vooraf worden gemaakt en tot 5 uur op ijs worden gelegd.
      OPMERKING: Antilichaam-TAG-incubatie kan gelijktijdig worden uitgevoerd met of voorafgaand aan de nuclei-isolatie.
3. Incubatie van geïsoleerde kernen met antilichaam-TAG enzym geconjugeerd.
   1. Draai de buis (stap 2.7) met geïsoleerde kernen in de voorgekoelde centrifuge met swing-buckets op 500 x g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren en laat ~5 μL supernatant achter.
   2. Voeg 25 μL CUT&Tag incubatiebuffer I toe (stap 4.1) en suspendeer opnieuw door voorzichtig 10 keer te pipetteren. Breng de kernen over naar de buis (stap 4.2.2) met antilichaam-TAG-conjugaat met dezelfde pipetpunt. Meng voorzichtig door 10 keer te pipetteren en plaats de buis op een zachte rotator.
   3. Broed 's nachts uit bij 4 °C.
4. De volgende dag (dag 2) bereid je 1X CUT&Tag-kernbuffer voor en leg je op ijs.
5. CUT&Tag-tagmentatie
   1. Haal de reactiebuis (stap 4.3.3) uit de rotator. Voeg 5 μL CUT&Tag-activator toe en breng het mengsel over in een nieuwe 1,5 mL buis. Incubeer 1 uur bij 37 °C op de ThermoMixer bij 550 rpm.
   2. Haal de buis eruit, voeg 20 μL CUT&Tag quench buffer toe en meng de reactie voorzichtig door 10 keer te pipetten. Centrifugeer de buis in de voorgekoelde centrifuge met schandlepels op 500 x g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant zonder de kernpellet te verstoren, zodat ~5 μL supernatant onderin de buis achterblijft.
   3. Voeg 100 μL 1X CUT&Tag-kernbuffer toe en suspendeer de kernen opnieuw door voorzichtig 10 keer te pipetten. Draai de buis in de voorgekoelde centrifuge met schommelbakjes op 500 x g gedurende 10 minuten. Verwijder 85 μL van het supernatant, waarbij ~15 μL overblijft. Suspendeer de kernen opnieuw door voorzichtig en langzaam 10 keer te pipetten.
6. Tellen van getagmenteerde kernen en bepaling van het doelgetal
   1. Voeg 1 μL van de getaggeerde kernsuspensie toe aan 9 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing en meng met 10 μL AO/PI-kleuringsoplossing. Tel getagmenteerde kernen zoals beschreven in Stap 3.1.
   2. Gebruik 1,6x het doelaantal kernen voor de generatie van enkelcel GEM om het gewenste aantal gevangen kernen te verkrijgen.
   3. Draai de buis in de voorgekoelde centrifuge met schompelbakjes op 500 x g gedurende 10 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant, waarbij een eindvolume van 8 μL overblijft.

5. Single-cel barcodering van getagmenteerde kernen en pre-amplificatie van barcode-DNA's

1. Voeg 7 μL ATAC-buffer B toe aan 8 μL van de getagmenteerde kernen met het verwachte aantal targetingkernen voor uw experiment.
   OPMERKING: Zie meer details over reactie-opstellingen en werking van het Chromium X-instrument in het "GEM Generation & Barcoding" protocol van de Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit User Guide (CG000338 Rev G).
2. GEM-generatie en barcode met het Chromium X-instrument.
   1. Voeg 60 μL GEM mastermix toe aan de buis met getaggeerde kernen. Meng voorzichtig door te pipetteren en laad op rij 1 van de Chromium Next GEM chip J.
   2. Bereid single-cell multiome gelkralen voor en laad 50 μL gelkralen op rij 2. Geef 45 μL verdeelde olie in de putten in rij 3.
   3. Plaats de gemonteerde chip J met de pakking in de tray van het Chromium X-instrument en laat het instrument draaien.
   4. Aspirateer langzaam 100 μL GEMs uit de laagste punten van de herstelputten in de bovenste rij 3. Doeer langzaam GEMs in de nieuwe PCR-buis op ijs met de pipettoppen tegen de zijwanden van de putjes.
   5. Incubeer de verzamelde GEMs in een thermische cycler (dekseltemperatuur op 50°C) met het volgende protocol: één cyclus van 37 °C gedurende 45 minuten, één cyclus van 25 °C voor 30 minuten, en 4 °C voor de opvang.
   6. Voeg 5 μL afschrikmiddel toe en meng langzaam door 10 keer te pipetten.
3. Opruiming van post-GEM-incubatie en DNA-zuivering
   OPMERKING: Zie meer details in het "Post GEM Incubation Cleanup"-protocol van de Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit User Guide (CG000338 Rev G).
   1. Voeg 125 μL roze gekleurd herstelmiddel toe aan de buis bij kamertemperatuur en draai de buis voorzichtig 10 keer om. Centrifugeer kort. Verwijder en gooi langzaam 125 μL herstelmiddel/scheidingsolie (roze) van de onderkant van de buis weg en weg.
   2. Voeg 200 μL Dynabeads cleanup-mix toe aan de buis en meng door 10 keer te pipetten. Incubeer 10 minuten op kamertemperatuur. Plaats de buis op de magnetische standaard totdat de oplossing vrij is. Verwijder het supernatant.
   3. Voeg 300 μL vers bereid 80% ethanol toe aan de pellet. Incubeer 30 seconden en verwijder het supernatant. Voeg 200 μL 80% ethanol toe aan de pellet, incubeer 30 seconden en verwijder het supernatant. Draai de buis kort rond en plaats hem op de magneet. Verwijder het resterende supernatant.
   4. Haal de buis van de magneet. Voeg onmiddellijk 50,5 μL elusieoplossing toe I. Meng door te pipetteren en incubeer 1 minuut op kamertemperatuur. Draai kort rond en plaats de buis op de magneet totdat de oplossing verdwijnt. Breng 50 μL schoongemaakte oplossing over in een nieuwe buis.
   5. DNA-zuivering door paramagnetische kralen
      1. Voeg 90 μL paramagnetische kralen (1,8X) toe aan elk monster en meng door grondig te pipetten. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur. Draai kort rond en plaats de buis op de magneet totdat de oplossing verdwijnt. Verwijder het supernatant.
      2. Voeg 200 μL 80% ethanol toe aan de pellet. Incubeer 30 seconden. Verwijder de ethanol. Herhaal dit nog een keer.
      3. Draai kort rond en plaats de buis op de magneet. Verwijder het resterende supernatant.
      4. Haal de buis van de magneet. Voeg 46,5 μL buffer EB toe en meng door te pipetteren. Incubeer 2 minuten op kamertemperatuur. Draai hem en leg hem op de magneet totdat de oplossing vrij is.
      5. Breng 46 μL gezuiverd DNA over naar een nieuwe buis.
4. Pre-amplificatie van barcode-DNA's.
   1. Voeg 54 μL pre-amplificatiemix toe aan elke monster. Pipet, meng en centrifugeer kort.
   2. Incubeer in een thermische cycler (dekseltemperatuur op 105 °C) met het volgende protocol: één cyclus van 72 °C gedurende 5 minuten; één cyclus van 98 °C voor 3 minuten; in totaal 7 cycli van 98 °C voor 20 seconden, 63 °C voor 30 s, 72 °C voor 1 minuut; één cyclus van 72 °C voor 1 minuut; en een houdruimte op 4 °C. Bewaar het 's nachts op 4 °C.
   3. De volgende dag (Dag 3) zuiver je voorgeamplificeerde DNA's met paramagnetische kralen (1,6X) zoals beschreven in stap 5.3.5. Voeg 80,5 μL buffer EB toe aan de buis en meng door te pipetten. Incubeer 2 minuten op 22 °C (kamertemperatuur). Draai kort rond en plaats de buis op de magneet totdat de oplossing verdwijnt.
   4. Breng 80 μL van voorversterkte DNA's over naar een nieuwe buis. Gebruik 40 μL om de CUT&Tag-bibliotheek te genereren. Bewaar de resterende pre-amplified DNA's bij 4 °C.
      OPMERKING: 40 μL van de resterende pre-amplified DNA's zal later worden gebruikt voor genexpressie en ruimtelijke barcodebibliotheken.

6. Bibliotheekvoorbereiding voor CUT&Tag, genexpressie en ruimtelijke barcodes

1. Voorbereiding van de scCUT&Tag-bibliotheek
   1. Breng 40 μL pre-amplified DNA's over naar een nieuwe buis en voeg 60 μL monsterindex PCR-mix toe. Meng door te pipetteren en kort te spinnen.
   2. Incubeer in een thermische cycler (dekseltemperatuur bij 105 °C) met het volgende protocol: één cyclus van 98 °C gedurende 45 seconden; in totaal 12 cycli van 98 °C voor 20 seconden, 67 °C voor 30 seconden, 72 °C voor 20 seconden; één cyclus van 72 °C voor 1 minuut; 4 °C voor hold).
      OPMERKING: Het optimale cyclusgetal is afhankelijk van het startaantal kernen en het histonmerk dat wordt geprofileerd. Twaalf versterkingscycli werden gebruikt voor het H3K27ac-merk in het experiment.
   3. Dubbele grootteselectie en DNA-zuivering door paramagnetische kralen (0,6X, 1,55X)
      1. Voeg 60 μL paramagnetische kralen (0,6X) toe aan elk monster en meng door grondig te pipetten. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur. Draai kort rond en plaats de buis op de magneet totdat de oplossing verdwijnt.
      2. Breng 150 μL supernatant over naar een nieuwe buis. Voeg 95 μL paramagnetische kralen (1,55X) toe aan elk monster (supernatant) en meng door te pipetteren. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur. Plaats de buis op de magneet totdat de oplossing vrij is. Verwijder het supernatant.
      3. Voeg 300 μL 80% ethanol toe aan de pellet. Wacht 30 seconden. Verwijder de ethanol. Herhaal het nog een keer. Draai kort rond en plaats de buis op de magneet. Verwijder het resterende supernatant.
      4. Haal de buis van de magneet. Voeg 20,5 μL buffer EB toe aan de buis en meng door te pipetten. Incubeer 2 minuten op kamertemperatuur. Draai hem en leg hem op de magneet totdat de oplossing vrij is.
      5. Breng 20 μL gezuiverde en geïndexeerde CUT&Tag-bibliotheken over naar nieuwe buizen.
2. QC-controle voor de CUT&Tag-bibliotheek
   1. Analyse van de DNA-grootteverdeling in de bibliotheek
      1. Meng 1 μL gezuiverd bibliotheek-DNA met 1 μL low TE-buffer.
      2. Meng het verdunde DNA met de Fragment Analyzer werkbuffer en gebruik het instrument met de High-sensitivity HS NGS Fragment Kit (1-6000bp) (Figuur 3A).
   2. Beoordeel de verrijking van een H3K27ac-positief genomisch locus voordat je sequenceert en in kaart brengt.
      1. Meng 1 μL gezuiverd bibliotheek-DNA met 4 μL nucleasevrij water. Gebruik 1 μL verdund bibliotheek-DNA voor qPCR-metingen voor drie genomische loci.
         OPMERKING: Voor H3K27ac CUT&Tag werd de positieve primer ontworpen vanuit de Actb-TSS-locus, terwijl primers die zich richtten op de T1-TSS en een intergene locus dienden als negatieve controles²⁰ (Tabel 1). Muizengenomisch DNA werd gebruikt als inputcontrole om de PCR-efficiëntie te normaliseren (Figuur 3B).
      2. Bereid in totaal 20 μL van het reactiemengsel voor als volgt: 1 μL verdund bibliotheek-DNA, 2 μL 10 μM primermix, 10 μL 2X SYBR Green Master Mix en 7 μL nucleasevrij water.
      3. Voer de voorbereide qPCR-plaat uit op het CFX Opus Real-Time PCR-systeem met het juiste cyclusprogramma voor SYBR Green-detectie.
3. Amplificatie van cDNA's en ruimtelijke barcode-DNA's.
   1. Breng 35 μL pre-amplified DNA (stap 5.4.4) over naar een nieuwe buis en voeg 65 μL cDNA-amplificatie-reactiemix toe. Meng door te pipetteren en kort te spinnen. De primer die wordt gebruikt voor cDNA- en ruimtelijke barcode-DNA-amplificatie is Feature cDNA Primers 2.
   2. Incubeer in een thermische cycler (dekseltemperatuur bij 105 °C) met het volgende protocol: één cyclus van 98 °C gedurende 45 seconden; in totaal 8 cycli van 98 °C voor 20 seconden, 63 °C voor 30 seconden, 72 °C voor 1 minuut; één cyclus van 72 °C voor 1 minuut; 4 °C voor de wacht.
      OPMERKING: Het optimale cyclusnummer moet worden bepaald op basis van het celtype, RNA-inhoud en het startaantal kernen. In dit experiment werden 8 amplificatiecycli uitgevoerd.
   3. Zuivering van geamplificeerde cDNA's
      1. Dubbele grootteselectie en DNA-zuivering door paramagnetische kralen (0,6X, 2,0X) zoals beschreven in stap 6.1.3. Voeg 60 μL paramagnetische kralen (0,6X) toe aan elk monster en meng door te pipetteren. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur. Plaats de magneet op de oplossing totdat hij schoon is.
      2. Overbreng en bewaar 75 μL supernatant in een nieuwe buis zonder de pellet te verstoren. Houd het op kamertemperatuur.
         VOORZICHTIG: Gooi het supernatant niet weg, want het bevat DNA dat verrijkt is voor kortere fragmenten en gebruikt zal worden om de ruimtelijke barcodebibliotheek te genereren.
      3. Verwijder het resterende supernatant uit de pellet. Was twee keer met 80% ethanol zoals beschreven in stap 6.1.3.
      4. Voeg 40,5 μL buffer EB toe aan de buis en meng door te pipetteren. Incubeer 2 minuten op kamertemperatuur. Draai kort en plaats het op de magneet totdat de oplossing vrij is.
      5. Breng 40 μL geamplificeerde cDNA's over naar een nieuwe buis. Bewaar het op ijs om een geïndexeerde genexpressiebibliotheek voor te bereiden.
         OPMERKING: Deze fractie verrijkt de DNA's voor de typische grootte van cDNA's.
   4. Zuivering van versterkte ruimtelijke barcode-DNA's
      1. Voeg 70 uL paramagnetische kralen (2,0X) toe aan 75 μL van het eerder opgeslagen supernatant (stap 6.3.3.2. Meng door te pipetteren en kort te spinnen. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur. Plaats de buis op de magneet totdat de oplossing vrij is. Verwijder het supernatant.
      2. Was twee keer met 80% ethanol zoals beschreven in stap 6.1.3.
      3. Voeg 40,5 μL buffer EB toe aan de buis en meng door te pipetteren. Incubeer 2 minuten op kamertemperatuur. Draai kort en plaats het op de magneet totdat de oplossing vrij is.
      4. Breng 40 μL aan geamplificeerde en gezuiverde ruimtelijke barcode-DNA's over in een nieuwe buis. Sla op bij −20 °C voor de volgende generatie van de geïndexeerde ruimtelijke barcodebibliotheek.
   5. Analyse van cDNA-groottes door de Fragment Analyzer. Meng 1 μL geamplificeerde cDNA's met 1 μL low TE-buffer. Voer de verdunde DNA's uit met de Fragment Analyzer zoals beschreven in stap 6.2.1.
   6. Voorbereiding van een geïndexeerde genexpressiebibliotheek
      1. Breng 10 μL amplified cDNAs over (stap 6.3.3.5) naar een nieuwe buis. Voeg 25 μL buffer EB en 15 μL fragmentatiemengsel toe. Meng door te pipetten op ijs. Draai kort en plaats de buis in de voorgekoelde thermische cycler bij 4 °C.
      2. Incubeer in een thermische cycler (dekseltemperatuur bij 65 °C) door het volgende protocol te starten: één cyclus van 32 °C gedurende 5 minuten; één cyclus van 65 °C gedurende 30 minuten; 4 °C voor de wacht.
      3. Dubbele grootteselectie en DNA-zuivering door paramagnetische kralen (0,6X, 0,8X) zoals beschreven in Stap 6.1.3. Voeg 50,5 μL buffer EB toe en meng door te pipetteren. Incubeer 2 minuten op kamertemperatuur. Draai kort en plaats het op de magneet totdat de oplossing vrij is.
      4. Breng 50 μL monster over in een nieuw buisje. Voeg 50 μL adapterligatiemengsel toe en meng door te pipetteren. Draai kort rond. Incubeer in een thermische cycler (dekseltemperatuur op 30 °C) met het volgende protocol: één cyclus van 20 °C gedurende 15 minuten en 4 °C voor de opslag.
      5. DNA-zuivering door paramagnetische kralen (0,8X) zoals beschreven in Stap 5.3.5. Voeg 30,5 μL buffer EB toe en meng door te pipetteren. Incubeer 2 minuten op kamertemperatuur. Draai kort en plaats het op de magneet totdat de oplossing vrij is. Breng 30 μL van het monster over naar een nieuwe buis.
      6. Index PCR van genexpressiebibliotheek. Voeg 50 μL versterkermix toe en voeg 20 μL van een individuele dual index TT-set A toe aan elke sample.
      7. Incubeer in een thermische cycler (dekseltemperatuur bij 105 °C) met het volgende protocol: één cyclus van 98 °C gedurende 45 seconden; in totaal 11 cycli van 98 °C voor 20 seconden, 54 °C voor 30 seconden, 72 °C voor 20 seconden; één cyclus van 72 °C voor 1 minuut; 4 °C voor de wacht.
         OPMERKING: Het optimale cyclusaantal moet worden bepaald op basis van het celtype, RNA-inhoud en het startaantal kernen. In dit experiment werden in totaal 11 versterkingscycli gebruikt.
      8. Dubbele grootteselectie en DNA-zuivering door paramagnetische kralen (0,6X, 0,8X) zoals beschreven in Stap 6.1.3. Voeg 35,5 μL buffer EB toe aan de buis en meng door te pipetten. Incubeer 2 minuten op kamertemperatuur. Draai kort en plaats het op de magneet totdat de oplossing vrij is.
      9. Breng 35 μL gezuiverde en geïndexeerde genexpressiebibliotheek over naar een nieuwe buis.
4. Analyse van de DNA-grootteverdeling in de genexpressiebibliotheek. Meng 1 μL bibliotheek-DNA's met 1 μL low TE-buffer. Voer de verdunde DNA's uit zoals beschreven in stap 6.2.1. (Figuur 3A).
5. Voorbereiding van een geïndexeerde ruimtelijke barcodebibliotheek
   1. Bereid in totaal 100 μL van de monsterindex PCR-mix voor als volgt: 50 μL Amp Mix (uit GEM-X Single-Cell 3' Feature Barcode Kit), 25 μL Buffer EB, 20 μL primer uit Dual Index Plate TT Set A, en 1 μL gezuiverde ruimtelijke barcode-DNA's (stap 6.3.4.4) verdund in 4 μL EB-buffer.
   2. Incubeer in een thermische cycler (dekseltemperatuur bij 105 °C) met het volgende protocol: één cyclus van 98 °C gedurende 45 seconden; in totaal 7 cycli van 98 °C voor 20 seconden, 54 °C voor 30 seconden, 72 °C voor 20 seconden; 72 °C gedurende 1 minuut; 4 °C voor de wacht.
   3. DNA-zuivering door paramagnetische kralen (1,2X) zoals beschreven in Stap 5.3.5. Voeg 35,5 μL EB-buffer toe aan de buis en meng door te pipetteren. Incubeer 2 minuten op kamertemperatuur. Plaats de buis op de magneet totdat de oplossing helder is.
   4. Breng 35 μL gezuiverde en geïndexeerde ruimtelijke barcodebibliotheek-DNA's over naar een nieuwe buis. Bewaar tot 72 uur bij 4 °C of bij −20 °C voor langdurige opslag.
6. Controleer de verdeling van DNA-groottes in de geïndexeerde ruimtelijke barcodebibliotheek. Meng 1 μL gezuiverd bibliotheek-DNA met 1 μL low TE-buffer. Voer de verdunde DNA's uit met de Fragment Analyzer zoals beschreven in Stap 6.2.1 (Figuur 3A).

Figuur 3: Kwaliteitscontrolebeoordelingen van geïndexeerde bibliotheken. (A) Grootteprofielen in geamplificeerde DNA's en geïndexeerde bibliotheken. DNA wordt geanalyseerd door een fragmentanalyzer om de DNA-kwaliteit en de verdeling van de grootte te beoordelen. Hieronder staan representatieve profielen voor de geïndexeerde CUT&Tag-bibliotheek, geamplified DNA dat wordt gebruikt voor genexpressie en de voorbereiding van ruimtelijke barcodebibliotheek, de geïndexeerde genexpressiebibliotheek en de geïndexeerde ruimtelijke barcodebibliotheek. (B) De CUT&Tag-bibliotheek wordt geanalyseerd door qPCR om de verrijking van een H3K27ac-positief genomisch gebied (d.w.z. ACTB) te beoordelen over het H3K27ac-negatieve achtergrondsignaal (d.w.z. T1 en een intergenische locus). Het vouwverschil tussen positieve/negatieve regio's wordt berekend als verrijking²¹. Een vouwverrijking groter dan 10 wordt als ideaal beschouwd in deze assay²⁰. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Volgorde van de bibliotheken

1. Sequencen de Trekker ruimtelijke barcodebibliotheek op een diepte van 5.000 leesparen per gevangen kern.
2. Sequencen de H3K27ac CUT&Tag-bibliotheek op een diepte van 25.000 leesparen per gevangen kern.
3. Sequencen de genexpressiebibliotheek op een diepte van minstens 20.000 leesparen per gevangen kern.

8. Bio-informatica en data-analyse

1. Procesgenexpressie en CUT&Tag-reads met Cell Ranger ARC v2.0.2 met --min-atac-count=100 en --min-gex-count=1000. Integreer Cell Ranger ARC-uitvoeren met Trekker-barcodeinformatie via Trekker-pijplijn v1.3.0 met standaardparameters om ruimtelijke posities toe te wijzen.
2. Voer kwaliteitscontrole uit met Signac. Cellen die aan een van de volgende criteria voldeden, werden uit downstream analyse verwijderd: voor CUT&Tag ≥ totale fragmententelling 1.000.000 of ≤ 100, en TSS-verrijking ≤ 2; voor genexpressie ≥ het totale UMI-aantal 100.000 of ≤ 1.000, en het totale aantal gedetecteerde genen ≥ 10.284 of ≤ 200.
3. Verwijder doublets met scDblFinder voor genexpressie en AMULET voor CUT&Tag. Cellen die aan een van de volgende criteria voldeden, werden geclassificeerd als dubbeltjes: (1) scDblFinder-score ≥ 0,6; (2) scDblFinder-score ≥ 0,3 en AMULET ≤ 0,01; en (3) in clusters met een hoog percentage dubbeltjes.
4. Normaliseer genexpressiegegevens met behulp van LogNormalize en CUT&Tag-gegevens met TF-IDF. Bereken RNA PCA- en CUT&Tag LSI-embeddings, waarbij gebruik wordt gemaakt van LSI-dimensies 2–50 voor de chromatinemodaliteit. Bouw een gewogen dichtstbijzijnde buurgraaf met behulp van FindMultiModalNeighbors en genereer UMAP-embeddings op basis van de multimodale burengraaf.
5. Annoteer post-QC Trekker-data met behulp van Seurat labeltransfer op basis van FindTransferAnchors en een PCA-projectiekaartstrategie met standaardparameters. scRNA-seq-gegevens uit de ABC Atlas (versie 20230630) werden als referentie gebruikt. Celtypevoorspellingen die niet overeenkwamen met de bekende weefselanatomie werden verwijderd tijdens handmatige curatie.
   OPMERKING: De scripts voor bio-informatica-analyse zijn beschikbaar op GitHub: https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

Met behulp van een coronale doorsnede (25 μm dikte, ongeveer 70% dekking van een 10 × 10 mm ruimtelijke tegel) van versbevroren muizenhersenweefsel, leverde de hier beschreven workflow consequent 50.100 hoogwaardige kernen op (SD = 12.200, n = 8), voldoende voor downstream single-cell multiomic profiling (Figuur 1). Na Trekker ruimtelijke streepjescoding van het weefselgedeelte werden kernen geïsoleerd met milde weefseldissociatie en verder gezuiverd met de Invent single-nucleus isolatiekit. Deze procedure resulteerde in minimale reststof en lage niveaus van nucleaire aggregatie, waardoor kernpreparaten werden geproduceerd die geschikt zijn voor eencel-assays. Representatieve afbeeldingen van de geïsoleerde kernen zijn te zien in Figuur 2.

Voor downstream single-nucleus assays, waaronder CUT&Tag multioomprofilering (CUT&Tag + genexpressie), werden hier doorgaans ongeveer 50.000 kernen verwerkt. Om het nucleaire herstel te maximaliseren werd een vereenvoudigd, gestroomlijnd low-input CUT&Tag-protocol geïmplementeerd door gebruik te maken van directe antilichaam–pA/Tn5 targeting en tagmentatie, waardoor incubatietijden en wash-stappen¹⁹ werden geminimaliseerd. Met deze methode werden ongeveer 25.000 getaggmenteerde kernen teruggewonnen, wat overeenkomt met een gemiddelde opbrengst van 48,3% (SD = 6,1, n = 3). Deze kernen werden vervolgens gebruikt voor single-cell barcoding met de 10x Genomics Chromium Multiome gelkralen. Voor GEM-generatie werden ongeveer 15.000 kernen getarget, met de verwachting om na kwaliteitsfiltering ~10.000 ruimtelijk geïndexeerde kernen terug te winnen. Op basis van Trekker ruimtelijke barcode-decodering kon 81,3% van de kernen (SD = 9, n = 3) uit de single-cell dataset met vertrouwen worden toegewezen aan ruimtelijke posities binnen de tegel.

De ruimtelijke Trekker–CUT&Tag multiome workflow genereert drie geïndexeerde bibliotheken: CUT&Tag, genexpressie en ruimtelijke barcodebibliotheken. Voorversterkt barcode-DNA werd verdeeld in twee fracties, elk gebruikt voor bibliotheekvoorbereiding volgens de vangchemie van doelwitten op de gelkralen. CUT&Tag-bibliotheken werden direct geamplifiseerd uit pre-amplified DNA en toonden fragmentgrootteverdelingen die kenmerkend zijn voor CUT&Tagmentatie, overeenkomend met nucleosomvrije en nucleosomale DNA's (Figuur 3A). De bibliotheek toonde een goede verrijking van de H3K27ac-positieve Actb-locus boven de H3K27ac-negatieve genomische loci^20,21 (d.w.z. 68-voudig verschil, hoger dan de eerder vastgestelde 10-voudige grens voor chromatine-immunoprecipitatie-sequencinganalyse van H3K27ac²⁰) (Figuur 3B). Voor genexpressie en ruimtelijke barcodebibliotheken werd pre-amplified DNA eerst geamplificeerd volgens het 10x Genomics cDNA-amplificatieprotocol en vervolgens gescheiden in twee fracties op basis van fragmentgrootte met behulp van paramagnetische parelzuivering. De geïndexeerde ruimtelijke barcodebibliotheek werd voorbereid uit de fractie die voor kortere fragmenten was verrijkt en vertoonde een scherpe piek bij de verwachte fragmentgrootte. Genexpressiebibliotheken vertoonden een karakteristieke grootteverdeling die gecentreerd was rond geamplificeerde cDNA-fragmenten (Figuur 3A).

Figuur 4: Enkelcel- en ruimtelijke representatie van de ruimtelijke Trekker–CUT&Tag multioomtest in muizenhersenweefsel. (A) Identificatie van celtypen door middel van enkelcelanalyse. Uniform manifold approximation and projection (UMAP) plots tonen geannoteerde celpopulaties afgeleid van alleen H3K27ac CUT&Tag, alleen genexpressie en de geïntegreerde multioomdataset (CUT&Tag + genexpressie). (B) Ruimtelijke representatie van ruimtelijke Trekker–CUT&Tag multioomgegevens. Kernen uit de geïntegreerde multioomdataset worden toegewezen aan ruimtelijke coördinaten met behulp van Trekker-barcodes, waarmee anatomisch georganiseerde verdelingen van celtypen over het hersenweefsel van de muis worden onthuld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Sequencing en mapping van CUT&Tag- en genexpressiebibliotheken werden uitgevoerd met Cell Ranger ARC v2.0.2 volgens de richtlijnen van 10x Genomics, terwijl ruimtelijke barcodebibliotheken werden verwerkt met Trekker v1.3.0 volgens de aanbevelingen van Takara Trekker. De voorgestelde enkelcel ATAC-seq mapping opties werden toegepast op CUT&Tag-bibliotheken. Datasets met enkele kernen werden gegenereerd voor alleen CUT&Tag, alleen genexpressie en het gecombineerde multioom (CUT&Tag + genexpressie). Cellen met totaal UMI's voor ofwel CUT&Tag (≥ 1.000.000 of ≤ 100) of genexpressie (≥ 100.000 of ≤ 1000) werden gefilterd met behulp van Signac²². Dubbelvoorspelling werd uitgevoerd door een combinatie van scDblFinder²³ voor genexpressie en AMULET²⁴ voor CUT&Tag. Cellen die aan een van de volgende criteria voldeden, werden verwijderd: 1) scDblFinder.score > 0,6; 2) scDblFinder.score tussen 0,3 en 0,6, en amulet.score < 0,01. Celtype-annotatie werd uitgevoerd met Seurat's FindTransferAnchors²⁵ , gebaseerd op de referentiegegevens²⁶ uit de Allen Brain Cell Atlas. Voor de genexpressiebibliotheek in deze studie was het mediane UMI-aantal per cel 15.378, en het mediane aantal genen per cel 4.378. Voor de CUT&Tag-bibliotheek werden 11.860 cellen gedetecteerd, met een mediaan van 6.631 hoogwaardige fragmenten per cel en een TSS-verrijkingsscore van 7,66. Voor de Trekker ruimtelijke barcodebibliotheek kreeg 92,43% van de kernen ruimtelijke posities toegewezen en 51,54% van de kernen werd toegewezen aan één ruimtelijke locatie. Ruwe sequencinggegevens en verwerkte gegevens van secundaire analyses zijn beschikbaar via GEO onder toegangsnummer GSE327406. Het laatste post-QC geannoteerde Seurat-object is beschikbaar op Zenodo onder accessienummer 19475899. Representatieve UMAP-embeddings met celtype-annotaties zijn weergegeven in Figuur 4A. Door enkelcel-barcodes te koppelen aan ruimtelijke barcodes, werden individuele kernen teruggegeven aan hun ruimtelijke locaties binnen het weefsel om een ruimtelijke kaart te genereren (Figuur 4B). Deze kaart komt nauw overeen met de anatomische kenmerken die in aangrenzende secties zijn waargenomen en sluit aan bij een coronale hersensectie in de Allen Brain^{Atlas 27}, een standaardreferentie voor de hersenanatomie van muizen. Gezamenlijke analyse van ruimtelijke genexpressie en H3K27ac-profielen met enkelcelresolutie maakte de identificatie van belangrijke hersenceltypen mogelijk en onthulde anatomisch georganiseerde patronen van cellulaire distributie over het weefselsegment.

Discussion

Dit protocol beschrijft een ruimtelijke Trekker–CUT&Tag multiome workflow die ruimtelijke barcoding, low-input CUT&Tag profilering van H3K27ac, gelijktijdige vangst van meerdere moleculaire doelen op de 10x Genomics single-cell multiome gelkorrels en downstream library preparation voor Illumina-sequencing integreert. Door ruimtelijke indexering te koppelen aan single-cell epigenomische en transcriptomische uitlezingen, pakt deze aanpak een fundamentele beperking aan van conventionele single-cell multiome assays, die geen native tissue context hebben. Deze studie toont met succes de haalbaarheid aan van ruimtelijke CUT&Tag-multioomprofilering (H3K27ac CUT&Tag + genexpressie) en legt een basis voor ruimtelijke co-profilering van genexpressie en regulerende doelen zoals histonmarkeringen en chromatine-geassocieerde eiwitten.

Strenge kwaliteitscontrole in meerdere fasen van de workflow is essentieel voor een succesvolle implementatie van deze workflow (Figuur 1). Hoewel de hier beschreven procedure begint met stappen na de doorsnede, is de kwaliteit van de weefseldoorsnede zelf cruciaal voor optimale resultaten. De dikte van de sectie moet worden aangepast op basis van weefseltype en verwachte cellulariteit. Tijdens weefseldissociatie en kernisolatie is het maximaliseren van kernopbrengst terwijl de kernintegriteit behouden blijft, cruciaal voor de algehele prestaties van Trekker-gebaseerde single-cell multiome assays. Een lage kernopbrengst kan het gevolg zijn van suboptimale weefseldissociatie, inefficiënte kernisolatie of onvoldoende doorsnededikte. Slechte nucleaire integriteit kan ontstaan door overmatige mechanische verstoring, langere verwerkingstijden of overlyse. Kernisolatie vormt een belangrijk probleemoplossingspunt voor de succesvolle implementatie van de op Trekker gebaseerde single-cell multiome workflow. Daarom wordt weefselspecifieke optimalisatie van het nuclei-isolatieprotocol sterk aanbevolen voordat de Trekker-gebaseerde single-cell multiome assay wordt gestart. Geïsoleerde kernen moeten kwantitatief en kwalitatief worden beoordeeld. Kerntelling met nucleaire kleurstoffen geeft een schatting van de opbrengst, terwijl microscopisch onderzoek de integriteit, aggregatie en aanwezigheid van niet-nucleair puin van het kernmembraan kan evalueren. Na de voorbereiding van de bibliotheek moeten alle bibliotheken worden beoordeeld op fragmentgrootteverdelingen en het ontbreken van adapterdimeren. Voor CUT&Tag-bibliotheken moet de verrijking van doelgenomische regio's over de achtergrond worden geëvalueerd met kwantitatieve PCR, wat een vroege indicatie geeft van assayspecificiteit en algehele bibliotheekkwaliteit vóór sequencing. Kwaliteitscontrole na sequencing is even belangrijk voor nauwkeurige interpretatie van ruimtelijke multioomgegevens. Meetwaarden zoals mapping rates, fragmententellingen per kern, transcriptiestartlocatie-verrijking, fragment-in-piekscores voor CUT&Tag, gencomplexiteit en leesdiepte per cel moeten worden geëvalueerd volgens de aanbevolen richtlijnen van 10x Genomics en Takara Trekker. Gezamenlijke beoordeling van deze metrieken over zowel epigenomische als transcriptomische modaliteiten maakt het mogelijk technische artefacten te identificeren en zorgt voor betrouwbare integratie van ruimtelijke, epigenomische en transcriptie-informatie.

Hoewel de haalbaarheid van de op Trekker gebaseerde barcode-in benadering gecombineerd met een single-cell CUT&Tag multioomtest in deze studie wordt aangetoond, kent de beschreven aanpak ook beperkingen. Zo is de methode momenteel beperkt tot versbevroren weefsel, en de haalbaarheid ervan is alleen aangetoond voor het profileren van een enkele histonmodificatie (H3K27ac) in één weefseltype (muizenhersenen) zonder biologische replicaten. Bovendien is de aanpak afhankelijk van twee eigen commerciële platforms (Takara Trekker en 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). Verdere evaluatie van diverse weefseltypen en aanvullende epigenetische markeringen zal nodig zijn om de bredere toepasbaarheid, prestaties, generaliseerbaarheid en reproduceerbaarheid van deze technologie te beoordelen.

Samenvattend toont het hier gepresenteerde ruimtelijke Trekker–CUT&Tag multioomprotocol de mogelijkheid aan voor ruimtelijk opgeloste co-profilering van epigenomische en transcriptomische kenmerken. Door ruimtelijke barcoding te combineren met gevestigde single-cel multioomchemie, maakt het mechanistisch onderzoek van genregulatie binnen intacte weefselarchitectuur mogelijk en biedt het een krachtig platform voor toekomstige toepassingen in de ruimtelijke biologie. Opmerkelijke potentiële toepassingen zijn onder meer de beoordeling van de impact van diverse experimentele en omgevingsprikkels op de epigenetische controle van genexpressie in specifieke celtypen—bijvoorbeeld, de effecten van zenuwstimulaties kunnen worden geanalyseerd in specifieke neurontypen in het centrale en perifere zenuwstelsel, of de impact op nabijgelegen cellen van infiltrerende pro- en ontstekingsremmende immuuncellen kan worden aangetoond bij ontstekingsziekten en kankers.