Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Deze studie integreert netwerkfarmacologie en in vivo-experimenten om de mogelijke effecten van de Yougui-pil bij de behandeling van prostatitis te onderzoeken. Netwerkfarmacologische analyse en YGP-behandeling in een rattenprostatitismodel suggereerden dat de therapeutische effecten van YGP mogelijk verband houden met de regulatie van ontstekingsreacties, wat aangeeft dat YGP ontstekingsremmende effecten uitoefent bij prostatitis.
Prostatitis is een veelvoorkomende urologische aandoening met beperkte behandelingsmogelijkheden. Yougui Pill (YGP) heeft een potentiële therapeutische waarde getoond, vooral bij ontstekingsgerelateerde aandoeningen. Deze studie had als doel de effecten ervan te evalueren en mogelijke onderliggende mechanismen te onderzoeken. Actieve componenten van YGP werden gescreend met TCMSP aan de hand van orale biobeschikbaarheid (OB ≥ 30%) en geneesmiddelgelijkheidscriteria (DL ≥ 0,18), en de bijbehorende doelwitten werden verzameld. Prostatitis-gerelateerde doelen werden verkregen via GeneCards, en overlappende doelen werden geanalyseerd met behulp van eiwit-eiwitinteractie (PPI)-netwerken en de Verrijking van de Kyoto Encyclopedia of Genen en Genomen (KEGG). In totaal werden 126 actieve verbindingen en 208 potentiële doelwitten geïdentificeerd, waarvan 180 overlappende doelwitten geassocieerd zijn met prostatitis. PPI-analyse identificeerde TP53, IL6, AKT1, TNF en IL1B als belangrijke hubgenen. KEGG-verrijking suggereerde betrokkenheid van ontstekingsgerelateerde routes, waaronder IL-17, TNF, MAPK en PI3K-Akt signaalwegen. Een rattenmodel van prostatitis werd vastgesteld door intraprostatische injectie van carrageenan. Histologische onderzoeken en metingen van tumornecrose factor-alpha (TNF-α) en interleukine-6 (IL-6) werden uitgevoerd om de therapeutische effecten te beoordelen. De behandeling van YGP verbeterde de prostaathistopathologie en verlaagde TNF-α en IL-6 niveaus op zowel eiwit- als mRNA-niveau. Deze bevindingen suggereren dat YGP ontstekingsremmende effecten heeft bij prostatitis, terwijl de specifieke moleculaire mechanismen nog verder moeten worden gevalideerd.
Prostatitis is een aandoening waarbij de prostaatklier ontstoken raakt met zwelling en irritatie1. Het is goed voor ongeveer 25% van de wereldwijde klinische urologische ontmoetingen2. De National Institutes of Health (NIH) hebben prostatitis ingedeeld in vier classificaties: acute bacteriel, chronische bacteriële, chronische prostatitis/chronisch bekkenpijnsyndroom (CP/CPPS) en asymptomatische prostatitis3. Hiervan is CP/CPPS de meest voorkomende vorm en wordt nauw geassocieerd met aanhoudende ontstekingen en immuunontregeling. Ondanks vooruitgang in het begrijpen van de ontstekingsaard van prostatitis, blijven de huidige therapeutische strategieën beperkt, vooral voor niet-bacteriële subtypes 4,5. Antibiotica worden vaak gebruikt in de klinische praktijk; hun werkzaamheid bij niet-bacteriële prostatitis is echter zeer omstreden6. Andere behandelingen, variërend van α-blokkers tot niet-steroïde ontstekingsremmers (NSAID's), richten zich voornamelijk op symptoomverlichting maar vertonen vaak suboptimale uitkomsten, met niet verwaarloosbare risico's op gastro-intestinale stoornissen, orthostatische hypotensie, enzovoort 7,8,9,10. Deze beperkingen benadrukken de noodzaak van alternatieve therapeutische benaderingen die ontsteking bij prostatitis effectief kunnen moduleren.
Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) kan een breder scala aan therapeutische voordelen bieden met een gunstiger veiligheids- en verdraagzaamheidsprofiel11. Yougui Pill (YGP), een klassieke formule die is gedocumenteerd in Jingyue Quanshu, wordt al eeuwenlang empirisch gebruikt om nier-yang aan te vullen en gerelateerde aandoeningen te verlichten12. Eerdere studies hebben aangetoond dat sommige bestanddelen ontstekingsremmende werking hebben 13,14,15,16. Klinisch bewijs suggereert dat YGP de symptomen van prostatitis effectief kan verlichten, hoewel het onderliggende mechanismeonduidelijk blijft. Netwerkfarmacologie dient als een krachtige, integratieve benadering die systeembiologie en farmacologie combineert om de complexe mechanismen van traditionele geneeskunde te onthullen18. Er werd verondersteld dat YGP ontstekingsremmende effecten kan uitoefenen door meerdere doelwitten en ontstekingsgerelateerde routes te moduleren. Deze voorspellingen werden verder geëvalueerd met een in vivo prostatitismodel, waarbij prostatitis werd geïnduceerd door carrageenan-injectie. Na het opzetten van het model werden dieren behandeld met YGP. Prostaatweefsels werden verzameld voor histopathologisch onderzoek via hematoxyline- en eosinekleuring (HE), evenals voor kwantitatieve beoordeling van ontstekingsmarkers met enzymgebonden immunosorbentassay (ELISA) en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Beijing University of Chinese Medicine (BUCM-2024110107-4103).
Verzameling van actieve bestanddelen en doelwitten
YGP bestaat uit Rehmannia glutinosa, Aconitum carmichaelii, Cinnamomum cassia, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Cuscuta chinensis, Angelica sinensis, Eucommia ulmoides, Cervi Cornus Colla en Lycium barbarum. Deze kruidennamen werden ingevoerd in de farmacologiedatabase en analyseplatform (TCMSP) van traditionele Chinese geneeskundesystemen om hun verbindingen op te halen. Actieve verbindingen werden gescreend met orale biobeschikbaarheid (OB ≥ 30%) en geneesmiddelgelijkheidscriteria (DL ≥ 0.18) 19,20,21. Overeenkomstige doelen van elke verbinding werden verkregen uit TCMSP en gestandaardiseerd naar gensymbolen met behulp van de UniProt-database. Prostatitis-gerelateerde doelen werden uit de GeneCards-database gehaald met "prostatitis" als trefwoord, en genen met een relevantiescore hoger dan het gemiddelde werden geselecteerd voor opname in de studie.
Constructie van het regulerende netwerk van YGP tegen prostatitis
De kruising tussen YGP-gerelateerde en prostatitis-gerelateerde doelen werd geïdentificeerd en gedefinieerd als een reeks potentiële therapeutische doelen. Deze doelen werden geïmporteerd in Cytoscape (versie 3.9.1) om een netwerk van verbinding-doelziekte te construeren. Netwerktopologieanalyse werd uitgevoerd met de CytoHubba-plugin, en sleutelcomponenten werden geïdentificeerd op basis van maximale cliquecentraliteit (MCC) waarden22.
Analyse van eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerken
De overlappende doelen werden geïmporteerd in de STRING-database (versie 11.5), waarbij het organisme werd ingesteld op Homo sapiens. De minimaal vereiste interactiescore werd ingesteld op ≥ 0,7, en losgekoppelde knooppunten werdenverborgen 23. De interactiegegevens werden geëxporteerd in TSV-formaat en gevisualiseerd in Cytoscape. Hubgenen werden verder geïdentificeerd met behulp van de CytoHubba-plugin op basis van graadcentraliteit.
KEGG-route- en GO-verrijkingsanalyse
De gedeelde doelen werden geüpload naar het Metascape-platform voor de Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) routeanalyse. De invoer- en analysesoorten werden ingesteld op Homo sapiens. Er werd een KEGG-routeverrijkingsanalyse uitgevoerd. Paden werden verder gefilterd op basis van hun relevantie voor prostatitis, zoals bepaald door gepubliceerde literatuur en database-annotaties. De overige paden werden gerangschikt volgens hun Log P-waarden. De top verrijkte KEGG-paden werden gevisualiseerd met behulp van bubble plots.
Moleculaire koppeling
De belangrijkste doelwitten werden geselecteerd uit het PPI-netwerk op basis van graadcentraliteit, en de actieve verbindingen werden geïdentificeerd uit het YGP-prostatitis-regulatienetwerk op basis van MCC-waarden voor latere dockinganalyse. Eiwitstructuren werden verkregen uit de AlphaFold Protein Structure Database in PDB-formaat, en ligandstructuren werden gedownload van TCMSP in mol2-formaat24. Moleculaire koppeling werd uitgevoerd met behulp van het CB-Dock2 online platform25. Voor het koppelen werden eiwitstructuren automatisch voorbewerkt door watermoleculen te verwijderen, waterstofatomen toe te voegen en ontbrekende residuen aan te vullen. Bindingsaffiniteiten werden geregistreerd en heatmaps werden gegenereerd met GraphPad Prism (versie 10.1.2). De driedimensionale structuren van ligand-eiwitcomplexen met de laagste Vina-scores werden gevisualiseerd met ChimeraX, en tweedimensionale interactiediagrammen werden gegenereerd met LigPlus.
YGP waterige extractbereiding
De kruidencomponenten van YGP werden bereid volgens de traditionele formuleringsverhouding, waaronder 24 g van de verwerkte wortel van Rehmannia glutinosa (Shudihuang), 6 g van de bewerkte laterale wortel van Aconitum carmichaelii (Fuzi), 6 g van de schors van Cinnamomum cassia (Rougui), 12 g van de rhizoom van Dioscorea tegenover (Shanyao), 9 g van de vrucht van Cornus officinalis (Shanzhuyu), 12 g van het zaad van Cuscuta chinensis (Tusizi), 12 g van het bewerkte gewei-gelatine van Cervi Cornus Colla (Lujiaojiao), 12 g van de vrucht van Lycium barbarum (Gouqi), 9 g van de wortel van Angelica sinensis (Danggui), en 12 g van de schors van Eucommia ulmoides (Duzhong). Alle kruiden behalve Aconitum carmichaelii en Cervi Cornus Colla werden 30 minuten geweekt in 6 keer hun totale gewicht gedestilleerd water, terwijl Aconitum carmichaelii apart werd geweekt in 6 keer het gewicht van gedestilleerd water. Aconitum carmichaelii werd eerst gedecoceerd met een elektrisch verwarmingsapparaat gedurende 1 uur, waarna de resterende kruiden, met uitzondering van Cervi Cornus Colla, werden toegevoegd en twee keer 1 uur per cyclus gedecoceerd. Cervi Cornus Colla werd vervolgens gesmolten in een waterbad bij 60–70 °C totdat het volledig was opgelost en in het extract verwerkt. Na afkoeling werd het skok gefilterd door dubbellaags gaas, gealiquoteerd, 48 uur bevroren bij -20 °C en gelyofilieerd om een poederextract te verkrijgen.
Diermodel en experimenteel ontwerp
Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (8 weken oud, 200–220 g) werden gehuisvest onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden met een 12 uur licht/donker cyclus en vrije toegang tot voedsel en water. Na 1 week van acclimatisatie werden ratten willekeurig verdeeld in drie groepen (n = 6 per groep): controlegroep, model en YGP-groep. Chronische prostatitis werd geïnduceerd door intraprostatische injectie van 3% carrageenanoplossing26. Kort werden ratten verdoofd met isoflurane (3–4% voor inductie en 1,5–2% voor onderhoud), en werd er een middenlijnincisie in de buik gemaakt om de prostaat bloot te leggen. In totaal werd 25 μL 3% carrageenaanoplossing in elke ventrale kwab van de prostaat geïnjecteerd. De controlegroep kreeg alleen een intraprostatische injectie van normale zoutoplossing (fysiologische zoutoplossing). Postoperatieve penicilline (2,5 × 105 U/kg) werd 3 dagen intramusculair toegediend.
YGP gelyofilieerd extractpoeder werd uit het aftrek bereid en gereconstitueerd in 0,9% steriel normaal zout om een uniforme suspensie voor orale gavage te verkrijgen (10,54 g/kg/dag). Ratten in de YGP-groep kregen orale toediening van YGP-extract (10 mL/kg), terwijl controle- en modelgroepen een gelijkwaardig volume van 0,9% steriel normaal zoutoplossing kregen. Na 4 weken werden ratten verdoofd met pentobarbitalnatrium (50 mg/kg, intraperitoneale injectie), en werden prostaatweefsels verzameld na het offeren volgens ethische richtlijnen.
Histopathologisch onderzoek
Prostaatweefsels werden 24 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde, gedehydrateerd met gegradueerde ethanol (75% alcohol voor 4 uur, 85% alcohol voor 2 uur, 90% alcohol voor 2 uur, 95% alcohol voor 1 uur, absolute ethanol voor 1 uur), vrijgemaakt in xyleen en ingebed in paraffine. De secties (4–5 μm) werden vervolgens onderworpen aan HE-kleuring volgens standaardprocedures27. Kort gezegd werden secties gedeparaffiniseerd, gerehydrateerd, gekleurd met hematoxyline, gedifferentieerd en tegengekleurd met eosine. Na uitdroging en montage werden de secties onder een lichtmicroscoop bekeken voor histopathologische evaluatie.
Histopathologische ontsteking werd geëvalueerd met behulp van een semi-kwantitatief scoresysteem gebaseerd op inflammatoire celinfiltratie, fibroblastproliferatie, acinaire morfologie en secretiestatus. Inflammatoire celinfiltratie werd gescoord als 0 (geen infiltratie), 2 (milde infiltratie), 4 (matige infiltratie) en 6 (ernstige infiltratie). Fibroblastproliferatie werd beoordeeld als 0 (afwezig), 1 (mild), 2 (matig) en 3 (ernstig). De morfologie van de acinaire kleur werd geëvalueerd als 0 (groot acinair lumen), 1 (matig verkleinde lumengrootte), 2 (duidelijk verminderde lumengrootte) en 3 (acinaire occlusie of verdwijning). De secretiestatus werd beoordeeld als 0 (overvloedige secretie), 1 (matige secretie), 2 (schaarse secretie) en 3 (afwezige secretie). De totale histopathologische score werd berekend als de som van alle vier de parameters, waarbij hogere scores duiden op ernstiger prostaatweefselletsel en ontstekingvan 28.
ELISA
Prostaatweefsels (100 mg) werden afgespoeld met ijskoude fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS) en gehomogeniseerd in lysisbuffer aangevuld met proteaseremmers. De homogenaten werden geïncubeerd bij 4 °C gedurende 30–120 minuten en gecentrifugeerd op 5000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om de supernatanten op te vangen. De eiwitniveaus van TNF-α en IL-6 werden gemeten met ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant. Standaarden en monsters werden toegevoegd aan 96-wellplaten en geïncubeerd bij 37 °C, gevolgd door sequentiële incubatie met biotinyleerde antilichamen en enzymconjugaaten. Na het wassen werd de substraatoplossing toegevoegd voor kleurontwikkeling en werd de reactie beëindigd met de stopoplossing. De absorptie werd gemeten op 450 nm met een microplaatlezer. Cytokinenconcentraties werden berekend op basis van standaardcurves.
qRT-PCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit prostaatweefsel met behulp van een kolomgebaseerde methode en gekwantificeerd door de absorptie te meten bij 260 en 280 nm om de zuiverheid te beoordelen. RNA-monsters werden omgekeerd getranscribeerd in cDNA bij 42 °C gedurende 15 minuten met behulp van een reverse transcriptiekit. qRT-PCR werd uitgevoerd met een thermocycler onder de volgende omstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 10 seconden en 60 °C gedurende 30 seconden. De primersequenties die in deze studie zijn gebruikt, staan vermeld in Aanvullende Tabel 1. Fluorescentiesignalen werden verzameld tijdens de annealing/extensiestap. De expressieniveaus van TNF-α en IL-6 werden genormaliseerd naar het interne referentiegen GAPDH. Relatieve genexpressie werd berekend met behulp van de 2−ΔΔCt-methode .
Statistische analyse
Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism-software (versie 10.1.2). De gegevensverdeling werd vóór de analyse beoordeeld op normaliteit. Verschillen tussen meerdere groepen werden geanalyseerd met eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's post hoc-test voor meervoudige vergelijkingen. Een waarde van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Identificatie van bioactieve componenten en doelgenen
In totaal werden 126 bioactieve componenten in YGP geïdentificeerd die aan de criteria voldeden (OB ≥ 30% en DL ≥ 0,18). overeenkomend met 208 voorspelde doelgenen. De GeneCards-database leverde 9.845 genen op die geassocieerd zijn met prostatitis. Venn-analyse onthulde 180 overlappende genen tussen de voorspelde targets van YGP en genen gerelateerd aan prostatitis, wat suggereert dat deze gedeelde targets mogelijk...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Prostatitis wordt pathologisch gedefinieerd door een verhoogde aanwezigheid van ontstekingscellen binnen het prostaatparenchym of mesenchym 28,29. In een studie met meer dan 5 miljoen Koreaanse mannen die negen jaar lang werden gevolgd, bevestigden Kim et al. via multivariate analyse dat prostatitis het risico op het ontwikkelen van prostaatkanker significant verhoogt30. De huidige klinische behandeling bl...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs melden geen belangenconflicten in dit werk.
De auteurs erkennen dankbaar de financiële steun uit de Fundamentele Onderzoeksfondsen voor de Centrale Universiteiten (2022-JYB-JBZR-037).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-3L | |
| AlphaFold Protein Structure Database | AlphaFold Protein Structure Database | https://alphafold.ebi.ac.uk/ | |
| BeyoFast SYBR Green qPCR Mix (2X) | Beyotime | D7260 | |
| Bioinformatics online platform | Bioinformatics online platform | http://www.bioinformatics.com.cn/ | |
| Carrageenan | OriLeaf | S30559 | |
| CB-DOCK2 | CB-DOCK2 | http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php | |
| Cytoscape | Cytoscape | https://cytoscape.org/ | |
| GeneCards | GeneCards | https://www.genecards.org/ | |
| Hematoxylin en Eosin (H&E) Staining Kit | Beyotime | C0105S | |
| Metascape | Metascape | https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1 | |
| Neutral Balsam | Servicebio | WG10004160 | |
| Paraffinewas (voor inbedding) | Servicebio | RP-15 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Epizyme | GRF101 | |
| Rat IL-6 ELISA Kit | Beyotime | PI328 | |
| Rat TNF-α Kit | Beijing 4A Biotech Co., Ltd | CRE0003 | |
| RNAeasy Animal Long RNA Isolation Kit with Spin Column | Beyotime | R0026 | |
| STRING | STRING | https://string-db.org/ | |
| TCMSP | TCMSP | https://www.tcmsp-e.com/#/database | |
| Uniprot | Uniprot | https://www.uniprot.org/ |