Een kopgemonteerd optisch transparant schedelvenster (HOTS) voor diepe transcraniële beeldvorming van de muiscortex

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een kopgemonteerd optisch transparant schedelvenster (HOTS) gebaseerd op een geoptimaliseerde tweestapsprocedure voor schedelverwijdering. Deze benadering levert een zeer transparante schedel op, waardoor tweefotonenbeeldvorming van de volwassen muishersenschors tot dieptes tot ~800 μm mogelijk is.

Samenvatting

Hoogwaardige tweefotonenbeeldvorming van de volwassen muishersenschors wordt sterk beperkt door lichtverstrooiing vanuit de schedel, wat signalen verzwakt en de beelddiepte in vivo beperkt. Hoewel er schedelreinigingsmethoden zijn ontwikkeld om optische toegang tot de cortex via de intacte schedel te bieden, wordt hun praktische werking beperkt door beperkte opruimtijd en suboptimale zuiveringscocktails. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het implementeren van een kopgemonteerd optisch transparant schedelvenster (HOTS). Bij deze aanpak werd een op het hoofd gemonteerde muts gebruikt om heldere oplossingen over de schedel te houden, waardoor langdurige verdoving of fysieke fixatie werd voorkomen en langdurig schedelvrij (enkele uren) in wakkere, vrij handelende muizen mogelijk konden worden. Daarnaast werd een tweestapsverwijderingsprocedure uitgevoerd met reagentia (HOTS-S1: 10% wt/v EDTA, 15% wt/v D-mannose, 10% wt/v sulfolaan, 0,5% wt/v Tween 20; HOTS-S2: 70% wt/v D-mannose, 5% wt/v sulfolaan, 0,5% wt/v Tween 20) geoptimaliseerd door systematische chemische screening. Wij bieden een stapsgewijs protocol dat bestaat uit blootstelling en stabilisatie van de schedel, het maken en monteren van de hoofdgemonteerde kap, het toedienen en verversen van reinigingsreagentia, en de daaropvolgende voorbereiding van beeldvorming. Bij muizen van 6 weken oud (~20 g) produceert het HOTS-protocol routinematig een zeer transparante schedel die tweefotonbeeldvorming van corticale structuren ondersteunt tot dieptes tot ~800 μm onder de pia, waarmee het functioneren van open-schedelramen in de buurt komt. Het HOTS-venster maakt structurele beeldvorming mogelijk bij Thy1-GFP-M muizen en functionele calciumbeeldvorming bij Thy1-GCaMP6s muizen. Wij geloven dat het HOTS-venster, als een handige en minimaal invasieve benadering, diepe transcraniële beeldvorming en optogenetiske, fotofarmacologische en andere lichtgebaseerde manipulaties in vivo aanzienlijk zal faciliteren.

Inleiding

Intravitale monitoring van corticale neuronen is essentieel voor het begrijpen van hersenstructuur en -functie¹. Twee-fotonmicroscopie (TPM) is een belangrijk hulpmiddel voor dergelijke in vivo studies ^2,3. De beeldkwaliteit en diepte worden echter sterk beperkt door sterke lichtverstrooiing van de ondoorzichtige schedel boven de cortex ^4,5.

Open-skull⁶ en thinned-skull windows ^7,8 hebben de optische toegang tot de cortex sterk verbeterd en worden veel gebruikt, maar beide benaderingen hebben inherente beperkingen. Open-schedelvensters kunnen acuut hersenletsel en ontstekingsreacties veroorzaken ^9,10, terwijl schedeldunner maken technisch veeleisend is en moeilijk om een uniforme dikte^{te bereiken 11,12}.

In vivo optische schedelreinigingstechnieken bieden een minimaal invasief alternatief dat twee-fotonenbeeldvorming met axonale resolutie bij volwassen muizen mogelijk maakt. De haalbare beelddiepte blijft echter beperkt (meestal 150–400 μm onder de pia^). In de praktijk is schedelclearing meestal beperkt tot een korte periode onder narcose met starre kopfixatie, en de systematische optimalisatie van clearingcocktails voor de samenstelling van schedelbotten is onderbelicht.

Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we eerder een kopgemonteerd optisch transparant schedelvenster (HOTS) ontwikkeld dat langdurige, offline schedelverwijdering ondersteunt bij vrij functionerende muizen (Figuur 1A)¹⁶. Deze aanpak maakt gebruik van een tweestaps clearingprocedure met reagentia (S1 en S2), die in ons eerdere werk¹⁶ zijn geoptimaliseerd door systematische chemische screening. De systematische optimalisatie van de clearing-reagentia en de karakterisering van clearing-effectiviteit, reversibiliteit, bioveiligheid en in vivo beeldvormingsprestaties van het HOTS-venster zijn gerapporteerd in ons eerdere werk¹⁶, dat ook een gunstige astrogliale respons na HOTS-behandeling aantoonde. Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het vaststellen van het HOTS-venster om diepe transcraniële twee-foton beeldvorming bij volwassen muizen mogelijk te maken. In representatieve voorbereidingen bereiken beelddieptes ~800 μm onder de pia, bijna gelijk aan die met open schedelvensters. Het HOTS-venster maakt diepe structurele beeldvorming mogelijk bij Thy1-GFP-M muizen en functionele calciumbeeldvorming bij wakkere Thy1-GCaMP6s muizen.

Protocol

Alle dierverzorgings- en experimentele procedures werden goedgekeurd door het Guangdong Provinciale Comité voor Dierenverzorging en -gebruik en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Ethische Commissie voor Dierproeven van het Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academie van Wetenschappen. De reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor muizen van 6 weken oud (lichaamsgewicht ~20 g), die een schedeldikte hebben van ongeveer 100 μm.

1. Bereiding van schedelreinigingsoplossingen

1. Maak schedelreinigingsoplossing S1 (10% wt/v EDTA, 15% wt/v D-mannose, 10% wt/v sulfolaan, 0,5% wt/v Tween 20; RI: 1,38; eind-pH: 7,0-7,4)
   1. Weegt 0,35 g natriumhydroxide (NaOH). Voeg het toe aan 20 ml gedeïoniseerd water in een beker en roer tot het volledig is opgelost. Dit verhoogt de pH van de oplossing, waardoor de daaropvolgende oplossing van EDTA mogelijk wordt.
      OPMERKING: NaOH is corrosief. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, labjas, oogbescherming) en hanteer het met een chemische dampkap.
   2. Voeg 4 g ethyleendiamintetraazijnzuur (EDTA) toe aan de NaOH-oplossing. Plaats de beker in een waterbad van 40 °C en roer continu totdat de EDTA volledig is opgelost.
   3. Koel het mengsel tot kamertemperatuur. Voeg 6 g D-mannose, 4 g sulfolaan en 0,2 g Tween 20 toe aan de oplossing. Roer op kamertemperatuur totdat alle componenten volledig zijn opgelost.
   4. Voeg gedeïoniseerd water toe om het uiteindelijke volume op 40 mL te brengen. Meng grondig om S1 te verkrijgen.
      OPMERKING: S1 kan enkele maanden op kamertemperatuur worden bewaard.
2. Bereid schedelreinigingsoplossing S2 voor (70% wt/v D-mannose, 5% wt/v sulfolaan, 0,5% wt/v Tween 20; eind RI: 1,44; eindpH: 7,0-7,4)
   1. Weeg 28 g D-mannose, 2 g sulfolaan en 0,2 g Tween 20 en doe deze over in een schone beker.
   2. Voeg gedeïoniseerd water toe aan ongeveer 30 mL en roer op kamertemperatuur totdat alle componenten volledig zijn opgelost.
   3. Voeg gedeioniseerd water toe om het uiteindelijke volume op 40 mL te brengen en meng grondig om S2 te verkrijgen.
      OPMERKING: Zachte verhitting (25–30 °C) en continu roeren versnellen de oplossing van D-mannose. S2 kan enkele maanden op kamertemperatuur worden bewaard.

2. Voorbereiding op de operatie

1. Autoclave alle chirurgische instrumenten en steriliseer de werkplek grondig met 75% alcohol.
2. Verdoof de muis door intraperitoneale injectie van 1% (w/v) natriumpentobarbital (150–200 μL per 20 g lichaamsgewicht).
   OPMERKING: Andere omkeerbare anesthetica kunnen worden gebruikt als alternatief voor natriumpentobarbital.
3. Controleer de diepte van de anesthesie met behulp van de teen-knijp reflextest en zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd is voordat de operatie begint.
4. Plaats de muis in een stereotaktisch frame en zet het hoofd vast met oorbanden.
5. Houd de lichaamstemperatuur op 37 °C met een warmtekussen.
6. Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
   OPMERKING: Houd de ademhaling en reflexen nauwlettend in de gaten om een overdosis anesthetica en ademhalingsdepressie te voorkomen.

3. Operatie en montage van de hoofdplaat

1. Schedelblootstelling en reiniging (Figuur 1Ba)
   1. Verwijder de hoofdhuid over het gehele dorsale schedeloppervlak met fijne pincet en een chirurgische schaar. Trim de huid lateraal om de randen van de temporale spieren bloot te leggen en naar achteren richting de nekspieren.
   2. Verwijder voorzichtig het periost van het schedeloppervlak met fijne pincetten.
   3. Maak het schedeloppervlak schoon met een vochtige watten applicator en droog de schedel met een zachte luchtstroom.
   4. Als precieze lokalisatie van functionele gebieden van de hersenschors vereist is, markeer dan referentiepunten met 1 mm afstand op het schedeloppervlak met behulp van een stereotactisch apparaat.
2. Toepassing van tandcement en topplaat (Figuur 1Bb)
   1. Bereid het tandcement voor volgens de instructies van de fabrikant. Tandcementen met sterke hechting en goede duurzaamheid, geschikt voor langdurige fixatie, worden aanbevolen om een stabiele hechting te garanderen.
   2. Breng een dunne laag tandcement aan op het blootliggende schedeloppervlak en omliggende weefsels ter bescherming, waarbij het gebied dat voor het opruimingsvenster is bestemd niet wordt gecoat.
      OPMERKING: Na het mengen van het poeder en de vloeibare componenten van het tandcement in een volumeverhouding van 1:1, wacht ongeveer 10 seconden tot het cement aan de punt van een tandenstoker heeft gehecht voordat je het aanbrengt. Dit vermindert de soepelheid en verbetert de wegligging. Breng tijdens het aanbrengen het cement aan vanaf de rand richting het aangewezen open raam en houd het raamgedeelte volledig cementvrij. Het vrijgemaakte gebied wordt gedefinieerd door de grens van de tandheelkundige sealant (tandcement en zacht voeringmateriaal) op het schedeloppervlak. Daarom kan de grootte worden aangepast, maar deze wordt beperkt door de kraniale hechtingen of de grootte van de muts. Voor een veelvoorkomende toepassing op één halfrond is het vrijgemaakte gebied meestal ~3–5 mm in diameter.
   3. Bevestig een kleine titanium kopplaat (voor kopbevestiging aan een speciale houder tijdens latere beeldvorming) met tandcement aan de schedel.
      OPMERKING: Verschillende ontwerpen van kopplaten kunnen worden gebruikt voor kopfixatie. In deze studie werden zowel commercieel verkrijgbare kopplaten als aangepaste tweegats titanium platen met succes gebruikt. Ongeacht het ontwerp moet de hoofdplaat voldoende mechanische stabiliteit bieden voor latere beeldvorming en het beoogde opschudding-/beeldvenster niet belemmeren.

4. Het creëren van een HOTS-venster

1. Sluit de schedel af met zelfuithardend zacht voeringmateriaal (Figuur 1Bc)
   1. Nadat het tandcement ongeveer 5 minuten volledig is uitgehard, bedek je de cementlaag, met uitzondering van het opruimingsvenster, met een dunne laag zelfuithardend zacht tandheelkundig voeringmateriaal om een continue afdichting over de schedel te vormen.
      OPMERKING: Het zachte voeringmateriaal verbetert de afdichting en vermindert lekkage bij langdurige blootstelling aan zuiveringsreagentia.
   2. Vorm het zelfuithardende zachte voeringmateriaal soepel rond de geplande rand van het clearingvenster, zodat er een vlak afdichtingsoppervlak voor de kap ontstaat.
2. De dop monteren (Figuur 1Bd)
   1. Snijd de kop van een wegwerp plastic pipet (polyethyleen, PE) af om een kleine cilindrische kap te maken met een gesloten bovenkant en open onderkant. PE vertoont een goede chemische stabiliteit en vertoont geen zichtbare degradatie of reactie met de S1- of S2-reinigingsoplossingen tijdens het zuiveringsproces.
      OPMERKING: De dop die van de kop van een 1 mL transferpipetbol wordt gesneden, heeft doorgaans een diameter van ~12 mm en een diameter van ~10–14 mm van de lengte.
   2. Plaats de dop over het aangewezen open venstergebied en druk hem voorzichtig in het zachte voeringmateriaal.
      OPMERKING: De kap is groter dan het vrijgemaakte gebied, en een deel van de schedel onder de kap dat niet voor het vrijgemaakte gebied wordt gebruikt, kan worden aangebracht met tandheelkundige sealant om de schedel te beschermen tegen het vrijmaken.
   3. Bevestig de kap met extra zacht voeringmateriaal rond de basis, zodat de verbinding tussen de kap en de schedel volledig is afgedicht.
   4. Gebruik een 1 ml spuit met een 26 G naald om een of meer kleine gaatjes in de dopwand te prikken, die dienen als poorten voor injecteren en verwijderen van reinigingsoplossingen.
   5. Laat het zachte voeringmateriaal volledig uitharden. Controleer of de kap stevig vastzit en dat er geen zichtbare openingen bij het interface overblijven.
   6. Haal de muis uit het stereotaxische frame en plaats hem in een warme kooi tot hij volledig hersteld is van de narcose.
      OPMERKING: Dit is een geschikt stoppunt. Voer de schedelverwijderingsprocedure uit nadat het tandcement en het zachte voeringmateriaal volledig zijn uitgehard. In onze praktijk kan het HOTS-venster 's middags worden geplaatst, gevolgd door het verwijderen van de schedel de volgende ochtend, zodra de muis volledig hersteld is van de operatie. Als alternatief kan het ontruimen van de schedel ongeveer 15 minuten na de installatie van het HOTS-raam worden gestart. Tijdens de installatie van het HOTS-raam blijft de schedel structureel intact, hoewel het periost wordt verwijderd.

5. Schedelklopping bij wakker gedroegde muizen die zich vrij gedragen

OPMERKING: Tijdens de opruimfase blijft de muis wakker en gedraagt zich vrij in haar thuiskooi. Gebruik korte isoflurane anesthesie alleen voor oplossingsinjectie en vervanging via de kopgemonteerde dop.

1. Initiële lading van S1
   1. Plaats de muis in een inductiekamer en induceer korte narcose met 3–4% isofluraan in de lucht bij een debiet van 300–500 mL/min totdat de muis onbeweeglijk wordt. Er werd geen onderhoudsanesthesie toegepast.
   2. Beperk de muis voorzichtig en stabiliseer de kopbevestigde pet met de hand.
   3. Gebruik een 1 ml spuit met een 26 G naald om langzaam ongeveer 1 mL S1 in de kopgemonteerde dop te injecteren.
   4. Zet de muis terug in een thuiskooi en laat S1 2 uur op de schedel werken.
      OPMERKING: Tijdens de S1- en S2-incubatie houd je de muis individueel in een standaard kooi.
2. Vernieuwend seizoen 1
   1. Na 2 uur na het eerste S1-laden doof je de muis kort opnieuw met isoflurane.
   2. Aspireer S1 uit de dop met een spuit van 1 mL.
   3. Vul de dop opnieuw met verse S1 met een spuit van 1 mL.
   4. Zet de muis terug in de kooi en laat S1 nog 2 uur handelen.
   5. Herhaal stappen 5.2.1–5.2.4 4 uur na de initiële belasting om een tweede S1-vervanging uit te voeren.
   6. Laat S1 na de tweede vervanging doorgaan tot een totale S1-belichtingstijd van 6 uur is bereikt.
      OPMERKING: Dit protocol (1 mL S1 voor 6 uur) is geoptimaliseerd voor muizen van 6 weken oud (~20 g). Voor oudere dieren met dikkere schedels kan de S1-incubatietijd geleidelijk worden verlengd. Elke aanpassing moet gepaard gaan met nauwlettend monitoren van het dierenwelzijn en de uiteindelijke beeldkwaliteit om overmatige schedelverzachting te voorkomen.
3. Toepassing van S2
   1. Na 6 uur S1-behandeling verdoof je de muis kort met isoflurane.
   2. Aspireer S1 uit de dop met een 1 mL spuit en vervang deze door 0,7 mL S2.
   3. Zet de muis terug in de kooi en laat S2 1 uur op de schedel werken om de transparantie verder te vergroten en brekingsindexmatching te bieden.
      OPMERKING: Onder deze omstandigheden wordt de gecombineerde S1- en S2-clearingfase doorgaans binnen 7 uur voltooid (6 uur S1 + 1 uur S2). Succesvolle opruiming wordt aangegeven door een zichtbaar transparant schedeloppervlak zonder bloeding. De schedel kan na het schoonmaken iets zachter worden; Wanneer het zachtjes wordt aangeraakt met fijne tangen, moet het lichte volging tonen maar structureel intact blijven. Vermijd overmatige druk op het schedeloppervlak.

6. Beeldvorming voorbereiden

1. Anesthesie en hoofdfixatie voor beeldvorming
   1. Aan het einde van de S2-incubatie verdoof de muis door intraperitoneale injectie van 1% (w/v) natriumpentobarbital bij 150–200 μL per 20 g lichaamsgewicht.
   2. Bevestig voldoende anesthesie met de teen-knijpreflextest.
   3. Bevestig de kop van de muis door de titanium kopplaat vast te schroeven op een speciaal ontworpen kophouder.
   4. Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdrogen tijdens de beeldvorming te voorkomen.
   5. Houd de lichaamstemperatuur op ~37 °C met een warmtekussen.
2. Het blootleggen van het vrijgemaakte schedeloppervlak (Figuur 1Be, Bf)
   1. Aspiraat de S2-oplossing uit de dop met een spuit.
   2. Knip voorzichtig de plastic dop met een fijne schaar en verwijder deze met een tang, zodat je geen overmatige kracht op de schedel uitoefent.
   3. Trek voorzichtig het zachte voeringmateriaal rond het open plekje los om het leeggemaakte schedelgebied volledig bloot te leggen.
   4. Breng een kleine druppel S2-oplossing direct aan op de vrijgemaakte schedel om tijdens de beeldvorming als brekingsindex-matchend onderdompelingsmedium te dienen.
      OPMERKING: In deze studie werden standaard wateronderdompelingsobjectieven gebruikt, waaronder een 16×/NA 0,8 objectief (N16XLWD-PF, Nikon) en een 25×/NA 1,1 objectief (N25X-APO-MP, Nikon). Wanneer S2 als immersiemedium wordt gebruikt, stel dan de correctiekraag van het objectief aan, indien beschikbaar, aan op de juiste instelling voor de brekingsindex van S2 om bolvormige aberraties te verminderen. In de experimenten hier behield de vrijgemaakte schedel voldoende optische helderheid voor ongeveer 2 uur tweefotonbeeldvorming, zonder duidelijke achteruitgang van de beeldkwaliteit tijdens dendritische wervelkolomobservatie. Na ongeveer 2 dagen was opnieuw clearing nodig voor verdere beelden, en de heropnametijd was aanzienlijk korter dan de initiële clearing, waardoor efficiënte herhaalde beeldvorming van hetzelfde dier mogelijk was.
3. Beeldvorming met hoofdvaststelling bij het wakkere hoofd (optioneel)
   OPMERKING: Voor wakkere beeldvorming moet je de muis laten wennen aan de hoofdfixatie vóór het experiment. Verdoof de muis kort met isoflurane, bevestig vervolgens de geïmplanteerde hoofdplaat aan de houder gedurende 15–30 minuten per sessie, en herhaal dit 2–3 dagen.
   1. Gebruik korte isoflurane anesthesie om het hanteren te vergemakkelijken. Bevestig alleen de geïmplanteerde hoofdplaat aan de houder, zodat het lichaam vrij kan bewegen op het loopwiel of platform.
   2. Volg stappen 6.2.1–6.2.4 om het vrijgemaakte schedeloppervlak bloot te leggen en S2 toe te passen vóór de beeldopname.

7. Herstel

1. Na de beeldvorming aspireer je voorzichtig en verwijder je eventuele resterende S2-oplossing van het schedeloppervlak.
2. Spoel het verwijderde schedelgebied meerdere keren af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om geleidelijk herstel van de oorspronkelijke ondoorzichtige staat van de schedel te bevorderen.
3. Droog het restvocht van de schedel en omliggende weefsels voorzichtig met steriele wattenstaafjes, zodat mechanische schade aan het bot wordt voorkomen.
4. Als het dier in leven wordt gehouden voor latere experimenten, breng dan een laag van de biocompatibele sealant Kwik-Cast (WPI) aan op het schedelraam om het bot te beschermen tijdens de overlevingsperiode.
5. Laat de beschermende laag volledig uitharden.
6. Haal de muis los van de kophouder en plaats hem in een warme kooi. Houd het dier in de gaten totdat het volledig hersteld is van de narcose en breng het dan terug naar zijn thuiskooi.

Resultaten

Volgens het protocol maakt het kopgemonteerde optisch transparante schedelvenster (HOTS) diepe transcraniële twee-foton beeldvorming bij volwassen muizen mogelijk, terwijl de schedelintegriteit behouden blijft. Een succesvolle voorbereiding wordt aangegeven door twee belangrijke uitkomsten: (1) de corticale bloedvaaten wordt duidelijk zichtbaar door de schedel na het vrijmaken (Figuur 1Bf), en (2) de vrijgemaakte schedel vertoont lichte deuk...

Discussie

De HOTS-methode maakt gebruik van een kopgemonteerd optisch transparant schedelvenster (HOTS) dat een kap met zuiveringsreagentia combineert met een tweestapsprocedure om de schedeltransparantie bij volwassen muizen te verbeteren en tegelijkertijd de schedelintegriteit te behouden. Volgens het standaardprotocol (6 uur in S1 en 1 uur in S2 voor muizen van 6 weken) ondersteunde het resulterende venster betrouwbaar diepe transcraniële tweefotonenbeeldvorming en konden structuren tot ~800 μm...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL wegwerppipet	Beijing Biotopped  Science  & Technology  Co., Ltd.	N/A
Tandcement	Shanghai Rongxiang Dental Materials Co., Ltd.	N/A
D-mannose	Macklin	D813082
EDTA	Aladdin	El 16428
Isofluraan	RWD	N/A
Kwik-Cast	WPI	N/A	Een biocompatibel afdichtingsmiddel
NaOH	Macklin	S832169
Zelfhardende     tandheelkundige       zachte voeringsmateriaal	Yangmahu Biotechnology (Hebi) Co., Ltd.	N/A
Natriumpentobarbital	Biopike	N/A
Stereotaxisch apparaat	RWD	N/A
Steriele wegwerpspuit	Minank	N/A	1 mL; 26 G naald
Sulfolaan	Macklin	S817950
Thy1-GFP-M muizen		N/A	Verstrekt door prof. Yang Zhan
Thyl-GCaMP6s  muizen	Jackson Laboratory
Tween 20	Sigma-Vetec	V900548
Waterimmersieobjectief	Nikon	N25X-APO-MP	25×/NA 1.1 objectief
Waterimmersieobjectief	Nikon	N16XLWD-PF	16×/NA 0.8 objectief