Methodenartikel

Realtime labelvrije beeldvorming en kwantitatieve analyse van macrofagenmorfodynamica met behulp van optische diffractietomografie

DOI:

10.3791/71209

⸱

9 juni 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sichuan Provincial Key Laboratory of Innovation and Efficient Utilization of Chinese Medicine Germplasm Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Yangtze Delta Institute of Optoelectronics, Peking University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een labelvrije optische diffractietomografie-gebaseerde workflow voor realtime beeldvorming en kwantitatieve analyse van macrofagenmorfodynamica. De methode maakt continue tracking van de morfologie en migratie van enkelcellige cellen mogelijk, waarbij tijdsresolutie metingen van het geprojecteerde gebied, de omtrek en de gemiddelde migratiesnelheid tijdens langdurige live-cell beeldvorming worden opgeleverd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie stelt een labelvrije optische diffractietomografie (ODT)-gebaseerde workflow vast voor live-celbeeldvorming en analyse om tijdsafhankelijke morfologische veranderingen in macrofagen waar te nemen. De methode maakt continue registratie van enkelcelmorfologie en beweging over langere periodes onder stabiele omgevingscondities mogelijk en maakt het mogelijk om kwantitatieve parameters te extraheren, waaronder het geprojecteerde gebied, de omtrek en de gemiddelde migratiesnelheid. Deze workflow biedt een praktische aanpak om dynamisch cellulair gedrag op single-celniveau vast te leggen zonder exogene labeling. Met RAW264.7 macrofagen als model werd time-lapse beeldvorming uitgevoerd onder lipopolysaccharidestimulatie met baicalin voorbehandeling om dynamische cellulaire veranderingen onder verschillende omstandigheden vast te leggen. Representatieve cellen werden geselecteerd voor tracking en kwantitatieve analyse. De resultaten tonen aan dat deze workflow stabiele langetermijntracking van single-cell ondersteunt en temporele veranderingen in celmorfologie en motiliteit weerspiegelt. Deze benadering biedt een labelvrije methode om dynamisch cellulair gedrag te observeren als reactie op verschillende prikkels en kan dienen als een nuttige aanvulling op conventionele eindpuntgebaseerde assays. Het kan ook toepasbaar zijn op andere adherente celtypen voor studies van celmorfodynamica.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macrofagen spelen een centrale rol in aangeboren immuunresponsen en weefselhomeostase, en hun functionele toestanden kunnen dynamisch veranderen als reactie op micro-omgevingsprikkels. Traditioneel zijn macrofagen beschreven als het aannemen van pro-inflammatoire of ontstekingsremmende/reparatie-geassocieerde fenotypes 1,2. Echter, steeds meer bewijs suggereert dat macrofagenactivatie een continu en plastisch proces is in plaats van een discrete binaire toestand3,4. Onder verschillende prikkels ondergaan macrofagen geleidelijke veranderingen in de loop van de tijd, vergezeld van veranderingen in celmorfologie en migratiegedrag5. Daarom biedt tijdsgebonden karakterisering van morfologische en migratieveranderingen op enkelcelniveau een belangrijke benadering voor het bestuderen van dynamische cellulaire reacties.

Huidige benaderingen voor het bestuderen van macrofagen-toestanden zijn voornamelijk gebaseerd op immunokleuring, flowcytometrie en transcriptomische of proteomische analyses6. Deze methoden zijn doorgaans gebaseerd op vaste samples of discrete tijdspunten, wat hun vermogen beperkt om continue veranderingen in dezelfde cel onder levende omstandighedente volgen 7. Fluorescentie-gebaseerde live-celbeeldvorming maakt dynamische observatie mogelijk, maar kan tijdens langdurige experimenten worden beïnvloed door fototoxiciteit en fotobleaching 8,9. Optische diffractietomografie (ODT) is een labelvrije beeldvormingstechniek die de driedimensionale brekingsindexverdeling van cellen reconstrueert om kwantitatieve structurele informatiete verkrijgen. Omdat het geen exogene labeling vereist, is ODT geschikt voor langdurige live-celbeeldvorming en vermindert het verstoring van cellulair gedrag. In de afgelopen jaren is ODT toegepast op dynamische studies in verschillende celmodellen11, waarbij eerdere studies zich voornamelijk richtten op beeldvormingscapaciteit en structurele karakterisering. Daarentegen stelt de huidige studie een gestandaardiseerde, labelvrije workflow vast voor langetermijn, tijdsgebonden single-cel analyse van macrofagenmorfodynamiek onder een gedefinieerde in vitro stimulatieconditie.

De workflow wordt aangetoond met behulp van een in vitro RAW264.7 macrofagemodel met lipopolysaccharide (LPS) stimulatie en Baicalin (BAI) voorbehandeling. BAI werd gebruikt als representatieve experimentele modulator om een gedefinieerde voorwaarde vast te stellen voor het demonstreren van de workflow. Continue beeldvorming maakt het mogelijk om kwantitatieve single-celparameters te extraheren, waaronder geprojecteerd gebied, omtrek en gemiddelde migratiesnelheid, waardoor tijdsgebonden karakterisering van morfologische en gedragsveranderingen mogelijk is. Deze benadering is bedoeld om een beschrijvende analyse te bieden van dynamische fenotypische veranderingen in plaats van functionele toestanden of polarisatie te definiëren, en kan dienen als een aanvullende methode voor eindpuntgebaseerde assays door temporele informatie te verstrekken. De workflow wordt gevalideerd in dit modelsysteem en is mogelijk toepasbaar op andere adherente celtypes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Macrofagencultuur

VOORZICHTIG: Voer alle procedures uit in een bioveiligheidskast terwijl je laboratoriumhandschoenen en een labjas draagt.

  1. Bereid een volledig kweekmedium voor (hoogglucose Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM)) aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS) en 1% penicilline–streptomycine).
  2. Ontdooi een flesje RAW264.7 macrofagen in een waterbad van 37 °C minder dan 1 minuut.
  3. Plaats de celsuspensie over in een high-glucose DMEM, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
  4. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten.
  5. Gooi het supernatant weg.
  6. Sussief de cellen opnieuw in een vers volledig medium.
  7. Zaadcellen in 60 mm schalen met 2–5 × 105 cellen per schaal.
  8. Incubeer cellen bij 37 °C met 5% CO₂.
  9. Verwissel het medium niet binnen 12–24 uur na het ontdooien.
  10. Vervang het medium elke 2–3 dagen.
  11. Monitor de celmorfologie met een omgekeerde microscoop.
  12. Doorgangscellen bij 80–90% samenvloeiing door zacht pipetteren.
    OPMERKING: Vermijd het gebruik van trypsine. Gebruik cellen bij passages 6–18. Selecteer cellen met uniforme morfologie en zonder vacuolisatie voor experimenten. De cellijn werd geauthenticeerd door STR-profilering en onderworpen aan kwaliteitscontroletests. Gedetailleerde rapporten en een Engelse samenvatting worden verstrekt in aanvullende bestanden.

2. Celbehandeling

  1. Verzamel cellen in de logaritmische groeifase door zacht te pipetteren.
  2. Sussen cellen opnieuw in een volledig medium.
  3. Meet de celdichtheid met behulp van een celteller.
  4. Stel de celdichtheid aan op 4 × 104 cellen /mL.
  5. Zaad 2 ml celsuspensie in elke 35 mm schotel.
  6. Wijs gerechten toe aan twee groepen: (i) LPS-groep, (ii) BAI + LPS-groep.
  7. Incubeer cellen bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 12–16 uur.
  8. Bereid een 50 mM BAI-voorraadoplossing voor in DMSO. Bewaar de BAI-voorraadoplossing bij −20 °C.
  9. Voeg BAI toe aan de BAI + LPS-groep tot een uiteindelijke concentratie van 100 μM. Verdun de BAI-voorraadoplossing direct in kweekmedium om de uiteindelijke werkconcentratie te bereiken.
  10. Voeg een gelijke hoeveelheid DMSO toe aan de LPS-groep.
  11. Maak een LPS-bouillonoplossing (1 mg/mL) in een volledig medium.
  12. Voeg LPS toe aan beide groepen tot een uiteindelijke concentratie van 1 μg/mL. Verdun de LPS-voorraadoplossing direct in kweekmedium om de uiteindelijke werksconcentratie te bereiken.
  13. Ga direct over tot beeldvorming en verander het medium niet tijdens de beeldopname.

3. Optische diffractietomografie verwerving

  1. Zet het ODT-beeldsysteem aan en start de milieucontrolemodule.
  2. Stel de temperatuur van het podium in op 37 °C.
  3. Stel de CO₂-concentratie in op 5%.
  4. Laat het systeem minstens 20 minuten in evenwicht zijn.
  5. Open de acquisitiesoftware.
  6. Plaats de kweekschaal op de beeldvormingsstage.
  7. Gebruik een 60x objectief (NA = 1,42) om cellen te lokaliseren.
  8. Selecteer geïsoleerde cellen met duidelijke grenzen voor beeldvorming.
  9. Stel het beeldinterval in op 8 minuten.
  10. Stel het totale aantal frames in op 181.
  11. Schakel de autofocusfunctie in om scherp te blijven tijdens time-lapse beeldvorming.
  12. Begin met het verkrijgen van time-lapse.
  13. Monitor de stabiliteit van het systeem tijdens de acquisitie.
    OPMERKING: Autofocusstabilisatie werd gedurende het hele experiment toegepast om focale drift te minimaliseren.

4. Beeldreconstructie en kwantitatieve analyse

  1. Na beeldverwerving voert de software automatisch beeldreconstructie uit.
  2. Met behulp van het ingebouwde standaardalgoritme.
  3. Wacht tot de voortgangsbalk compleet is.
  4. Open de analysesoftware (Intellyseg, v2.1.0).
  5. Importeer de ruwe dataset door te kiezen op Raw Data importeren.
  6. Ik blader naar de map doel.
  7. Kies het doelbestand en importeer de dataset.
  8. Klik op "Cel" om automatische segmentatie uit te voeren met consistente instellingen over datasets13.
  9. Selecteer cellen op basis van de volgende criteria: (i) geen overlap met naburige cellen, (ii) niet in contact met beeldgrenzen, (iii) continu te volgen gedurende de tijdreeks.
  10. Selecteer een vast aantal cellen (n = 8) per gezichtsveld voor consistente analyse over datasets heen.
  11. Open de module "Long-term Tracking".
  12. Enter het start- en eindframe.
  13. Klik op "Track" om tracking te starten, gebaseerd op celpositieconsistentie tussen opeenvolgende frames14.
  14. Corrigeer trackingfouten handmatig indien nodig om trajectcontinuïteit te waarborgen: (i) Klik met de rechtermuisknop op onjuiste maskers en selecteer "Item verwijderen", (ii) Open "Handmatige Segmentatie", (iii) Selecteer "Cel" en klik op "Toevoegen", (iv) Gebruik "Klik" of "Doos" om correcte maskers toe te voegen.
  15. Klik op "Exporteren" en selecteer vervolgens "Data Export".
  16. Selecteer "Video Export" en selecteer uitvoerelementen.
  17. Daar komen de start- en eindframes in.
  18. Selecteer het savepad en het bestandsformaat.
  19. Klik op "OK" om de video te exporteren.
  20. Klik op "Exporteren" en selecteer vervolgens "Chart System".
  21. Selecteer "Track Chart".
  22. Kies "Cell" als segmentatiecategorie.
  23. Hier komt het tracking frame-bereik.
  24. Selecteer outputparameters (bijv. Oppervlakte, Perimeter).
  25. Klik op "Afbeelding of Excel exporteren" en sla het bestand op.
  26. Bereken de gemiddelde migratiesnelheid (μm/u) voor elke cel op basis van de verplaatsing van het zwaartepunt over de gehele tijdreeks.

5. Datapresentatie

  1. Kwantitatieve metingen worden beschrijvend gepresenteerd. Er werd geen statistische afleiding gedaan. Elke behandelgroep omvatte vijf onafhankelijke steekproeven.
    Een overzicht van de experimentele workflow wordt weergegeven in Figuur 1. Belangrijke reagentia, instrumenten en software worden vermeld in de Materiaalkundige Tafel. De beeldvormingscondities worden samengevat in Tabel 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de prestaties van de ODT-gebaseerde workflow te evalueren, werd time-lapse imaging uitgevoerd voor twee behandelgroepen (LPS en BAI + LPS), met vijf onafhankelijke monsters per groep. Alle monsters zijn onder identieke beeldvormende omstandigheden genomen. Vanwege de hoge werklast die gepaard gaat met langdurige single-cell tracking en kwantitatieve analyse, werd uit elke groep één representatieve steekproef geselecteerd voor single-cell analyse en visualisatie. De resultaten worden beschrijvend gepresenteerd en zijn ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie stelt een labelvrije, ODT-gebaseerde workflow vast voor continue beeldvorming en kwantitatieve analyse van macrofagenmorfodynamica op single-cel niveau. De aanpak maakt tijdsresolutie van het geprojecteerde gebied, de omtrek en de gemiddelde migratiesnelheid mogelijk tijdens langdurige live-cell beeldvorming. Celzaaddichtheid is een belangrijke factor die segmentatie en trackingprestaties beïnvloedt. Hoge dichtheid resulteert in overlappende cellen, terwijl lage dichtheid het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs beweren dat Jie-jie Zhu en Yan-qing Yang verbonden zijn aan Pellucid Optics (Nantong) Co., Ltd. Het ODT-beeldvormingssysteem dat in deze studie wordt gebruikt, is gerelateerd aan dit bedrijf. Deze affiliatie had echter geen invloed op het experimentele ontwerp, de gegevensverzameling, analyse of interpretatie van de resultaten. De overige auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (U24A20790), het Ministerie van Wetenschap en Technologie (2022YFF0712500 en 2023YFF0722600) en het provinciaal departement van wetenschap en technologie van Jiangsu (BK20250540).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ODT imaging systemPellucid OpticsMH-PanoViewWordt gebruikt voor label-vrije live-cel beeldvorming
AcquisitiesoftwarePellucid Optics Lucida-Pano v2.1.0Wordt gebruikt voor beeldacquisitie
AnalysesoftwarePellucid Optics Intellyseg v2.1.0Wordt gebruikt voor beeldreconstructie, segmentatie en tracking
RAW264.7Wuhan Zishan Biotechnology STCC20020PMuis-macrofagen cel lijn gebruikt voor in vitro polarisatie en beeldvorming experimenten.
Baicalin (BAI)Shanghai Yuanye JB246114Wordt gebruikt voor cel pre-behandeling
Lipopolysacharide (LPS)SolarbioL8880Wordt gebruikt om macrofagen te stimuleren
DMEM mediumGibcoC11995500BTCelcultuur medium
Foetaal runderserumProcell164210Aanvulling voor celcultuur
Penicilline–Streptomycine (100x)ProcellPB180120Antibiotica voor celcultuur
60 mm kweekschaalCorningCLS430166Wordt gebruikt voor celcultuur
35 mm glazen bodemschaalCellvisD35-10-1.5-NWordt gebruikt voor ODT beeldvorming
Inverteerde microscoopOLYMPUSCKX53Wordt gebruikt voor routine celobservatie en monitoring tijdens cultuur.
CeltellerRWD Life ScienceC100Wordt gebruikt voor celdichtheidsbepaling

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Live cell imagingsingle cell trackingtime lapse imagingcelmorfologiecelmotiliteitRAW264 7 macrofagen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen