Geïntegreerde bio-informatische analyse van menselijke transcriptomische gegevens identificeert drie belangrijke diagnostische en prognostische biomarkers bij longadenocarcinoom

Summary

Deze studie identificeerde diagnostische en prognostische biomarkers voor longadenocarcinoom met behulp van TCGA-LUAD en GEO GSE115002 transcriptomische gegevens. B3GNT3, FERMT1 en SPP1 werden opgereguleerd, waardoor tumoren werden onderscheiden van normaal weefsel. Deze genen zijn gekoppeld aan de epitheel-mesenchymale overgang en immuunsuppressie. Een nomogram dat genexpressie combineert met het TNM-stadium toonde een betrouwbare voorspellende waarde.

Abstract

Longadenocarcinoom (LUAD) is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte. Ondanks vooruitgang in chirurgie, gerichte therapie en immunotherapie blijft de 5-jarige overlevingskans van geavanceerde LUAD onder de 20%, wat wijst op een dringende behoefte aan betrouwbare moleculaire biomarkers voor vroege detectie en prognose. In deze studie stelden de auteurs de hypothese dat drie consequent opgereguleerde genen als effectieve diagnostische en prognostische biomarkers voor LUAD kunnen fungeren. De auteurs analyseerden transcriptomische gegevens van twee onafhankelijke cohorten, TCGA-LUAD (535 tumoren, 59 normale monsters) en GSE115002 (52 tumoren, 52 overeenkomende normale monsters), om differentieel expressieve genen te screenen. Drie kerngenen—B3GNT3, FERMT1 en SPP1—werden consequent overgeëxprimeerd in LUAD-tumoren in beide datasets. Deze genen vertoonden uitstekende diagnostische prestaties, met AUC-waarden boven 0,95 in TCGA-LUAD en hoge nauwkeurigheid in GSE115002. Overlevingsanalyse toonde aan dat een hoge expressie van elk gen significant geassocieerd was met een kortere algehele en ziektevrije overleving, en multivariate Cox-regressie bevestigde hun onafhankelijke prognostische waarde. Analyse van functionele verrijking gaf aan dat deze drie genen deelnemen aan de epitheel-mesenchymale overgang, extracellulaire matrixremodellering en immuunsuppressie, die allemaal nauw verbonden zijn met LUAD-invasie en metastase. De auteurs construeerden verder een prognostisch nomogram waarin de drie genen en het TNM-stadium werden gecombineerd, waarbij een concordantie-index van 0,743 werd bereikt en goede voorspellende prestaties werden aangetoond. Deze bevindingen bevestigen dat B3GNT3, FERMT1 en SPP1 veelbelovende diagnostische en prognostische biomarkers zijn voor LUAD, wat de klinische toepassing in risicostratificatie en -beheer ondersteunt.

Introduction

Longkanker is de belangrijkste oorzaak van wereldwijde kankersterfte en was verantwoordelijk voor ongeveer 1,8 miljoen sterfgevallen in 2020. Longadenocarcinoom (LUAD) vertegenwoordigt bijna 40% van alle longkankergevallen². Ondanks vooruitgang in chirurgie, gerichte therapie en immunotherapie blijft de 5-jaars overlevingskans voor geavanceerde LUAD onder de 20^%. Betrouwbare moleculaire biomarkers voor vroege detectie en nauwkeurige prognose zijn dringend nodig. High-throughput sequencing en openbare databases zoals The Cancer Genome Atlas (TCGA) en Gene Expression Omnibus (GEO) maken systematische transcriptomische profilering van kankers^{mogelijk 5,6}. Integratieve bioinformatica tussen cohorten verbetert de betrouwbaarheid van de ontdekking van kandidaat-biomarkers⁵.

Veel genen en routes zijn betrokken bij LUAD, waaronder celproliferatie, EGFR-signalering en immuunontsnapping⁷. Er zijn echter weinig exemplaren in de praktijk gebracht. Risicomodellen die gensignaturen en klinisch-pathologische kenmerken combineren — vooral nomogrammen — verbeteren de prognostische nauwkeurigheid in LUAD⁸. Hoewel B3GNT3, FERMT1 en SPP1 individueel zijn gekoppeld aan kankerprogressie, is hun gecombineerde diagnostische, prognostische en immuun-micro-omgeving regulerende waarde in LUAD niet systematisch gevalideerd over onafhankelijke cohorten. Deze studie biedt de eerste geïntegreerde cross-platform analyse van deze drie genen als een geïntegreerd biomarkerpaneel voor LUAD, met een klinisch toepasbaar prognostisch nomogram.

B3GNT3 codeert voor een glycosyltransferase die PD-L1 stabiliseert en immuunontwijking ^9,10 bevordert. FERMT1 (kindlin-1) reguleert integrineactivatie en stimuleert metastasen bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC)^11,12. SPP1 (osteopontine) bemiddelt extracellulaire matrixremodellering, epitheel-mesenchymale overgang (EMT) en chemoresistentie 13,14,15. Circadiane klok-gerelateerde genen zijn ook aangetoond de prognose en diagnose van LUAD te voorspellen¹⁶, terwijl geslachtsverschillen in LUAD zijn ontdekt via multi-omics integratieve eiwitsignaalnetwerken¹⁷. B3GNT3 en SPP1 worden afgescheiden of membraangelokaliseerd, wat mogelijk gebruik als minimaal invasieve biomarkers ondersteunt. Effectieve LUAD-classificatie en biomarkeridentificatie kunnen ook worden bereikt door overlappende methoden voor het selecteren van kenmerken¹⁸, en multi-omic interacties spelen een belangrijke functionele rol bij de progressie van longkanker¹⁹. Mitochondriale gensignaturen, geïdentificeerd via uitgebreide multi-omics-integratie, hebben ook waarde voor LUAD-prognose en gepersonaliseerde therapie²⁰. B3GNT3 en SPP1 worden afgescheiden of membraangelokaliseerd, wat mogelijk gebruik als minimaal invasieve biomarkers ondersteunt. Deze studie had als doel robuuste LUAD-biomarkers te identificeren met integratieve bio-informatica, hun diagnostische en prognostische prestaties te evalueren, hun biologische functies en immuunassociaties te onderzoeken en een klinisch bruikbaar prognostisch nomogram op te bouwen.

Protocol

1. Gegevensbronnen en voorverwerking

1. Verwerk ruwe data in R (versie 4.1.3; Windows 10 Pro).
2. Voor GSE115002 pas je kwantielnormalisatie toe met limma (versie 3.52.3).
3. Filter genen met lage expressie voor TCGA: behoud genen met CPM > 0,5 in ≥50% van de monsters.
4. Filter genen met lage expressie op GSE115002: behoud genen met gemiddeld signaal >50.
5. log₂Transformatie-expressiewaarden met een pseudocount van +1.
   OPMERKING: LUAD-genexpressie en klinische gegevens zijn verkregen van TCGA-LUAD (versie 33.0, GDC Portal, gedownload op 7 augustus 2025) en GSE115002 (Agilent microarray, GEO, gedownload op 7 augustus 2025). TCGA-LUAD omvatte 535 tumoren en 59 normale monsters. GSE115002 omvatte 52 tumoren en 52 overeenkomende normale monsters.

2. Identificatie van differentieel tot expressie gebrachte genen

1. Gebruik DESeq2 (versie 1.36.0) voor TCGA RNA-seq en limma (versie 3.52.3) voor GSE115002 voor differentiële expressieanalyse. Bereken aangepaste P-waarden (FDR) met behulp van de Benjamini–Hochberg-methode.
2. Om cross-dataset-vergelijkbaarheid te waarborgen, is een uniforme |log₂FC| ≥ 1.0 werd toegepast voor beide cohorten. DEG's werden gedefinieerd als FDR < 0.05 en |log₂FC| ≥ 1.0. Overlapende DEG's werden geïdentificeerd met behulp van VennDiagram (versie 1.7.3). B3GNT3, FERMT1 en SPP1 werden geselecteerd als consequent opgereguleerde kandidaten met bekende kankerrelevantie.

3. Evaluatie van diagnostische waarde

1. Bouw ROC-curves voor elk kandidaatgen.
2. Bepaal optimale afkapwaarden met behulp van de Youden-index.
3. Bereken AUC, gevoeligheid en specificiteit voor elk gen.
4. Bouw een gecombineerd diagnostisch paneel met behulp van multivariate logistische regressie.
   OPMERKING: Het pROC-pakket v1.18.0 werd gebruikt voor ROC-analyse. De glm-functie met de binomiale familie werd gebruikt om het diagnostisch model te construeren.

4. Overlevingsanalyse

1. Laag patiënten in groepen met hoge en lage expressie op basis van mediane expressie.
2. Genereer Kaplan–Meier-overlevingscurves voor elk gen.
3. Voer log-rank tests uit om overlevingsverschillen te vergelijken.
4. Voer univariate Cox-regressieanalyse uit.
5. Voer multivariate Cox-regressieanalyse uit.
6. Neem klinische covariaten op in regressiemodellen.
7. Verifieer de aanname van proportionele gevaren met behulp van Schoenfeld-residuen.
8. Bereken een risicoscore van drie genen.
   OPMERKING: Survival v3.3.1 en survminer v0.4.9 werden gebruikt. Covariaten omvatten leeftijd, geslacht, T-fase, N-stadium en M-stadium. De risicoscore werd als volgt berekend:
   Risicoscore = (0,328 × B3GNT3) + (0,331 × FERMT1) + (0,321 × SPP1). (1)

5. Verrijking van genensets en functionele annotatie

1. Voer GO-verrijkingsanalyse uit met behulp van DEGs.
2. Voer KEGG-routeverrijkingsanalyse uit met behulp van DEGs.
3. Voer gensetverrijkingsanalyse uit (GSEA).
4. Rangschik genen op basis van Pearson-correlatie met kandidaatgenexpressie.
5. Identificeer significante termen met aangepaste P < 0,05.
   OPMERKING: clusterProfiler v4.6.2 werd gebruikt voor GO- en KEGG-analyses. FGSEA v1.22.0 en MSigDB Hallmark v7.5 werden gebruikt voor GSEA.

6. Correlatie en netwerkanalyse

OPMERKING: Pearson-correlatie werd gebruikt voor normaal verdeelde genexpressie; Spearman-correlatie voor immuuncelfracties. PPI-netwerken werden gegenereerd met STRING (versie 11.5, betrouwbaarheid > 0.7) en gevisualiseerd in Cytoscape (versie 3.9.1). De immuuninfiltratie werd geschat met behulp van CIBERSORT (absolute modus, 100 permutaties). Single-cell RNA-sequencing is aangetoond niche-overgangen te onthullen in de NSCLC-microomgeving, wat relevant is voor immuuninfiltratieanalyse^21,22, en integratieve single-cell analyse kan de rollen van immuuncellen, zoals CD8+ geheugencellen, in LUAD 23,24,25 verder ontleden.

7. Nomogramconstructie en validatie

OPMERKING: Variabelen voor het nomogram zijn geselecteerd op basis van multivariate Cox-significantie (P < 0,05): T-fase, N-fase, B3GNT3, FERMT1 en SPP1. Het nomogram werd gebouwd met rms (versie 6.5.0). Interne validatie gebruikte 1000 bootstrap resampling met vervanging. Kalibratiecurves en beslissingscurveanalyse (DCA) werden uitgevoerd met behulp van RMDA (versie 1.7). De computationele omgeving omvatte R 4.1.3, Windows 10 Pro en Bioconductor 3.15. Analysescripts zijn beschikbaar op https://github.com/[redacted]/LUAD-biomarker-2025 op redelijk verzoek.

8. Statistische analyse

OPMERKING: Alle statistische tests waren tweezijdig; P < 0,05 werd als significant beschouwd.

Results

Globale genexpressieveranderingen in LUAD

Transcriptomische vergelijkingen tussen longadenocarcinoomweefsels en normale longweefsels identificeerden wijdverspreide veranderingen in genexpressie. Figuur 1A toont vulkaangrafieken van differentieel tot expressie gebrachte genen in de TCGA-LUAD-dataset, en Figuur 1B toont die in de GSE115002-dataset. In de TCGA-LUAD-cohort (Figuur 1A) werden 1865 genen significant opgereguleerd en 1247 genen werden gedownreguleerd. In de GSE115002 cohort (Figuur 1B) werden 645 genen opgereguleerd en 609 gedownreguleerd. In totaal werden 421 genen consequent opgereguleerd in beide datasets. Onder deze overlappende genen worden B3GNT3, FERMT1 en SPP1 in Figuur 1A en Figuur 1B als duidelijk overexpressief aangeduid in tumormonsters. In TCGA-LUAD was de expressie van B3GNT3 ongeveer 5 keer verhoogd, FERMT1 8 keer zo hoog en SPP1 10 keer zo sterk als normale weefsels. Vergelijkbare upregulatie werd bevestigd in GSE115002, waarbij alle drie de genen meer dan een dubbele verhoging vertoonden.

Diagnostische prestaties van B3GNT3, FERMT1 en SPP1

Analyse van de bedieningskarakteristiekcurve van de ontvanger werd gebruikt om de diagnostische prestaties van B3GNT3, FERMT1 en SPP1 te evalueren. Figuur 2A toont ROC-curves in de TCGA-LUAD-cohort, en Figuur 2B toont die in de GSE115002 cohort. Alle drie de genen behaalden een hoge diagnostische nauwkeurigheid in beide cohorten. In de TCGA-LUAD-cohort (Figuur 2A) overschreed het gebied onder de curvewaarden 0,95 voor alle markers. In de onafhankelijke GSE115002 cohort (Figuur 2B) werden eveneens een hoog oppervlak onder de curvewaarden waargenomen. Gevoeligheid en specificiteit varieerden van 85% tot 95% bij optimale grenswaarden. Deze resultaten bevestigen dat elk gen uitstekende onderscheiding biedt tussen tumor- en normaal weefsel.

Prognostische significantie van B3GNT3, FERMT1 en SPP1-expressie

Kaplan–Meier-overlevingscurves in Figuur 3 tonen aan dat hoge expressie van elk gen significant geassocieerd was met een kortere algehele overleving in beide cohorten. Figuren 3A–3C tonen de algehele overlevingscurves voor B3GNT3, FERMT1 en SPP1 in de TCGA-LUAD cohort. Figuren 3D–3F tonen de overeenkomstige curves in de GSE115002 cohort. Patiënten met hoge expressie van B3GNT3, FERMT1 of SPP1 vertoonden een verminderde mediane overleving en lagere 5-jaars overlevingspercentages. Multivariate regressieanalyse bevestigde dat een hoge SPP1-expressie een onafhankelijke slechte prognostische factor bleef. Verhoogde expressie van alle drie de genen was ook geassocieerd met een kortere ziektevrije overleving. Consistente trends in beide cohorten geven aan dat overexpressie van B3GNT3, FERMT1 en SPP1 ongunstige klinische uitkomsten bij longadenocarcinoom voorspelt.

Functionele verrijkingsanalyse

De resultaten van functionele verrijkingsanalyse zijn samengevat in Figuur 4. Figuur 4A toont GO- en KEGG-verrijking in de TCGA-LUAD-cohort, en Figuur 4B toont verrijking in de GSE115002-cohort. Opgereguleerde genen waren sterk verrijkt in celcyclusprogressie, organisatie van extracellulaire matrix, focale adhesie en oncogene signalering. Downreguliere genen waren geassocieerd met normale epitheliale differentiatie en p53-signalering. Deze observaties geven aan dat de drie kandidaatgenen deelnemen aan routes die proliferatie, invasie en immuundysregulatie bevorderen bij longadenocarcinoom.

Co-expressienetwerken

Co-expressienetwerken geassocieerd met B3GNT3, FERMT1 en SPP1 worden weergegeven in Figuur 5. Figuur 5A toont het netwerk in de TCGA-LUAD-cohort, en Figuur 5B toont het netwerk in de GSE115002 cohort. Knooppunten vertegenwoordigen genen en randen correlatiecoëfficiënten. De drie belangrijkste genen clusteren met ECM-remodeling, immuunregulatie en cytoskeletorganisatie-genen. Deze bevindingen suggereren dat overexpressie van de drie genen geassocieerd is met een immunosuppressieve tumormicro-omgeving.

Prestaties van het prognostische nomogram

Het prognostische nomogram is weergegeven in Figuur 6. Het model is geconstrueerd door pathologische T-fase, pathologische N-fase en expressieniveaus van B3GNT3, FERMT1 en SPP1 te integreren om de algehele overleving van 1, 2 en 3 jaar in LUAD te voorspellen. Punten worden toegekend aan elke variabele, en het totaal aantal punten komt overeen met de voorspelde overlevingskans. Het model behaalde een concordantie-index van 0,743, wat wijst op goede voorspellende prestaties. Kalibratiecurves toonden een nauwe overeenstemming tussen voorspelde en werkelijke overlevingskansen. Analyse van de beslissingscurve bevestigde klinisch netto voordeel. Dit nomogram verbetert de individuele overlevingsvoorspelling boven conventionele TNM-stadiëring.

Samenvattend benadrukt deze studie B3GNT3, FERMT1 en SPP1 als kernmoleculaire spelers in de pathogenese van LUAD. Hun overexpressie correleert met invasieve tumorfenotypen, stromale remodellering en immuunontwijking. Door multi-omics-integratie tonen we de gecombineerde waarde van deze genen aan voor diagnose, prognose en patiëntstratificatie. Toekomstig onderzoek moet hun voorspellende relevantie voor immunotherapierespons onderzoeken en hun potentieel als therapeutische doelwitten in LUAD beoordelen.

Figuur 1: Vulkaangrafieken van differentieel tot expressie gebrachte genen in LUAD-tumor versus normale weefsels. (A) TCGA-LUAD-dataset. (B) GSE115002 dataset. Rood duidt op aanzienlijk opgereguleerde genen; Blauw duidt op verlaagde genen. B3GNT3, FERMT1 en SPP1 worden als consequent geupreguleerd bestempeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: ROC-curves voor B3GNT3, FERMT1 en SPP1 bij het onderscheiden van LUAD van normale weefsels. (A) TCGA-LUAD cohort. (B) GSE115002 cohort. AUC-waarden tonen een hoge diagnostische nauwkeurigheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Kaplan-Meier algehele overlevingscurves, gestratificeerd op B3GNT3, FERMT1 en SPP1 expressieniveaus. (A–C) TCGA-LUAD cohort. (A) B3GNT3, (B) FERMT1, (C) SPP1. (D–F) GSE115002 cohort. (D) B3GNT3, (E) FERMT1, (F) SPP1. Hoge expressie van elk gen is significant geassocieerd met een kortere algehele overleving in beide cohorten. HR- en P-waarden uit log-rank tests worden verstrekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: GO- en KEGG-verrijkingsanalyse van de DEG's gecorreleerd met de drie sleutelgenen. (A) TCGA-LUAD cohort. (B) GSE115002 cohort. De verrijkingstermen omvatten biologisch proces (BP), cellulaire component (CC), moleculaire functie (MF) en KEGG-routes. Upregulatiegenen zijn verrijkt door proliferatie, ECM-remodellering en oncogene signalering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Genco-expressienetwerken geassocieerd met B3GNT3, FERMT1 en SPP1. (A) TCGA-LUAD cohort. (B) GSE115002 cohort. Knooppunten vertegenwoordigen genen, en randen vertegenwoordigen correlatiecoëfficiënten. De drie belangrijkste genen clusteren met ECM-remodeling, immuunregulatie en cytoskeletorganisatie-genen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Prognostisch nomogram dat pathologische T-fase, pathologische N-fase, B3GNT3, FERMT1 en SPP1-expressie integreert voor het voorspellen van de algehele overleving van 1, 2 en 3 jaar in LUAD. Punten worden toegekend aan elke variabele, en het totaal aantal punten komt overeen met de voorspelde overlevingskans. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het nomogram werd geconstrueerd met behulp van multivariate Cox-regressieanalyse op basis van de TCGA-LUAD-cohort. Voorspellers zijn onder andere pathologische T-fase, pathologische N-fase en genexpressiestatus van B3GNT3, FERMT1 en SPP1 (gecategoriseerd als Hoog versus Laag op basis van mediane expressie). Voor elke patiënt worden de individuele scores voor elke variabele opgeteld om een "Totale Punten"-waarde te genereren, die overeenkomt met geschatte overlevingskansen van 1, 2 en 3 jaar. Hogere totaalscores duiden op een verhoogd sterfterisico. Dit hulpmiddel biedt individuele overlevingsvoorspelling en helpt bij de risicostratificatie van LUAD. Machine learning is gebruikt om diverse celsterftepatronen in LUAD-prognose en therapie 21,22,23 te onthullen, wat ons nomogrammodel verder kan optimaliseren.

Deze studie identificeerde B3GNT3, FERMT1 en SPP1 als robuuste diagnostische en prognostische biomarkers in LUAD met behulp van geïntegreerde bio-informatica-analyse. Alle drie de genen worden consequent overexpressief in tumoren, onderscheiden tumoren van normaal weefsel met hoge nauwkeurigheid, voorspellen slechte overleving en reguleren routes gerelateerd aan EMT, matrixremodellering en immuunontwijking. Een gecombineerd nomogram verbetert de risicostratificatie voorbij TNM-stadie. B3GNT3 bevordert immuunontwijking door PD-L1 te stabiliseren via glycosylering ^9,10. FERMT1 verbetert integrine-signalering en celmotiliteit, wat invasie en metastase^{stimuleert 11,12}. SPP1 functioneert als een afgescheiden drijfveer van EMT, angiogenese en M2-macrofaagpolarisatie 13,14,15. Samen definiëren ze een agressief LUAD-subtype dat wordt gekenmerkt door invasieve en immunosuppressie.

Eerdere studies rapporteerden individuele rollen van B3GNT3, FERMT1 of SPP1 in LUAD. Deze studie is de eerste die alle drie valideert als een geïntegreerd panel over onafhankelijke transcriptomische cohorten, met diagnostische en prognostische prestaties bevestigd in zowel TCGA- als GEO-gegevens. Recent onderzoek naar LUAD-biomarkers ondersteunt de waarde van immuun-geassocieerde gensignaturen voor prognose en immunotherapiebegeleiding. Recente studies met geïntegreerde bio-informatica en machine learning hebben meerdere gensignaturen geïdentificeerd voor LUAD-diagnose en prognose^21,22. Deze benaderingen, vergelijkbaar met ons drie-genenpanel, benadrukken het belang van transcriptoom-gebaseerde biomarkers in klinische stratificatie.

Extracellulaire matrixremodellering is een kernkenmerk van agressieve LUAD, en ECM-gerelateerde signaturen zijn gevalideerd als onafhankelijke prognostische factoren. Onze bevindingen dat FERMT1 en SPP1 nauw samenhangen met focale adhesie en interactie tussen ECM en receptoren ondersteunen de cruciale rol van matrixremodellering in de progressie van LUAD. Net als CHAF1B en ubiquitine-gerelateerde gensignaturen die in interdisciplinaire geneeskunde (IMed)^21,23 worden gerapporteerd, zijn onze drie genen nauw geassocieerd met immuuninfiltratie en kunnen ze zowel als prognostische als voorspellende markers dienen. Alternatieve strategieën om LUAD-biomarkers te identificeren zijn onder andere single-cell RNA-sequencing, ruimtelijke transcriptomics, machine learning-gebaseerde featureselectie en plasmaproteomische profilering 24,25,26. Machine learning-algoritmen zoals random forest of LASSO kunnen de biomarkerselectie verder verfijnen. Wet-lab validatie met qPCR, IHC en ELISA is essentieel om klinische translatie te bevestigen 27,28,29,30.

Deze studie wordt beperkt door het retrospectieve ontwerp, de afhankelijkheid van openbare transcriptomische gegevens en het ontbreken van externe klinische validatie. Nomogramvalidatie was beperkt tot interne bootstrap-resampling. Bulktranscriptomische gegevens kunnen cellulaire expressie niet oplossen. Mechanistische causaliteit vereist functionele experimenten. Correlaties met immuuninfiltratie zijn gebaseerd op computationele deconvolutie en moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Toekomstige studies zouden deze biomarkers moeten valideren in prospectieve cohorten met behulp van IHC, qPCR en serum ELISA. Single-cell en ruimtelijke transcriptomics zullen cellulaire bronnen en ruimtelijke distributie verduidelijken. De voorspellende waarde van immunotherapie en gerichte therapierespons moeten worden geëvalueerd. Therapeutische targeting van B3GNT3, FERMT1 en SPP1 kan nieuwe strategieën voor de behandeling van LUAD bieden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Publicly Available Datasets	TCGA-LUAD Dataset	The Cancer Genome Atlas (TCGA) Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/); 535 LUAD tumor samples, 59 adjacent normal lung tissue samples (RNA-sequencing count/FPKM values + clinical data: survival, TNM staging)	Transcriptomic and clinical data for differential expression, survival, and nomogram analysis; primary study cohort
	GSE115002 Dataset	Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE115002); Agilent microarray, 52 LUAD tumor tissues, 52 matched adjacent normal lung tissues (treatment-naïve primary tumors)	Independent validation cohort for differential expression, diagnostic performance, and immune infiltration analysis
Bioinformatics Software & Programming Environment	R Programming Language	Version 4.1	Core platform for all transcriptomic, statistical, and graphical analyses
	R Packages (Differential Expression)	DESeq2, limma	DESeq2: TCGA RNA-seq raw count differential expression analysis; limma: GSE115002 microarray normalization and differential expression analysis (Benjamini–Hochberg FDR correction)
	R Packages (Diagnostic Analysis)	pROC	Construction of ROC curves, calculation of AUC (95% CI), optimal cutoff determination (Youden’s index) for diagnostic performance assessment
	R Packages (Survival Analysis)	survival, survminer	Kaplan–Meier survival curve generation, log-rank test, univariate/multivariate Cox proportional hazards regression (HR + 95% CI); patient stratification by median gene expression
	R Packages (Functional Enrichment)	clusterProfiler, fgsea	clusterProfiler: GO (BP/CC/MF) and KEGG pathway enrichment analysis (adjusted P < 0.05); fgsea: GSEA for MSigDB Hallmark/KEGG gene sets (FDR < 0.25)
	R Packages (Nomogram Construction & Validation)	rms	Development of prognostic nomogram (integration of gene expression + TNM stage); Harrell’s C-index calculation, bootstrap resampling (1000 repetitions) for bias correction, calibration plot generation
	R Packages (Statistical & Visualization)	ggplot2, ComplexHeatmap, corrplot	Generation of volcano plots, bubble plots (enrichment), heatmaps (immune infiltration correlation), scatter plots (gene co-expression); Pearson/Spearman correlation analysis
Bioinformatics Databases & Tools (Network/Immune Analysis)	STRING Database	Confidence score > 0.7	Construction of protein–protein interaction (PPI) networks for B3GNT3/FERMT1/SPP1 and first-degree interactors
	Cytoscape	-	Visualization of PPI and gene co-expression networks (edge weighting by correlation strength, hub gene identification)
	Immune Deconvolution Algorithm	CIBERSORT	Estimation of immune cell infiltration abundance (M2 macrophages, CD8+ T cells, neutrophils, NK cells, etc.) in LUAD samples; correlation with candidate gene expression
Other Tools	Microsoft Office/LaTeX	-	Manuscript preparation, figure assembly, and table formatting; statistical result compilation