Exogene mitochondriale overdracht bij het differentiëren van bruine adipocyten en AGPAT2-deficiënte preadipocyten

Samenvatting

Exogene mitochondriën van menselijke en muisachtige oorsprong kunnen worden geïnternaliseerd door preadipocyten te differentiëren en gedurende de adipogene differentiatie worden gevolgd met behulp van beeldvorming en genetische hulpmiddelen. Hoewel deze mitochondriën fysiek interageren met het endogene mitochondriale netwerk, verhogen ze de expressie van markers die geassocieerd zijn met volwassen bruine adipocyten niet.

Samenvatting

Mitochondriën zijn belangrijke signaalpunten; Of mitochondriale massa-expansie mechanistisch noodzakelijk is voor differentiatie blijft echter een open vraag. AGPAT2 katalyseert de omzetting van lysofosfatoxinezuur naar fosfatidinezuur, en het tekort ervan leidt tot vetweefseldeficiëntie en een verstoorde adipogenese die gepaard gaat met verminderde mitochondriale massa. De impact van mitochondriale massa-uitbreiding op adipogenese werd beoordeeld door exogene mitochondriën over te brengen in differentiërende bruine adipocyten. Ook werd onderzocht of mitochondriale overdracht de verstoorde adipogenese van AGPAT2-deficiënte cellen kon redden. Menselijke en muismitochondriën werden met succes overgebracht en opgenomen in het endogene mitochondriale netwerk van differentiërende muispreadipocyten en bleven bestaan gedurende de bruine adipogenese. Adipogene differentiatie was vereist voor het behoud van overgedragen mitochondriën. Mitochondriale overdracht veranderde de expressie van moleculaire markers van rijpe bruine adipocyten of de inhoud van lipidendruppels niet, hoewel het de relatieve verdeling van de grootte van de lipidendruppels op soortafhankelijke wijze beïnvloedde. Bij Agpat2^-/- preadipocyten slaagde mitochondriale transfer er niet in de adipogenese te redden, wat aangeeft dat de groei van de mitochondriale massa alleen onvoldoende is om de mechanismen die leiden tot lipodystrofie in dit model om te keren. Deze resultaten geven aan dat, hoewel exogene menselijke en muismitochondriën kunnen worden opgenomen in het mitochondriale netwerk van differentiërende adipocyten, ze het adipogene programma niet direct beïnvloeden.

Inleiding

Naast hun primaire bio-energetische rol dienen mitochondriën als signaalknooppunten in meerdere cellulaire processen, waaronder celdifferentiatie 1,2,3,4. Bruin vetweefsel (BAT) heeft een opmerkelijk hoge mitochondriale massa ter ondersteuning van zijn thermogene activiteit, wat zijn rol in de energiebalans van het hele lichaam en in de pathogenese van obesitas⁵ benadrukt. Hoewel de mitochondriale massa wordt gereguleerd door het evenwicht tussen biogenese en mitofagie, blijft het onduidelijk of de uitbreiding van de mitochondriale massa tijdens de differentiatie van bruine adipocyten functioneel noodzakelijk is voor adipogenese of slechts een gevolg van het proces.

Fysiologische mitochondriale overdracht tussen cellen is zowel in vitro als in vivo gedocumenteerd, waarbij het bijdraagt aan weefseladaptatie onder pathologische omstandigheden, waaronder vetweefseldysfunctie geassocieerd met obesitas en insulineresistentie ^6,7. Bovendien is aangetoond dat kunstmatige mitochondriale overdracht in vitro de ademhalingscapaciteit van ontvangende cellen⁸ verbetert. Samen ondersteunen deze bevindingen het concept dat mitochondriale overdracht de cellulaire metabole functie kan wijzigen en kan bijdragen aan weefseladaptatie onder omstandigheden van bio-energetische stress ^9,10,11. In vergelijking met farmacologische of genetische strategieën die endogene mitochondriale biogenese stimuleren door nucleaire en mitochondriale transcriptieprogramma's te activeren, levert mitochondriale overdracht organellen direct aan ontvangende cellen, waardoor snelle modificatie van mitochondriale massa onafhankelijk van transcriptiemanipulaties^{mogelijk is 12,13}. Deze aanpak is cruciaal voor het corrigeren van defecten bij mitochondriale ziekten, maar maakt het ook mogelijk mitochondriale werkingen te bestuderen zonder de mogelijke off-target effecten van farmacologische of genetische benaderingen¹⁴.

In deze studie onderzochten we het effect van kunstmatig vergroten van de mitochondriale massa door exogene mitochondriale transfer bij het differentiëren van bruine adipocyten. Deze aanpak maakte directe beoordeling mogelijk van de impact van mitochondriale massa op het adipogene programma. Om dit te bereiken werden mitochondriale transferprotocollen die oorspronkelijk voor mesenchymale stamcellen waren ontwikkeld, aangepast¹⁵ waarbij zowel menselijke levercellen als muispreadipocyten als mitochondriale donoren werden gebruikt. Een methode om menselijke mitochondriën in differentiërende muiscellen te volgen werd ontwikkeld met genetische instrumenten gecombineerd met beeldvormingstechnieken, waarmee werd aangetoond dat mitochondriën van beide oorsprongen worden opgenomen in het endogene mitochondriale netwerk en voortbestaan gedurende de adipogene differentiatie.

Om defecte adipogenese geassocieerd met een lage mitochondriale massa te modelleren, werden gedifferentieerde bruine adipocyten gebruikt die zijn afgeleid van 1-acylglycerol-3-fosfaat-O-acyltransferase 2 (AGPAT2)-deficiënte (Agpat2^-/-) muizen. AGPAT2 wordt sterk tot expressie gebracht in vetweefsel, waar het de vorming van fosfatidinezuur in de glycerolipidenbiosyntheseroute katalyseert. AGPAT2-tekort veroorzaakt ernstige lipodystrofie bij zowel mensen als muizen en belemmert adipogenese in witte en bruine adipocytenmodellen in verband met verminderde mitochondriale massa 16,17,18. Opname van exogene mitochondriën in differentiërende preadipocyten veranderde de verdeling van lipidendruppels licht, maar verhoogde de expressie van rijpe bruine adipocytenmarkers niet en redde de adipogene inbreuk van Agpat2^-/preadipocyten niet.

Protocol

Dierprocedures werden goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor Dierenverzorging en Gebruik van de Pontificia Universidad Católica de Chile, protocol 210609003. Wildtype- en Agpat2^-/- P0.5 neonatale muizen van beide geslachten, afgeleid van een gemengde C57BL/6J- en 129J-genetische achtergrond, werden in deze studie gebruikt. Persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM): Draag een laboratoriumjas, veiligheidsbril en nitrilhandschoenen. Zie Supplemental File 1 voor aanvullende protocoldetails en Tabel 1 voor de buffers die voor dit protocol nodig zijn.

Al het giftige chemische afval dat vrijkomt tijdens de voorbereiding van elektronenmicroscopie, paraformaldehydefixatie en nucleïnezuurextractie moet strikt worden gescheiden in aangewezen, duidelijk gelabelde stromen in overeenstemming met de institutionele regelgeving voor milieugezondheid en veiligheid (EHS). Onder geen enkele omstandigheid mag een van deze reagentia worden geloosd in de laboratoriumgootsteen of het openbare rioolsysteem. Al het geproduceerde gevaarlijke chemische afval moet worden gesegregeerd volgens institutionele EHS-classificaties.

1. Celkweek

1. Isolatie, differentiatie en onderhoud van primaire adipocyten (iBAT)
   OPMERKING: Zie Supplemental File 1 voor een korte beschrijving van de procedures en Tabel 1 voor de samenstelling van de vereiste oplossingen. Een volledige en gedetailleerde uitleg van ons in vitro brown adipogenic differentiatieprotocol is te vinden in Figueroa et al.19.
   1. Isoleer preadipocyten uit het interscapulaire bruine vetweefsel (iBAT) van neonatale (P0,5) muizen volgens de chirurgische en enzymatische verteringsprocedures beschreven door Figueroa et ^al.19.
   2. Differentieer en onderhoud de bruine adipocytencultuur volgens het differentiatie-cocktail- en media-uitwisselingsschema.
      OPMERKING: Voor een succesvolle adipogene differentiatie is het van cruciaal belang dat culturen 90–100% confluent bereiken voordat de adipogene inductie wordt gestart.
2. HepG2-cultuur
   1. Kweek HepG2-cellen in DMEM aangevuld met 10% foetaal rundserum, 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine en 0,25 μg/mL amfotericine B. Houd de cellen op 37 °C in een bevochtigde couveuse met 5%_CO2.
      OPMERKING: Deze cellen groeien in clusters en kunnen subconfluent lijken ondanks hoge dichtheid door meerlaagse groei.

2. Mitochondriale isolatie en overdracht

1. Mitochondriale isolatie
   OPMERKING: Voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast bij 4 °C of op ijs. Gebruik de bereiding binnen 2 uur.
   1. Zaad 2 × 10^{à 6} donorcellen (HepG2 of preadipocyten) in 100 mm kweekschotels. Kweek cellen totdat ze 80% (HepG2) of 100% (preadipocyten) samenvloeiing bereiken.
   2. Kleurdonorcellen met 100 nM MitoTracker Deep Red FM in FBS-vrij medium gedurende 30 minuten bij 37 °C in een 5% CO2-incubator.
   3. Was de cellen twee keer met groeimedium om overtollige kleurstof te verwijderen.
   4. Verwijder cellen met trypsine, verzamel de suspensie en centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   5. Susse de pellet opnieuw in 1 mL mitochondriale isolatiebuffer (MIB) aangevuld met BSA, proteaseremmers en fosfataseremmers. Verstoor het plasmamembraan door de suspensie 5 keer door een tuberculinespuit te halen. Homogeniseer de suspensie door deze minstens 10 keer door een insulinespuit te halen totdat de oplossing lichtbruin is en geen zichtbare klonten meer heeft.
      OPMERKING: Voor western blot-analyse moet je 50 μL van het totale lysaat opslaan bij -20 °C.
2. Centrifugeer het homogenaat op 900 × g gedurende 11 minuten bij 4 °C.
   OPMERKING: Als het supernatant na de 900 × g spin niet troebel is, is de cellulaire lysis waarschijnlijk onvolledig.
   1. Verzamel het supernatant en centrifugeer op 10.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de mitochondriën te pelleten. Was de mitochondriale pellet 3 keer met MIB en aangevuld met BSA.
   2. Voer een laatste ophanging uit in 100 μL BSA-vrije MIB. Kwantificeer de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-eiwitassay.
3. Mitochondriale overdrachtsassay (MTA) in preadipocyten
   1. Zaadontvangers preadipocyten op 5 × 10⁵ cellen/put in 12-put platen (met 18 mm dekfolies voor microscopie) 24 uur voor de assay.
   2. Voeg geïsoleerde donormitochondriën direct toe aan het ontvangermedium in een verhouding van 10 μg mitochondriaal eiwit per 10^{à 5} cellen. Wieg de platen voorzichtig om de mitochondriën te verdelen. Incubeer cellen gedurende 24–120 uur (overeenkomend met dag 1, 3 en 5 van differentiatie) bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂ vóór de analyse.

3. Mitochondriale zuurstofverbruik en MTA-efficiëntie

1. Mitochondriale respirometrie
   1. Stel het externe circulerende waterbad in op 25 °C en zorg voor een stabiel thermisch evenwicht in de kamermantel voordat je met metingen begint.
   2. Voer een tweepunts vloeistoffase-kalibratie uit met behulp van de acquisitiesoftware van het instrument.
      1. Luchtverzadigingskalibratie (High Point): Voeg 500 μL luchtverzadigd gedemineraliseerd water toe aan de kamer. Stel de magnetische roeraar in op 60 rpm en neem het signaal op totdat het op een plateau stabiliseert (>1.500 mV).
      2. Zero-oxygen kalibratie (Low Point): Voeg een kleine (~3 mm diameter) hoeveelheid natriumsulfiet toe aan de kamer om eventuele resterende lucht te verdringen. Neem op totdat het signaal daalt tot een stabiel basisniveau (~1% van het basale signaal, ~20 mV).
   3. Start realtime opname (totale looptijd: ~10 min).
   4. Record 3 minuten totdat een stabiele lineaire meting is bereikt.
   5. Resuspendeer geïsoleerde mitochondriën in 200 μL mitochondriale assay buffer (MAS)²⁰, aangevuld met 5 mM glutamaat en 2,5 mM malaat.
      OPMERKING: Voor het huidige werk werd de pellet van totale mitochondriën geëxtraheerd uit twee celplaten van 100 mm.
   6. Breng de suspensie over naar de oxygraafkamer en sluit de sluitingszuiger van de kamer stevig, zodat er geen luchtbellen achterblijven.
   7. Recordzuurstofverbruik van 3 minuten.
   8. Voeg 150 μM ADP toe om mitochondriale gekoppelde ademhaling te activeren en meet de ATP-synthese-gekoppelde ademhaling gedurende 3 minuten.
   9. Definieer handmatig de stabiele, lineaire segmenten die overeenkomen met elke ademhalingsfase. Haal de geautomatiseerde hellingswaarden uit die door de software zijn berekend, uitgedrukt als zuurstofverbruikssnelheden in nmol∙^mL-1∙^min-1.
      OPMERKING: Voor het reinigen van de interplate-kamer, spoel de kamer 2x met 1 ml gedemineraliseerd water en zorg dat het interieur volledig droog is. Voeg 100 μL PBS toe aan de kamer voordat je doorgaat naar de volgende plaat.
2. Flowcytometrie
   OPMERKING: Houd alle monsters tijdens de procedure op ijs om de cel- en bio-energetische integriteit te behouden.
   1. Isoleer mitochondriën en voer mitochondriale overdrachtstest (MTA) uit, zoals beschreven in secties 2.1 en 2.2, respectievelijk, in 35 mm kweekschotels, met donorcellen die eerder zijn gelabeld met MitoTracker Deep Red FM.
   2. Aspireer het kweekmedium en was de celmonolaag één keer met 1 ml steriele PBS.
   3. Voeg 500 μL van 0,25% trypsine-EDTA toe en laat de schalen incuberen op 37 °C totdat volledige celloslating onder een microscoop is waargenomen.
   4. Neutraliseer trypsine door 1 ml complete groeimedium toe te voegen (DMEM met 10% FBS). Breng het volledige volume over in een 15 mL conische buis en centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   5. Verwijder het supernatant door aspiratie en houd de celpellet vast. Suss de pellet opnieuw in 500 μL ijskoude PBS door zacht te pipetteren.
   6. Analyseer de monsters met een flowcytometer uitgerust met een 640 nm laser (zie Supplemental File 1 voor details over flowcytometrie-acquisitie en analyse).
      1. Definieer de celpopulatie met behulp van Forward Scatter (FSC) versus Side Scatter (SSC) plots en pas een gatingstrategie toe om puin en celdoublets uit te sluiten.
      2. Kwantificeer de fluorescentieintensiteit in het ver-rode kanaal (670/30 nm emissiefilter) om geïnternaliseerde MitoTracker-gelabelde mitochondriën te detecteren.
      3. Voer analyse uit met Floreada.io (zie Supplemental File 1 voor details over het gatingprotocol).
         OPMERKING: Voeg een negatieve controle toe (ontvangercellen zonder MTA) om de basislijn voor achtergrondautofluorescentie in te stellen.
3. Confocale en elektronenmicroscopie
   1. Beeldvorming van levende cellen
      1. Zaad primaire preadipocyten afkomstig van P0.5 neonatale muizen in 12-wellplaten met 18 mm dekkings, volgens de specifieke celdichtheids- en mediavereisten zoals beschreven in Sectie 1.
      2. Isoleer mitochondriën en voer de mitochondriale overdrachtstest (MTA) uit met donorcellen die eerder zijn gelabeld met MitoTracker Deep Red FM, zoals gespecificeerd in Sectie 2.
      3. Houd de ontvangerculturen 24 uur in een bevochtigde couveuse op 37 °C met 5%_CO2 om mitochondriale opname mogelijk te maken.
      4. Bereid een 70 nM MitoTracker Green werkoplossing voor door de voorraad te verdunnen in een FBS-vrij kweekmedium.
      5. Aspiraat het groeimedium uit de 12-put platen en vervang het door de 70 nM MitoTracker Green-oplossing. Incubeer de platen 25 minuten bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5%_CO2 om het totale mitochondriale netwerk tegen te gaan.
      6. Verwijder de kleuroplossing en was de dekfolies twee keer met 1 ml warm, volledig kweekmedium.
      7. Vervang het uiteindelijke volume door fenolroodvrij volledig medium om achtergrondautofluorescentie tijdens de acquisitie te minimaliseren.
      8. Breng de dekfolies of de plaat over naar de confocale microscoopfase. Stel de incubatiekamer van de microscoop zo in dat een constante omgeving van 37 °C en 5%_CO2 blijft.
      9. Maak direct beelden met de juiste excitatie-/emissie-instellingen voor zowel het ver-rode (MitoTracker Deep Red FM) als het groene (MitoTracker Green) kanaal. Zie Supplemental File 1 voor meer details.
         OPMERKING: Voer alle kleurings- en hanteringsstappen uit onder weinig licht om fotobleeken van de fluoroforen te voorkomen. Gebruik een hoog-numerieke apertuur (NA) olie-immersieobjectief (60x of 100x) voor optimale resolutie van mitochondriale morfologie.
   2. Confocale immunofluorescentietest met gefixeerde cellen
      OPMERKING: Na celfixatie worden giftige paraformaldehyde- en glutaraldehydeoplossingen geclassificeerd als niet-halogeneerde organische stoffen. Nucleïnezuurextractie-bijproducten vereisen strikte scheiding: fenol/chloroform-mengsels moeten worden afgevoerd als gehalogeneerde organische stoffen, terwijl guanidinium-gebaseerde buffers worden geclassificeerd als corrosieve organische stoffen.
      1. Zaadprimaire preadipocyten afkomstig van P0.5 neonatale muizen in 12-wellplaten met 12 mm dekfolies, zoals beschreven in Sectie 1.
      2. Isoleer mitochondriën en voer de mitochondriale overdrachtstest (MTA) uit volgens de procedures die in Sectie 2 zijn gespecificeerd.
      3. Incubeer de culturen 24 uur om mitochondriale opname mogelijk te maken.
      4. Induceer bruine adipogene differentiatie door het protocol te volgen dat is beschreven in Supplemental File 1 en raadpleeg Tabel 1 voor de samenstelling van de benodigde buffers.
      5. Fixeer de cellen op dag 7 van differentiatie (168 uur). Aspiratief het kweekmedium en voeg 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA) per put toe. Incubeer 20 minuten op kamertemperatuur.
      6. Was de dekfolies twee keer door per put 1 ml ijskoude PBS toe te voegen. Permeabiliseer en blokkeer de cellen door de dekfolies te incuberen in PBS met 0,05% saponine en 0,2% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Plaats de plaat onder voorzichtige beweging op een orbitale shaker.
      7. Was de cellen twee keer met 1 ml PBS. Kleur de kernen en lipidedruppels tegelijkertijd. Pas 1 μg/mL Hoechst 33342 en 1 μg/mL BODIPY aan die zijn bereid in de blokkerings-/permeabilisatiebuffer. Incubeer 30 minuten op kamertemperatuur, zodat de plaat beschermd is tegen licht.
      8. Was de dekfolies 2 keer met 1 ml ijskoude PBS. Bevestig de dekfolies op schone glazen glijplaten. Dodeer 10 μL montagemiddel op de schuif en plaats de coverslip-celzijde naar beneden op het montagemedium. Laat de monsters een nacht drogen in een donkere omgeving bij kamertemperatuur voordat je beelden maakt.
      9. Maak beelden met een confocale microscoop. Gebruik twee fluorescentiekanalen die zijn gekalibreerd voor de emissiespectra van Hoechst en BODIPY. Zie Supplemental File 1 voor extra beeldvormingsdetails.
      10. Voer een lipidendruppelanalyse uit met ImageJ v1.54s. Open het lipidedruppelkanaal, identificeer individuele druppels handmatig met behulp van de Freehand-selecties en ROI Manager-tools , en bereken het druppeloppervlak met de Analyze | Meetcommando .
      11. Verwerk en analyseer de resulterende gegevens met behulp van de R-scripts die zijn geleverd in Supplemental File 2 binnen de RStudio v4.5.2-omgeving.
          OPMERKING: Maak precies vijf afbeeldingen per omslagbriefje met 10x vergroting om representatieve bemonstering te garanderen. Gebruik R versie 4.5.2 of hoger voor compatibiliteit met de meegeleverde scripts.
   3. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
      OPMERKING: Voor bijproducten van elektronenmicroscopie moeten zeer giftige osmiumtetroxide en arseenhoudende natriumcacodylaatbuffers worden verzameld als giftig zware metalenafval, terwijl uranylacetaat apart wordt behandeld als radioactief zware metaalafval onder institutionele stralingsveiligheidsprotocollen.
      1. Centrifugeer de geïsoleerde mitochondriën uit sectie 2 op 10.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om een compacte pellet te verkrijgen.
      2. Herstel de pellet door 2,5% glutaraldehyde toe te voegen aan een 0,1 M natriumcacodylaatbuffer (pH 7,0). Broeuw 2 uur uit bij 4 °C.
         OPMERKING: Gebruik altijd glutaraldehyde-voorraadoplossingen en voer de eerste fixatiestappen uit in een chemische dampafzuigkap. Draag nitril handschoenen en een veiligheidsbril voor oogbescherming. Vermijd elk contact met verwarmingsbronnen, omdat verwarmde glutaraldehyde sterk irriterende dampen vrijgeeft.
      3. Was de mitochondriale voorbereiding 3 × 10 minuten met 0,05 M natriumcacodylaatbuffer en centrifugeer kort om de pellet tussen de bufferwissels te behouden.
      4. Fixeer het monster na de behandeling door 1% waterig osmiumtetroxide (OsO₄) toe te voegen. Incubeer 15 minuten op kamertemperatuur.
         OPMERKING: Osmiumtetroxide mag alleen worden geopend en verwerkt in een gecertificeerde, volledig functionerende chemische dampafzuigkap. Draag een labjas, veiligheidsbril of een volledig gezichtsscherm, en dikke of dubbele nitril handschoenen (wissel onmiddellijk van handschoen als er spettering optreedt, want OsO₄ kan na verloop van tijd door dunne nitril heendringen).
      5. Was het monster 3 × 5 minuten met dubbel gedestilleerd water. Kleur de pellet 15 minuten met 1% waterig uranylacetaat.
         OPMERKING: Werk op wegwerppapier met plastic rug. Wijd een specifiek deel van het lab aan radioactieve kleuring. Draag dubbele handschoenen, een labjas en veiligheidsbril. Was je handen grondig nadat je de procedure hebt voltooid.
      6. Dehydrateer de preparaat met een gegradueerde ethanolreeks. Incubeer de pellet in 30%, 50%, 70%, 95% en 100% ethanol gedurende 5 minuten bij elke concentratie.
      7. Plaats de mitochondriale fracties. Incubeer 30 minuten in een 1:1 Epon/ethanoloplossing, gevolgd door 1 uur pure Epon-hars.
      8. Breng de monsters over in inbeddingmallen en polymeriseer in een oven van 60 °C gedurende 48 uur.
      9. Bevestig de resinblokken aan het ultramicrotoom en snijd ultradunne secties (80 nm).
      10. Verzamel secties op rasters. Kleur de roosters 4 minuten met 1% waterig uranylacetaat. Spoel af met dubbel gedestilleerd water.
      11. Kleur 5 minuten met loodcitraat volgens Reynolds' methode²¹. Spoel grondig af. Visualiseer de rasters met behulp van de TEM. Zie Supplemental File 1 voor details over de Reynolds-methode en TEM-beeldverwerving.

4. Moleculaire kwantificatie

1. Mitochondriale DNA (mtDNA) standaardcurve
   1. Zaad HepG2-cellen in vijf kweekschalen van 100 mm. Bred de culturen uit tot ze 80% van de confluence bereiken.
   2. Isoleer de mitochondriën van de geoogste cellen door de technische procedure te volgen die in Sectie 2 is beschreven.
   3. Extraheer het totale DNA uit de resulterende mitochondriale pellet met behulp van de zuur-guanidinium-fenol-chloroform methode zoals beschreven in Sectie 4.2.6. Meet de DNA-concentratie en evalueer de zuiverheid (A₂₆₀/A₂₈₀ en (A₂₆₀/A₂₃₀ ratio's)) met een microvolume UV-Vis spectrofotometer.
   4. Bereid een seriële verdunningsreeks voor met nucleasevrij water als verdunningsmiddel. Verdun de DNA-voorraad om de uiteindelijke hoeveelheden van 1, ^10-1, ^10-2, ^10-3, ^10-4 en ^10-5 ng per reactievolume te bereiken. Vortex elke verdunning voor 5 seconden om volledige homogeniteit te garanderen voordat je doorgaat naar de volgende stap in de reeks.
      OPMERKING: Pas het concentratiebereik van de standaardcurve aan op basis van de specifieke monsterconcentratie en het uiteindelijke PCR-reactievolume.
2. Detectie van menselijk mtDNA in ontvangende cellen
   1. Zaad primaire preadipocyten afkomstig van P0,5 neonatale muizen in 60 mm kweekschaaltjes, volgens de dichtheids- en mediacondities gespecificeerd in Sectie 1.
   2. Isoleer mitochondriën uit donor HepG2-cellen en voer de mitochondriale overdrachtstest (MTA) uit zoals beschreven in Sectie 2.
   3. Incubeer de culturen 24 uur bij 37 °C en 5%_CO-2.
   4. Induceer bruine adipogene differentiatie gedurende 24–120 uur (op dag 1, 3 en 5) door het media-uitwisselingsprotocol te volgen zoals beschreven in Sectie 1.
   5. Aspireer het kweekmedium en was de cellen twee keer met 2 ml ijskoude PBS.
   6. Extraheer het totale DNA met de zuur-guanidinium-fenol-chloroform methode²².
      OPMERKING: Aliquot en voer altijd fasescheiding uit in de dampkap om het inademen van giftige fenoldampen te voorkomen. Gebruik handschoenen met dubbele nitril of zware chemisch bestendige handschoenen.
   7. Voer fase-scheiding uit en verwijder de volledige waterige fase boven de interfase.
      KRITIEKE STAP: Verwijder de waterige fase volledig om besmetting te voorkomen en een hoge DNA-zuiverheid te garanderen voor downstream qPCR.
   8. Voeg 0,3 mL 100% ethanol toe per 1 mL van het initiële extractie-reagens. Sluit de tube af en meng krachtig door inversie.
   9. Laat het 3 minuten staan op kamertemperatuur en centrifugeren op 2.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C om het DNA te pelleten.
   10. Breng het fenol-ethanol supernatant over naar een aparte buis voor mogelijke eiwitisolatie. Sussief de DNA-pellet opnieuw in 1 mL 0,1 M natriumcitraat (in 10% ethanol, pH 8,5) per 1 mL extractiereagens dat wordt gebruikt.
   11. Laat het 30 minuten staan op kamertemperatuur, draai het een paar keer voorzichtig om, en centrifugeer op 2.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
   12. Herhaal de natriumcitraatwasstappen nog twee keer.
   13. Was de resulterende pellet met 2 mL 75% ethanol per 1 mL initiële extractie-reagens.
   14. Laat het 20 minuten op kamertemperatuur staan en centrifugeren op 2.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   15. Gooi het supernatant weg en laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen. Oplos het DNA door 0,3–0,6 mL van 8 mM NaOH toe te voegen en herhaaldelijk op en neer te pipetteren totdat de pellet verdwijnt.
   16. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 10 minuten op 4 °C om onoplosbaar vuil te verwijderen. Breng het supernatant over in een steriele buis en stel de pH aan op 7–8 met behulp van HEPES.
   17. Meet DNA-concentratie en zuiverheid ((A(260)/A(280) en (A(260)/A(230)) verhoudingen) met behulp van een microvolume UV-Vis spectrofotometer.
   18. Verdun het sjabloon tot een uiteindelijke hoeveelheid van 15 ng totaal DNA in nucleasevrij water. Voer kwantitatieve real-time PCR (qPCR) uit voor menselijk mtDNA met behulp van optische 96-wellplaten zoals gespecificeerd in Sectie 4.3.
   19. Analyseer de amplificatieresultaten door een logaritmisch regressiemodel toe te passen.
       OPMERKING: Voer de logaritmische regressieanalyse uit met behulp van DNA-concentratie en bijbehorende drempelcyclus (Ct) waarden als variabelen.
3. RT-qPCR voor genexpressie
   1. Celvoorbereiding en differentiatie
      1. Zaadprimaire preadipocyten afkomstig van P0,5 neonatale muizen in 60 mm kweekschotels zoals beschreven in Sectie 1.1.
      2. Isoleer mitochondriën en voer de mitochondriale overdrachtstest (MTA) uit volgens de procedures in Sectie 2. Bred de culturen 24 uur uit.
      3. Induceer bruine adipogenese gedurende 24–120 uur (bemonstering op dag 1, 3 en 5 van differentiatie) volgens het protocol in Sectie 1.
   2. Totale RNA-isolatie
      1. Verwijder het kweekmedium en voeg 1 mL zuur-guanidinium-fenol-chloroform extractie-reagens toe per 1 × 10 à⁶ cellen direct aan het schaaltje. Homogeniseer de monsters door herhaald te pipetteren totdat het lysaat uniform is.
         OPMERKING: Aliquot en voer altijd fasescheiding uit in de dampkap om het inademen van giftige fenoldampen te voorkomen. Gebruik handschoenen met dubbele nitril of zware chemisch bestendige handschoenen.
      2. Voeg 0,2 mL chloroform toe per 1 mL extractie-reagens die wordt gebruikt. Sluit de buisjes stevig af en schud krachtig met de hand gedurende 15 seconden. Laat het 3 minuten op kamertemperatuur staan en centrifugeren op 12.000 × g 15 minuten bij 4 °C.
      3. Breng de bovenste waterige fase voorzichtig over naar een nieuwe nucleasevrije buis. Vermijd contact met de interfase. Houd de monsters op ijs.
      4. Voeg 0,5 mL isopropanol toe per 1 mL extractantreagens dat wordt gebruikt. Meng voorzichtig door omkering en laat het 10 minuten op kamertemperatuur incuberen.
      5. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het RNA te pelleten. Gooi het supernatant weg door inversie.
      6. Was de RNA-pellet met 1 mL 75% ethanol. Vortex kort en centrifugeren op 7.500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      7. Gooi het supernatant weg en laat de RNA-pellet 10 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur. Suspendeer de pellet opnieuw in 30 μL nucleasevrij water. Incubeer de monsters op 60 °C gedurende 15 minuten om volledige oplosbaarheid te garanderen.
      8. Bepaal RNA-concentratie en zuiverheid (A₂₆₀/_{A 280-verhoudingen} ) met behulp van een microvolume UV-Vis spectrofotometer.
      9. Controleer de integriteit van RNA via agarosegel-elektroforese.
   3. DNase-behandeling
      1. Voeg 0,1 volumes van 10× DNase-buffer en 1 μL DNase-enzym toe aan elk RNA-monster. Meng voorzichtig door te pipetteren. Incubeer de reacties bij 37 °C gedurende 30 minuten.
      2. Suspendeer het DNase-inactivatiereagens opnieuw door te flikkeren of vortexen totdat de slurry homogeen is. Voeg het Inactivatiereagens toe (0,1 volumes RNA-monster of 2 μL, afhankelijk van wat groter is) en meng grondig. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur. Tik de buizen drie keer in deze periode om het reagens in suspensie te houden.
      3. Centrifugeer op 10.000 × g gedurende 1,5 min. Breng het RNA-bevattende supernatant over naar een nieuwe buis.
         KRITIEKE STAP: Zorg ervoor dat er geen DNase-inactivatie-reagens wordt meegenomen, omdat dit de daaropvolgende cDNA-synthese remt.
   4. Omgekeerde transcriptie (RT)
      1. Kwantificeer het behandelde RNA en verdun in nucleasevrij water om tot 2 μg totaal RNA per 20 μL reactie te gebruiken.
      2. Bereid de RT mastermix op ijs voor volgens de instructies van de fabrikant. Doseer het mengsel in reactiebuizen en voeg de RNA-monsters toe.
      3. Laad in een thermische cycler en voer het reverse transcriptieprogramma uit zoals gespecificeerd door de fabrikant van de kit.
   5. Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)
      1. Gebruik het cDNA dat in Sectie 4.3.4 is gegenereerd als PCR-sjabloon. Verdun het cDNA in nucleasevrij water tot een werkconcentratie van 20 ng per reactie van 10 μL. Houd alle reagentia op ijs.
      2. Maak een mastermix met SYBR Green, primers en nucleasevrij water. Neem overtollig volume mee voor pipetverlies. Doseer 10 μL van het reactiemengsel in elke put van een optische qPCR-plaat.
      3. Sluit de plaat af met optische kleeffolie en centrifugeer kort om de vloeistof onderaan op te vangen. Laad de plaat in een realtime PCR-instrument en voer versterking uit met behulp van de snelle cyclusmodus.
      4. Bepaal de drempelcyclus (Ct) waarden en voer relatieve kwantificatie uit met behulp van de ΔΔCt-methode. Voeg aan het einde van de run een smeltcurveanalyse toe om de specificiteit van versterking te verifiëren.
         OPMERKING: Normaliseer de hoeveelheid doel-mRNA tot 36B4 mRNA-niveaus als het endogene huishoudgen. Draai de qPCR-platen binnen 2 uur na de installatie; anders bewaar je de verzegelde borden bij 4 °C.
4. Westelijk vlek
   1. Kwantificeer de eiwitconcentratie uit hele cel- en mitochondriale extracten (zie secties 2.1.8 en 2.1.12) met behulp van een BCA-assay.
   2. Bereid 30 μg eiwit per monster voor en voeg het juiste volume SDS-PAGE monsterlaadbuffer toe (bijv. Laemmli-buffer).
   3. Denatureer de monsters door 5 minuten op 95 °C te verhitten (of volg specifieke temperatuurvereisten voor membraaneiwitten).
   4. Laad de monsters in de putten van een polyacrylamidegel. Eiwitten worden gescheiden door natriumdodecylsulfaat–polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) bij een constante spanning (bijv. 80–120 V) totdat de verfvoorkant de onderkant van de gel bereikt.
   5. Activeer een PVDF-membraan door het 1 minuut in 100% methanol te dompelen, gevolgd door evenwicht in de transferbuffer.
   6. Stel de overdrachtssandwich samen en zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de gel en het membraan zijn.
   7. De eiwitten worden overgebracht op het PVDF-membraan door te elektroblotten bij 400 mA gedurende 2 uur. Houd het systeem gedurende het hele proces op 4 °C.
   8. Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen door het membraan te incuberen in 5% magere melk bereid in Tris-gepufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (TBS-T) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   9. Incubeer het membraan met primaire antilichamen (verdund 1:1.000 in blokkerende oplossing) een nacht bij 4 °C onder zachte roering.
   10. Was het membraan 3 × 15 minuten met TBS-T.
   11. Incubeer met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 2 uur op kamertemperatuur.
   12. Was het membraan 3 keer met TBS-T, gevolgd door een laatste was van 5 minuten met 1× theelepels.
   13. Visualiseer de eiwitbanden met behulp van een enhanced chemiluminescence (ECL) substraat. Vang het signaal op met een digitaal beeldvormingssysteem.
       OPMERKING: Pas het percentage polyacrylamide gel aan (bijv. 8%, 10% of 12%) aan op basis van het molecuulgewicht van de doeleiwitten. Als het elektrotransferapparaat geen actief koelsysteem heeft, vervang dan elk uur ijscontainers en houd de kamer ondergedompeld in een ijsbad. Bewaar membranen in 1× TBS bij 4 °C als de visualisatie vertraagd is.

Resultaten

Mitochondriale extractie en structurele en respiratoire integriteit

Om de impact van verhoogde mitochondriale massa op bruine adipogenese te evalueren, werd een mitochondriale overdrachtstest (MTA) uitgevoerd in ongedifferentieerde preadipocyten (Figuur 1A). Mitochondriën werden geïsoleerd uit primaire muispreadipocyten (mMito) en uit de humane hepatische HepG2-cellijn (hMito). Western blot-analyse toonde aan dat ...

Discussie

Biologische implicaties van mitochondriale overdracht bij adipogenese

Onze resultaten tonen aan dat hoewel exogene mitochondriën van zowel menselijke als muisbronnen kunnen worden opgenomen in het endogene mitochondriale netwerk van differentiërende preadipocyten, een kunstmatige toename van mitochondriale massa onvoldoende is om het bruine adipogene programma aan te sturen. Deze bevindingen suggereren dat de mitochondriale expansie die kenme...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 mm plate	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
12 mm glass coverslips	Marienfeld	111520
12-well plate	SPL Life Science	30012SPL
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Invitrogen	28908
18 mm glass coverslips	HART	-
24-well plate	SPL Life Science	30024SPL
3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610158
35 mm plate	SPL Life Science	20035SPL
6-well plate	SPL Life Science	30006SPL
60 mm culture dish	SPL Life Science	20060SPL	Wordt gebruikt voor primaire preadipocyten en DNA/qPCR-experimenten; leverancier/catalogus niet verstrekt
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL (Insulin)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarose	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	Wordt gebruikt voor RNA-integriteitsverificatie; leverancier/catalogus niet verstrekt
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7077
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Axio Observer inverted microscope stand	Carl Zeiss	431007-9901-000	Toegevoegd vanuit aanvullende methoden
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	Toegevoegd vanuit aanvullende methoden; catalogus niet verstrekt
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	Toegevoegd vanuit aanvullende methoden
BD LSRFortessa X-20 cell analyzer	BD Biosciences	-	Bestaande invoer gestandaardiseerd om overeen te komen met aanvullend bestand
BioRender	BioRender	-	Wordt gebruikt om de workflow van Figuur 1 te maken
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA Reverse Transcription Kit	Invitrogen	4374966
Cell Strainer 100 μm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 μm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM Powder, High Glucose, Pyruvate	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, no phenol red	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	Solvent voor inductiemedium; leverancier/catalogus niet verstrekt
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Fetal bovine serum	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	Flow cytometry analysesoftware
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH Antibody	Santa Cruz	sc-32233
Glucose	Gibco	15023-021
Glutamate	Sigma	G1626
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	Statistische/logaritmische regressieanalysesoftware
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	Software voor analyse van lipidedruppelbeelden
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin syringe	Cranberry	AAJECIN3	Wordt gebruikt voor celhomogenisatie; leverancier/catalogus niet verstrekt
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
LAMP-1 Antibody	Abcam	ab25245
Lane Marker Reducing Sample Buffer	Thermo Scientific	39000
Malate	Sigma	M1000
MgCl2	Calbiochem	208291	On