Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Sesquiterpenelacton XTT verzwakt effectief lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde ontstekingsreacties in macrofagen. XTT richt zich op IKKα/β om NF-κB-signalering te remmen zonder de activatie van MAPK te beïnvloeden, waardoor krachtige ontstekingsremmende effecten in vitro worden getoond.
Ontregeling van de nucleaire factor-κB (NF-κB) cascade is nauw verbonden met de progressie van ontstekingsziekten. IκB-kinasen (IKK's) zijn goed gevestigd als centrale modulatoren van NF-κB-activiteit, waardoor ze aantrekkelijke therapeutische kandidaten zijn voor de behandeling van inflammatoire pathologieën. De sesquiterpeen lacton 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin (XTT) is aangetoond robuust antikankereffect te hebben. Toch blijven de ontstekingsremmende werking en de onderliggende moleculaire mechanismen onduidelijk. In dit werk onderdrukte XTT duidelijk de synthese van stikstofoxide (NO) en prostaglandine E2 (PGE2) in lipopolysaccharide (LPS)-geactiveerde RAW264.7-macrofagen. XTT verlaagde ook aanzienlijk de door LPS getriggerde mRNA-niveaus van induceerbare stikstofoxidesynthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX2), tumornecrosefactor-α (TNF-α), interleukine-1β (IL-1β) en interleukine-6 (IL-6). Bovendien verlaagde XTT de eiwitniveaus van iNOS en COX2 die door LPS-behandeling werden opgewekt. Op mechanistisch niveau veranderde XTT de activiteit van de mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) cascade niet significant. Omgekeerd blokkeerde XTT sterk door LPS-getriggerde fosforylering en afbraak van remmende κBα (IκBα) door interactie met IKKα/β, waardoor de nucleaire translocatie van NF-κB werd verstoord. Gezamenlijk tonen deze gegevens aan dat XTT robuuste ontstekingsremmende effecten in vitro opwekt door IKKα/β te targeten en NF-κB-signalering te blokkeren. Deze resultaten suggereren dat XTT mogelijk een veelbelovende leadverbinding is voor de ontwikkeling van ontstekingsremmende middelen. Verdere biochemische en in vivo studies zijn nodig om directe remming en therapeutisch potentieel van IKKα/β te valideren.
Ontsteking is een streng gereguleerd biologisch proces dat organismen in staat stelt te reageren op infecties, weefselbeschadiging en andere omgevingsuitdagingen1. Hoewel acute ontstekingsreacties over het algemeen beschermend zijn, kan aanhoudende activatie van ontstekingsroutes de weefselhomeostase verstoren en bijdragen aan het begin en de progressie van chronische aandoeningen, waaronder inflammatoire darmziekte (IBD) en reumatoïde artritis (RA)2. Talrijke intracellulaire signaalnetwerken nemen deel aan ontstekingsregulatie, waarvan het nucleaire factor-κB (NF-κB) pad een van de meest bestudeerdeis.
Leden van de NF-κB-familie, waaronder p50, p52, p65 (RelA), RelB en c-Rel, functioneren als dimerische transcriptiefactoren die de expressie reguleren van genen die betrokken zijn bij immuniteit en ontsteking 4,5. Onder basale omstandigheden blijven NF-κB-dimeren inactief in het cytoplasma door associatie met een remmer van κB (IκB) eiwitten. Na stimulatie door ontstekingsmediatoren zoals lipopolysaccharide (LPS) of tumornecrosefactor-α (TNF-α) wordt het IκB-kinase (IKK)-complex geactiveerd en fosforyleert IκBα, wat resulteert in ubiquitinatie en degradatie ervan. Dit proces maakt het mogelijk dat NF-κB-complexen zich ophopen in de kern en de transcriptie van inflammatoire mediatoren en cytokinesstarten. Omdat overmatige of aanhoudende activatie van NF-κB nauw samenhangt met diverse ontstekings- en auto-immuunziekten, heeft farmacologische interventie op het niveau van IKK-signalering veel belangstelling getrokken 7,8,9.
Natuurlijke producten zijn al lange tijd essentiële bronnen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, waaronder ontstekingsremmendetherapieën. 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatine (XTT) is een sesquiterpeenlacton die is geïsoleerd uit Xanthium sibiricum11,12. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat XTT celproliferatie onderdrukt en apoptose in humane hepatocellulaire carcinoomcellen veroorzaakt via ROS-gemedieerde ERK/p38 MAPK-activatie en JAK2/STAT3-remming veroorzaakt door glutathiondepletie13. Het ontstekingsremmerpotentieel van XTT en de bijbehorende moleculaire mechanismen is echter nog slecht begrepen.
De huidige bevindingen geven aan dat XTT aanzienlijke ontstekingsremmende effecten in vitro vertoont. Mechanistische onderzoeken geven aan dat XTT interageert met IKKα/β en NF-κB-signalering onderdrukt, waardoor ontstekingsreacties in geactiveerde macrofagen worden geremd. Deze bevindingen suggereren dat XTT mogelijk een veelbelovende leidende verbinding is voor de ontwikkeling van ontstekingsremmers.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze studie betrof alleen gevestigde commerciële cellijnen en omvatte geen menselijke deelnemers, klinische monsters of dierproeven. Daarom waren institutionele ethische goedkeuring en geïnformeerde toestemming niet vereist. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de veiligheidsrichtlijnen van institutionele laboratoriums. Gevaarlijke reagentia werden behandeld in speciale dampkappen, waarbij de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) werden gebruikt. Chemisch en biologisch afval werd afgevoerd volgens de institutionele regelgeving. De chemicaliën, kits en reagentia die in het protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.
1. Celkweek
RAW264.7 muismacrofagen, HeLa menselijke baarmoederhalscarcinoomcellen en HEK293T menselijke embryonale niercellen werden aangekocht bij de Cell Bank van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). Alle cellen werden bewaard in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), dat 10% foetaal rundereserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bevatte. De kweekomgeving was ingesteld op 37 °C met 5% CO₂ en verzadigde luchtvochtigheid.
2. Cellevensvatbaarheidstest
De cellevensvatbaarheid werd beoordeeld via een Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. RAW264,7-cellen (2,5 × 10cellen van 4 cellen/put) werden verplat in 96-wellplaten en 's nachts gekweekt bij 37 °C. Cellen werden vervolgens behandeld met wisselende concentraties XTT gedurende 24 uur, met of zonder LPS (0,5 μg/mL). De LPS-concentratie en behandelingsduur werden in voorlopige experimenten geoptimaliseerd om matige ontstekingsreacties op te wekken zonder significante cytotoxiciteit te veroorzaken. Vervolgens werd 10 μL CCK-8 reagens aan elke put toegevoegd, en de plaat werd 2 uur lang op 37 °C gehouden. De absorptie werd gemeten op 540 nm met behulp van een microplaatlezer.
3. Bepaling van NO- en PGE₂-niveaus in celkweekmedium
RAW264,7-cellen werden geplateerd in platen met 24 putplaten met een dichtheid van 2,5 × 105-cellen per put en 's nachts gekweekt bij 37 °C. Cellen werden voorbehandeld met XTT gedurende 2 uur voorafgaand aan LPS-stimulatie of TNF-α (15 ng/mL) gedurende nog eens 24 uur. De 2 uur pre-behandelingsperiode werd gekozen om voldoende interactie tussen XTT en cellulaire doelen te waarborgen voorafgaand aan inflammatoire uitdaging. De niveaus van stikstofoxide (NO) en prostaglandine E₂ (PGE₂) in het kweekmedium werden gekwantificeerd volgens de protocollen van de fabrikant.
4. Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR)
RAW264,7-cellen (2 × 106 cellen) werden 's nachts in 6-wellplaten geplaatst en voorbehandeld met verschillende doses XTT gedurende 2 uur voordat de LPS-uitdaging (0,5 μg/mL) gedurende 24 uur werd toegediend. Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van TRIzol-reagens volgens de instructies van de fabrikant. RNA-concentratie en zuiverheid werden geëvalueerd met een spectrofotometer, en monsters met A260/A280-verhoudingen >1,8 werden gebruikt voor downstream-analyses.
Totaal RNA (2 μg) werd reverse-getranscribeerd naar cDNA in een eindreactievolume van 20 μL met behulp van een cDNA-synthesekit. Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met behulp van SYBR Green-chemie op een realtime PCR-detectiesysteem. De primerreeksen waren als volgt:
iNOS voorspringer: 5′-GGA TCT TCC CAG GCA ACC A-3′
iNOS achteruit: 5′-AAT CCA CAA CTC GCT CCA AGA TT-3′
COX2 VOORSPRINGER: 5′-CAA CAC CTG AGC GGT TAC-3′
COX2 achteruit: 5′-GTT CCA GGA GGA TGG AGT-3′
IL-1β voor: 5′-GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT C-3′
IL-1β achteruit: 5′-GGA AGA CAC AGA TTC CAT GGT GAA G-3′
IL-6 aanvaller: 5′-TGG AGT CAC AGA AGG AGT AGT GGC TAA G-3′
IL-6 achteruit: 5′-TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3′
TNF-α voor: 5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT-3′
TNF-α achteruit: 5′-GGC TAC AGG CTT GTC ACT C-3′
GAPDH voorschouw: 5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′
GAPDH achteruit: 5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′
De PCR-amplificatieprocedure werd uitgevoerd als: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 39 cycli van 95 °C gedurende 15 seconden en 60 °C gedurende 30 seconden. Relatieve genexpressieniveaus werden berekend met de 2−ΔΔCt-methode met GAPDH als interne controle.
5. Western-blotting
Na behandeling werden RAW264.7-cellen gehomogeniseerd in een RIPA-buffer met protease- en fosfataseremmers. Deze remmers werden direct voor gebruik vers bereid om eiwitafbraak en defosforylering te voorkomen. De totale eiwitspiegels werden gekwantificeerd met behulp van een BCA-assaykit. Gelijke hoeveelheden eiwit werden gescheiden door 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese en overgedragen op nitrocellulosemembranen. Na overdracht werden membranen geïncubeerd met 5% magere melk bereid in TBST met Tween-20 (TBST) voor blokkering, en vervolgens 's nachts getest met primaire antilichamen (1:1.000 verdunning) bij 4 °C. Vervolgens werden membranen onderzocht met mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:5.000 verdunning) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Eiwitbanden werden gedetecteerd met een chemiluminescentiedetectiesysteem en bandintensiteiten werden geanalyseerd via densitometrische kwantificering.
6. Immunofluorescentietest
HeLa-cellen werden in 6-wellplaten geplant en voorbehandeld met XTT (8 μM) gedurende 4 uur voorafgaand aan TNF-α stimulatie (15 ng/mL) gedurende 30 minuten. Deze pre-incubatieperiode van 4 uur werd gekozen om de doelaanval vóór de activatie van NF-κB te maximaliseren. Cellen werden 15 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde en permeabiliseerd met 0,25% Triton X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na blokkering met 2% rundserumalbumine (BSA) en 10% geitenserum verdund in fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS), werden cellen 's nachts geïncubeerd met een anti-p65 primair antilichaam (1:250 verdunning) bij 4 °C, gevolgd door een sondering met een TRITC-geconjugeerd secundair antilichaam (1:1.000 verdunning) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De kernen werden 5 minuten in het donker tegengekleurd met DAPI (0,5 μg/mL). Fluorescentiebeelden werden vastgelegd met een fluorescentiemicroscoop. HeLa-cellen werden geselecteerd omdat hun grote cytoplasma-kernverhouding de visualisatie van p65-kerntranslocatie mogelijk maakt.
7. Cytoplasmatische en nucleaire fractionering
HeLa-cellen werden 4 uur pre-geïncubeerd met XTT en vervolgens 30 minuten gestimuleerd met TNF-α (15 ng/mL). Cellen werden verzameld, gespoeld met koud PBS en verwerkt voor cytoplasmatische en nucleaire eiwitextractie met behulp van een commerciële nucleaire en cytoplasmatische eiwitextractiekit volgens de instructies van de fabrikant. Alle procedures werden op ijs uitgevoerd om de eiwitintegriteit te behouden.
8. Cellulaire thermische verschuivingstest (CETSA)
CETSA werd uitgevoerd zoals eerder beschreven14. Ongeveer 1 × 10 à7 HeLa-cellen werden verzameld en opnieuw gesuspendeerd in 500 μL koude PBS-bevattende proteaseremmers, waarna ze via drie vries-dooicycli in vloeibare stikstof werden gelyseerd. Cellysaten werden gecentrifugeerd op 20.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. De resulterende supernatanten werden gelijkmatig verdeeld in twee groepen en behandeld met XTT (100 μM) of DMSO gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. XTT (100 μM) werd toegepast om de detectiegevoeligheid in CETSA-experimenten te verbeteren. Monsters werden vervolgens in zeven buizen verdeeld en 3 minuten op de aangegeven temperatuur verwarmd, gevolgd door incubatie bij kamertemperatuur voor nog eens 3 minuten. Oplosbare eiwitfracties werden verzameld voor immunoblottinganalyse.
9. Moleculaire koppeling
Moleculaire dockinganalyse werd uitgevoerd zoals eerder beschreven14. Kristalstructuren van IKKβ (PDB-ID's: 3BRT en 4KIK) werden opgehaald uit de Protein Data Bank (PDB). Eiwitstructuren werden voorbewerkt met PyMOL (versie 2.3.4) om watermoleculen, oorspronkelijke liganden en onzuiverheden te verwijderen, gevolgd door toevoeging van waterstofatomen. Gasteiger-ladingen werden berekend en actieve pockets werden geïdentificeerd met AutoDock Tools (versie 1.5.6). Eiwitstructuren werden vervolgens opgeslagen in PDBQT-formaat.
De XTT-structuur werd gegenereerd in Chem3D (versie 15.1) en geoptimaliseerd via energieminimalisatie. Semi-flexibel koppelen werd uitgevoerd met AutoDock Vina (versie 1.1.2). Rasterboxen werden gebouwd om de actieve pockets volledig te bedekken, terwijl alle andere parameters op standaardinstellingen bleven. Dockinghoudingen met de laagste bindingsenergieën en meest stabiele conformaties werden geselecteerd voor analyse. Bindingsenergieën onder −5 kcal/mol werden volgens gepubliceerde criteria als indicatief voor een sterke bindingsaffiniteit beschouwd. PyMOL werd verder gebruikt om bindingsmodi te visualiseren en waterstofbruggen, hydrofobe interacties, van der Waals-interacties en potentiële bindingsplaatsen te beoordelen.
10. Statistische analyse
Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de GraphPad Prism 5.0-software. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) uit drie onafhankelijke experimenten. De statistische significantie werd beoordeeld met behulp van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Dunnetts post hoc-test. Een waarde van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
XTT remde de productie van NO en PGE₂ in door LPS of TNF-α gestimuleerde RAW264.7 macrofagen
Om te bepalen of de ontstekingsremmende effecten van XTT onafhankelijk waren van cytotoxiciteit, werd de levensvatbaarheid van RAW264.7 na XTT-behandeling beoordeeld, in aanwezigheid of afwezigheid van LPS. Er werd geen merkbare vermindering van cellevensvatbaarheid waargenomen bij concentraties variërend van 0,5 tot 8 μM, wat aangeeft dat de verbinding goed werd getolereerd o...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Sesquiterpeenlactonen zijn een klasse van natuurlijke producten met diverse farmacologische activiteiten, waaronder antiseptische, ontstekingsremmende, koortsonderdrukkende en ontgiftende effecten15. Eerdere studies hebben aangetoond dat XTT, een xanthanolide-type sesquiterpeenlacton geïsoleerd uit Xanthium sibiricum, krachtige antiproliferatieve en pro-apoptotische effecten vertoont in humane hepatocellulaire carcinoomcellen13. Di...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 82004031), het Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine Research Project (nr. 2024MS566) en het National Key Research and Development Program of China (nr. 2023YFC3504402).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Enhanced chemiluminescence reagent D20A2:D21A2:D22A2:D23A2: D24A2:D25A2:D26A2:D27A2:D28A2: D29A2:D30A2:D29 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P90720 | luminescent signal detection |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies | Signalway Antibody (Nanjing) | L30118 | specifically binds to the primary antibody |
| p65 primary antibody | Bioworld | BS4139 | specifically recognizes NF-κB p65 subunit protein |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | SCR_018042 |
| 0.45 μM Ployvinylidence fluoride membrane | Millipore | PR05509 | adsorb protein molecules |
| 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin | Chengdu Institute of Biology | natural monomeric compounds | |
| All-in-One cDNA Synthesis SuperMix | Bimake (Shanghai) | B24408 | reverse-transcribe |
| BAY11-7082 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | SF0011 | IκB/IKK inhibitor |
| Bcl2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 32012 | AB_3751037 |
| Bicinchoninic Acid (BCA) kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0010S | total protein quantification |
| CCK-8 agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C0038 | cell viability measurement |
| Chemiluminescence detection system | Millipore, Bedford, USA | P90720 | acquire and process luminesence signals |
| COX-2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 33345 | AB_3676692 |
| DMSO | Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd. | A100231-0500 | solubilize compounds |
| GAPDH antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41549 | AB_3751036 |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | image acquisition and analysis |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | gradient annealing temperature |
| Griess agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | S0021S | NO quantification |
| Human cervical carcinoma HeLa cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-504 | Human-derived cells |
| Human TNF-α | Novus Biologicals | 210-TA | pro-inflammatory cytokines |
| iNOS antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 48309 | AB_2943634 |
| Laser Confocal Inverted Microscope | Olympus | FV1000 | SCR_016840 |
| LPS ( E.coli 055:B5) | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd | L6529 | establish inflammatory models |
| Murine macrophage RAW264.7 cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-5036 | Mouse-derived cells |
| Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0027 | separate cytoplasmic and nuclear proteins |
| PD98059 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1177 | MEK inhibitor |
| P-ERK (Thr202/Thr185) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 12548 | detect the phosphorylation level of ERK protein |
| p-IKKα/β (Ser176/Ser177) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11931 | AB_3751034 |
| p-IκBα (phospho-Ser32)antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13776 | AB_3751033 |
| p-JNK (T183/T221) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13371 | AB_3718662 |
| p-p38 MAPK (Thr180) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11581 | AB_3751032 |
| Prostaglandin E2 Parameter Assay Kit | R&D Systems | KGE004B | AB_2894942 |
| PS1145 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S7691 | specific IKK inhibitor |
| Rapid SDS-PAGE Gel Preparation Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | protein separation |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 | SCR_018064 |
| RIPA buffer | Bimake (Shanghai) | P0013C | cell lysis |
| SB203580 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1076 | p38 MAPK inhibitor |
| SP600125 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1460 | JNK inhibitor |
| SYBR Green | Bimake (Shanghai) | B21202 | For real-time quantitative |
| TRITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | A0568 | AB_2893016 |
| TRITC-conjugated second antibody | Beijing Baiao Leibo Technology Co., Ltd. | ZN1992 | AB_3751143 |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | total RNA isolation |
| Vinculin antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41534 | AB_3751035 |