Multicenter flowcytometrie voor acute myeloïde leukemie meetbare restziekte met LAIP/DfN en CD34+CD38 - leukemische stamcelverrijkte populaties

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een multicenter flowcytometrie-workflow voor acute myeloïde leukemie meetbare restziektekwantificering met behulp van leukemie-geassocieerd immunofenotype/verschillen-van-normaal (LAIP/DfN) analyse en fenotypisch gedefinieerde CD34⁺CD38⁻ leukemische stamcelverrijkte populaties.

Samenvatting

Follow-up met meetbare restziekte (MRD) wordt aanbevolen voor de evaluatie van de behandelingsrespons in klinische onderzoeken met acute myeloïde leukemie (AML) volgens de richtlijnen van ELN 2025. Het doel van deze studie was het implementeren van een gestandaardiseerde follow-up van patiënten met een geharmoniseerde MRD-flowbenadering in 30 Franse hematologielaboratoria die deelnamen aan AML-klinische onderzoeken. Om vergelijkbare resultaten te verkrijgen, stelde het netwerk aanbevelingen op, van wet-lab procedures tot klinische rapporten. We ontwierpen een panel van 3 buisjes met verplichte 8-kleuren gemeenschappelijke markers per buis, volgens de aanbevelingen van ELN, om leukemie-geassocieerd immunofenotype/verschillend van normaal (LAIP/DfN) patronen te identificeren in bulkcellen en leukemische stamcelpopulaties (LSC)-verrijkte populaties in de CD34⁺CD38⁻ fractie. Een ruggengraat van CD34/CD38/CD45/CD117 werd gebruikt, aangevuld met lijnmarkeringen voor de eerste buis, LSC-geassocieerde markers voor de tweede buis, en monocytische en differentiatiemarkers voor de derde buis. Dit paneel kan worden gebruikt in 8-, 10- en 12-kleuren formaten en wordt geïmplementeerd op meerdere conventionele flowcytometerplatforms. Wij stellen flowcytometerinstellingen voor die zijn aangepast aan elk platform.

De harmonisatie van gevoeligheid tussen de vier platforms werd uitgevoerd met 8-piek regenboogkralen. Immunokleuring werd uitgevoerd na bulklyse. Om bias tussen platforms te detecteren, werd de kleuringsindex getest met verse gezonde beenmergmonsters parallel op de vier platforms. Regelmatige beenmergkwaliteitscontrolemonsters werden gedeeld tussen laboratoria voor natte externe kwaliteitsbeoordeling (EQA) om alle stappen van het protocol te verifiëren. Ten slotte werd de standaardisatie van de data-analysestrategie die in de centra werd verkregen, geëvalueerd met behulp van droge EQA door het delen van MRD FCS-databestanden. De haalbaarheid van deze multicenterbenadering vereist harmonisatie van instrumentgevoeligheid en monstervoorbereiding, evenals training en systematische opleiding van analytische operators.

Inleiding

Meetbare restziekte (MRD) verwijst naar het kleine aantal leukemische cellen dat tijdens of na behandeling blijft en niet detecteerbaar is door morfologie, vooral in gevallen van volledige remissie met minder dan 5% blasts in het beenmerg. MRD-monitoring wordt aanbevolen voor de evaluatie van de behandelingsrespons in klinische acute myeloïde leukemie (AML) onderzoeken volgens ELN 2025 richtlijnen¹. Naast moleculaire biologische methoden, waaronder reverse transcriptase PCR (RT-qPCR) en next-generation sequencing (NGS), is multiparametrische flowcytometrie (MFC) een veelgebruikte benadering².

Om consistente MRD-resultaten te verkrijgen, vooral in klinische onderzoeken, zijn twee strategieën mogelijk: het centraliseren van MRD-metingen in één laboratorium of het implementeren van een protocol dat reproduceerbaarheid waarborgt tussen de verschillende laboratoria die betrokken zijn bij MRD-bepaling. Het aantal monsters, de omvang van de proef en de capaciteit van laboratoria om grotere of kleinere monstervolumes te verwerken, kunnen de keuze tussen deze strategieën bepalen. Als een multicenterstrategie wordt gekozen, moeten verschillen tussen cytometerplatforms en de behoefte aan vergelijkbare analyses tussen locaties worden aangepakt.

Hiervoor beschrijven we een gestandaardiseerde multicenter en multiplatform MRD-flowbenadering die leukemie-geassocieerd immunofenotype/verschillend van normaal (LAIP/DfN) analyse combineert met fenotypisch gedefinieerde CD34⁺CD38⁻ leukemische stamcel (LSC)-verrijkte detectie, toegepast in 30 Franse hematologielaboratoria op basis van ELN-aanbevelingen en eerdere rapporten ^3,4.

Flowcytometrie maakt het mogelijk om bij diagnose de leukemie-"signatuur" te definiëren die de specifieke expressie van markers op de blastocysten van de patiënt bevat: LAIP. Na behandeling maakt MRD-flow het mogelijk om de bij diagnose geïdentificeerde LAIPs te monitoren. Aangezien leukemische blasten kunnen evolueren en hun immunofenotype kunnen aanpassen onder therapeutische druk, moet een tweede strategie systematisch worden toegepast: de DfN-benadering, die berust op het identificeren van cellen met kenmerken die hen onderscheiden van normale hematopoëse. Deze techniek kan ook het verschijnen van nieuwe markers op blasts tijdens het verloop van de ziekte en de behandeling detecteren.

In de Franse AML-stroomgroep was het paneelontwerp gebaseerd op de eerder gepubliceerde HOVON-studie naar de definitie van leukemische celpatronen. Er is geen universele LSC- of LAIP-marker, dus hebben we een paneel van 3 buisjes ontworpen dat gelijktijdige identificatie van LAIP-, DfN- en CD34⁺CD38⁻ LSC-verrijkte populaties mogelijk maakt. Een ruggengraat gebaseerd op CD34/CD38/CD45/CD117 werd in alle buizen gebruikt, aangevuld met afstammingsmarkers in de eerste buis, LSC-geassocieerde markers in de tweede buis, en monocytische lijn- of differentiatiemarkers in de derde buis om de LAIP-definitie in AML met monocytische blasts te voltooien. Alle drie de buisjes worden bij diagnose en in vervolgmonsters verkregen.

Gezien de pathofysiologie van leukemogenese is de aandacht verschoven van het bestuderen van het blastbulk naar het identificeren van de meest onrijpe fractie als leukemische stamcelverrijkte populaties. Dick en collega's toonden de heterogeniteit van leukemie aan door CD34⁺CD38⁻ LSC's te beschrijven met het potentieel om leukemie te veroorzaken bij immunodeficiënte muizen ^5,6. Bij LSC-kwantificering bij diagnose en follow-up worden inspanningen geleverd om antilichaampanelen en analysestrategieën binnen de ELN DAVID werkgroep ^1,7 te standaardiseren. Momenteel gebruiken twee panels, HOVON en ALFA, dichotomische LSC-markers om LSC-verrijkte populaties te onderscheiden van normale hematopoëtische stamcellen in CD34⁺CD38⁻ ruimte ^8,9.

De hier beschreven methode combineert gestandaardiseerde monstervoorbereiding, gemeenschappelijke antistofpanelontwerp, platform-aangepaste gevoeligheidsinstellingen, LAIP/DfN en CD34⁺CD38⁻ LSC-verrijkte analyse, externe kwaliteitsbeoordeling en geharmoniseerde klinische rapportage voor multicenter AML MRD-stroommonitoring.

Protocol

Het protocol volgt de aanbevelingen en richtlijnen van de ethische commissies van de Franse Universitaire Ziekenhuiscentra. Alle patiënten ondertekenden informed consent volgens de Franse wetgeving. Het studieprotocol werd goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Mensen van CHU Lyon en de Ethische Commissie van de Institutionele Beoordelingscommissie van Lille CHU in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki (HDF-AML observatorium, CNIL 2214454v). Voor allograft werden donoren opgenomen in de Europese internetgebaseerde ProMISE-database en gaven zij geïnformeerde toestemming voor het verzamelen van hun persoonlijke gegevens. Het extraheren en analyseren van gegevens werd uitgevoerd in overeenstemming met de lokale Ethische Commissie (CNIL2093819). Alle FCS-flowbestanden die voor netwerkreview werden gebruikt, werden volledig geanonimiseerd met een Python-script.

1. Cytometerinstelling

1. Bepaal doelwaarden aangepast aan elke cytometer met behulp van 8-piek regenboogkralen.
2. Stel elke machine in volgens de doelwaarden die in Tabel 1 worden getoond. Zorg ervoor dat elk kanaal de streefwaarde ± 5% haalt. Controleer deze instelling systematisch om de longitudinale gevoeligheid van elk platform te behouden.
3. Stel de compensatiematrix vast met enkelvoudig gekleurde buizen voor elk antilichaam, waarbij compensatiekorrels en/of cellen per platform worden gebruikt.
4. Bewaar de setting en compensatiematrix als een assay of protocol geïdentificeerd als MRD LAIP/DfN, LSC en MonoGran (T1, T2, T3). Gebruik deze assay of protocol voor acquisitie voor AML MRD-stroomkwantificatie.

2. Wet-lab procedure

1. Beenmergaspiratie
   1. Verzamel 1-2 ml EDTA-beenmerg bij de diagnose en op de monitoringsmomenten, waaronder MRD1, MRD2, MRD3, MRD4 en terugval.
   2. Stuur de buizen binnen 24-48 uur naar het referentiestroomlaboratorium.
2. Voorbereiding van beenmerguitstrijkje voor morfologisch onderzoek
   1. Plaats een druppel beenmergaspiratie op een glazen preparaat. Verspreid het monster voorzichtig met een dekmantel of een andere dia.
   2. Na 30 minuten drogen beet je de veeg met May-Grünwald-Giemsa (Supplemental File 1).
3. Bulklysis
   1. Voeg 15 ml NH₄Cl lyseringsoplossing toe aan 1-2 ml beenmergmonster. Meng voorzichtig en laat het 10 minuten op kamertemperatuur incuberen.
   2. Centrifugeer op 450 × g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
   3. Sussion de celpellet opnieuw in 10 mL PBS/0,1% BSA. Centrifugeer op 450 × g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
   4. Susselt de celpellet opnieuw bij een concentratie van 30 × 10⁶ WBC/mL in PBS.
4. Immunokleuring van de celsuspensie
   1. Verdeel de monoklonale antilichamen in buisjes T1, T2 en T3 volgens het platform (Tabel 2). Geef de kloon, volume, catalogusreferentie en leverancier voor elk antilichaam in een antistoftabel.
      OPMERKING: Voor elke tube met Brilliant Violet Kleurstoffen gebruik je Brilliant Stain-buffer voordat je de antilichamen toevoegt.
   2. Voeg 2-3 ×10^{6 gelyseerde} cellen per buis toe in 100 μL celsuspensie. Incubeer de cellen 15 minuten in het donker met antistoffen op kamertemperatuur.
   3. Was de cellen met 3 mL PBS. Centrifugeer 5 minuten op 450 × g en gooi het supernatant weg.
   4. Sussen de gekleurde cellen opnieuw in 300 μL PBS.
      OPMERKING: Vooraf gemengde antilichaamcocktails of gevalideerde droge antilichaambuizen kunnen worden gebruikt.

3. Acquisitie van de flowcytometer

1. Open het MRD-assay- of acquisitieprotocol met de aangepaste setting- en compensatiematrix voor MRD LAIP/DfN en LSC-metingen.
2. Neem bij diagnose minimaal 500.000 tot 1.000.000 witte bloedcellen in elke buis en in MRD-follow-up monsters om de clustering van MRD-cellen te verbeteren en het vertrouwen in laag-niveau MRD te verbeteren.
   OPMERKING: Voor LSC-metingen verkrijg je minimaal 1.000.000 WBC in buis 2 om voldoende gevoeligheid voor LSC-kwantificatie te verkrijgen (LOQ 0,002% en LOD 0,001%)^10,11.
3. Bewaar de FCS-gegevensbestanden uit diagnose- en MRD-monsters. Noteer de datum van de acquisitie en patiëntidentificatie om vervolgonderzoek naar MRD en LSC te vergemakkelijken.

4. Analysestrategie

1. Gebruik een gemeenschappelijke sjabloon en een gemeenschappelijke dot-plot sequentie met een vooraf gedefinieerde geharmoniseerde gatingstrategie die is aangepast aan de analysesoftware die in elk centrum wordt gebruikt.
2. Pas de gating-strategie toe om leukemische cellen te identificeren met drie benaderingen: LAIP, DfN en LSC-analyse in de CD34⁺CD38-fractie.
3. Identificeer en sluit potentiële niet-specifieke gebeurtenissen en normale fysiologische populaties uit, waaronder basofielen, plasmacytoïde dendritische cellen, hematogonen, plasmacellen, erythroblasten, bloedplaatjesklonten, puin en ongelyseerde erytrocyten.

5. Definitie van LAIP/DfN en fysiologische populaties

1. Om LAIP in bulkblasts vast te leggen, teken je een single-cell gate gebaseerd op FSC-W versus FSC-H.
2. Teken een live-cell gate op basis van FSC versus SSC.
3. Teken een blast gate op CD45^dim/SSC.
4. Teken de primitieve markerpoort met CD34/CD117.
5. Gebruik vaste biparametrische puntdiagrammen om de relevante LAIP-poorten te tekenen, waaronder LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 en LAIP8.
6. Fysiologische populaties
   1. Gate hematogonen met de volgende volgorde: live cells, MNC op de FSC/SSC dot plot, CD19/SSC dot plot en CD34/CD38 dot plot. Backgate met CD45/SSC.
   2. Gate-basofielen met de volgende volgorde: live cells, MNC op de FSC/SSC dot plot, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA^-), exclusief CD19⁺ hematogonen. Backgate met CD45/SSC.
   3. Gate-plasmacytoïde dendritische cellen met de volgende sequentie: levende cellen, MNC op de FSC/SSC dot plot, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA⁺), exclusief CD19⁺ hematogonen. Backgate met CD45/SSC.
   4. Identificeer erythroblasten, bloedplaatjesklonten, puin en ongelyseerde erytrocyten met behulp van de CD36/CD45 dot plot. Backgate met CD45/SSC en FSC/SSC.
7. LAIP-benadering
   1. Definieer MRD in CD34⁺ OF CD117⁺ primitieve AML met behulp van Booleaanse operatoren als volgt: LAIP1 EN LAIP2 EN LAIP3 EN LAIP4 EN LAIP5 EN LAIP6 EN LAIP7 EN LAIP8 EN NIET schone CD36^bright+/CD45 EN losse cellen EN levende cellen EN CD34^+/CD117^+/ primitieve markers EN (CD45/SSC blast gate OF MNC CD34⁺) (Figuur 1).
   2. Definieer MRD in CD34-CD117^- AML met Booleaanse operatoren als volgt: LAIP1 EN LAIP2 EN LAIP3 EN LAIP4 EN LAIP5 EN LAIP6 EN LAIP7 EN LAIP8 EN NIET schoon CD36^bright+/CD45 EN enkele cellen EN levende cellen EN CD34CD117 EN CD45/SSC blast gate (Figuur 2).
8. DfN-benadering
   1. Gebruik hetzelfde sjabloon als de LAIP-benadering en pas de lege ruimte toe die is gedefinieerd op referentiebeenmergmonsters (Tabel 3).
   2. Definieer abnormale populaties wanneer de cluster van abnormale cellen 0,5 decennium op logaritmische schaal¹² wordt gescheiden van normale cellen.
   3. Om DfN in bulkblasts vast te leggen, teken je levende cellen met FSC/SSC.
   4. Teken enkele cellen door doublets te verwijderen op basis van FSC-piek/SSC-oppervlakte.
   5. Teken de MNC-poort met FSC/SSC.
   6. Breng een reinigingspoort aan om lymfocyten te verwijderen met behulp van CD45/CD36/SSC.
   7. Plaats een cleanup gate om erythroblasten en vuil te verwijderen met behulp van CD45/CD36.
   8. Gebruik twee ingangspoorten, CD34⁺/CD45/SSC en CD117⁺/CD45/SSC, om de lege dozen te definiëren volgens eerdere publicaties^12,13.
   9. Trek elk leeg DfN-vakje op basis van interne controlepopulaties, inclusief lymfocyten voor cross-lineage markers en normale myeloïde precursors voor verlies, afname of overexpressiemarkers.
   10. Vergelijk de lege dozen met referentiebeenmergmonsters, waaronder regenererende, inflammatoire en gezonde donorbeenmerg.

6. Definitie van de LSC CD34⁺CD38^- populatie

1. Identificeer LSC-verrijkte cellen bij diagnose in de CD34⁺CD38-ruimte op basis van LSC-markers met dichotomische expressie en afwezigheid van expressie in normale hematopoëtische stamcellen van gezond beenmerg.
2. Definieer de LSC-ingangspoort als MNC34⁺ met de volgende gatingsequentie: live cells, single cells, MNC en CD34⁺ in de CD45/CD34 dot plot.
3. Definieer de CD34⁺CD38-fractie (P6) met een rigoureuze drempel gebaseerd op het CD38 fluorescentie-minus-één (FMO) niveau.
4. Definieer LSC-verrijkte cellen in buis 1 in de P6-fractie met behulp van Booleaanse operatoren als volgt: P6CD7⁺ OF P6CD33⁺ OF P6CD19⁺ OF P6CD56⁺ EN NIET schone CD36^bright+ EN losse cellen EN levende cellen EN MNC EN MNC CD34⁺.
5. Definieer LSC-verrijkte cellen in buis 2 in de P6-fractie met behulp van Booleaanse operatoren als volgt: P6CD45RA⁺ OF P6MIX⁺ OF P6CD123⁺ EN NIET schoon CD36^bright+ EN enkele cellen EN levende cellen EN MNC EN MNC CD34⁺.
6. Gebruik CD36 om niet-specifieke gebeurtenissen in de laatste MRD LSC-poort op te ruimen (Figuur 3).

7. Definitie van de CD38-drempel in de CD34⁺ populatie

1. Stel het ^CD38-kanaal hoog genoeg in om CD38-populaties te onderscheiden van CD38^+/- populaties met goede resolutie.
2. Definieer P6 als CD34⁺CD38^-, P7 als CD34⁺CD38^laag, en P8 als CD34⁺CD38^hoog.
3. Baseer de CD38-kanaalinstelling op CD38-heldere populaties, waarbij plasmacellen als de helderste populatie worden geïdentificeerd en hematogonen volgens het meetbereik van elk platform.
4. Definieer de CD34⁺CD38-populatie (P6) met behulp van de CD38 ^{FMO-benadering} , gevalideerd door een isoklone CD38-controle.
5. Definieer de CD34⁺CD38^lage populatie (P7) met behulp van het hematogone negatieve niveau.
6. Definieer de CD34⁺CD38^hoge populatie (P8) met behulp van het hematogone positiviteitsniveau en het plasmacel-negatieve niveau (Figuur 4).
7. Gebruik hetzelfde CD38-drempelniveau over de geharmoniseerde groep met robuuste methoden zoals CD38-FMO of isoclonische CD38-controle.
8. Gebruik ten minste één aberrant immunofenotype in de CD34⁺CD38^- fractie om LSC-verrijkte cellen te definiëren. Neem LSC-markers toe zoals CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123 of afstammingsmarkers zoals CD7/CD19/CD56/CD33.
9. Pas de volgende drempels toe: assaygevoeligheid LOQ ^10-4 en LOD ^10-5; LSC-positiviteit bij diagnose ≥ 1% van de CD45/SSC-blastblasts; en LSC-positiviteit bij MRD-follow-up ≥ 0,01% van de witte bloedcellen.

8. Geharmoniseerd klinisch stroomrapport

1. Geef bij elk resultaat de volgende informatie: beenmergkwaliteit, strategie voor MRD-identificatie, LAIP-beschrijving, LOD en LOQ, drempels en interpretatie van de resultaten.
2. Hemodilusie en beenmergrepresentativiteit
   1. Beoordeel hemodilusie voor elk klinisch MRD-stroomrapport om de robuustheid van het resultaat te evalueren.
   2. Gebruik een van de eerder beschreven hemodilusiemethoden indien van toepassing (Tabel 4)7,14,15,16,17,18,19,20,21.
   3. Als complementaire benadering bereken je de representativiteit van het beenmerg met behulp van de waargenomen CD34/WBC45-verhouding vergeleken met de verwachte verhouding die is waargenomen in referentiebeenmergmonsters (Figuur 5).
   4. Gebruik de volgende formule:
      P: zuiverheid % = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s: aandeel MNC CD34^+- cellen in normaal perifeer bloed: 0,0005
      m: aandeel MNC CD34⁺ cellen in normaal beenmerg: 0,035
      L: aantal WBC45⁺ leukocyten in het MRD-patiëntmonster
      n: aantal MNC CD34^+- cellen in het MRD-patiëntmonster
   5. Rapporteer de representativiteit van het beenmerg als een kwaliteitsevaluatie van het monster. Gebruik deze waarde niet om MRD-resultaten te normaliseren.
   6. Interpreteer de representativiteit van het beenmerg als volgt: 100% tot 10%, lage invloed op het aandeel CD34^+- cellen uit beenmerg; 10% tot 1%, waarschuwing voor interpretatie van MRD-resultaten; en < 1%, niet-interpreteerbaar resultaat.
3. LSC-kwantificering bij diagnose
   1. Rapporteer het profiel dat wordt gebruikt om LSC-verrijkte cellen te identificeren, bijvoorbeeld CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Rapporteer LSC-resultaten bij diagnose als het waargenomen percentage van CD45/SSC-blasts.
   3. Gebruik LSC ≥ 1% van het totale aantal blasts als drempel voor een slechte prognose.
4. Vervolgonderzoek door LAIP/DfN
   1. Rapporteer het LAIP-profiel dat wordt gebruikt om MRD te identificeren, bijvoorbeeld CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33^++CD117+CD7⁺.
   2. Rapporteer de gevoeligheid van de analyse als de minst gevoelige waarde tussen de technische drempel en de robuustheidswaarde die voor het LAIP-profiel is waargenomen vergeleken met referentiebeenmergmonsters.
   3. Gebruik een minimaal cluster van 50 cellen onder verworven witte bloedcellen als limiet van kwantificatie. Bijvoorbeeld, met 500.000 WBC-cellen is de LOQ 0,01% (1 × ^10-4).
   4. Rapporteer LAIP/DfN-resultaten als positief, negatief, detecteerbaar maar onder de klinische drempel, of niet detecteerbaar.
   5. Rapporteer de LAIP/DfN-positiviteit als ≥ 0,1%, uitgedrukt als het percentage van het totale aantal CD45⁺ leukocyten.
   6. Rapporteer LAIP/DfN-negativiteit als < 0,1%.
   7. Voor detecteerbare maar onder de drempel blijvende resultaten rapporteer je de representatieve waarde en gevoeligheidsdrempel.
   8. Voor niet-detecteerbare resultaten rapporteer je dat het resultaat inferieur is aan de gevoeligheidsdrempel van de analyse en voeg indien nodig een opmerking toe, zoals hemodilusie, lage LAIP-specificiteit of onvoldoende technische drempel.
5. Vervolg MRD door LSC
   1. Rapporteer het profiel dat wordt gebruikt om LSC-verrijkte cellen te identificeren, bijvoorbeeld CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Gebruik een minimaal cluster van 20 cellen onder verworven witte bloedcellen als limiet van kwantificatie. Bijvoorbeeld, met 1.000.000 WBC-cellen is de LOQ 0,002% (2 × ^10-5).
   3. Rapporteer LSC-resultaten als positief, negatief, detecteerbaar maar onder de klinische drempel, of niet detecteerbaar.
   4. Rapporteer LSC-positiviteit als ≥ 0,01%, uitgedrukt als het percentage van het totaal aantal CD45⁺ leukocyten.
   5. Rapporteer de LSC-negativiteit als < 0,01%.
   6. Voor detecteerbare maar onder de drempel blijvende resultaten rapporteer je de representatieve waarde en gevoeligheidsdrempel.
   7. Voor niet-detecteerbare resultaten rapporteer je dat het resultaat inferieur is aan de analysegevoeligheidsdrempel en voeg indien nodig een opmerking toe, zoals hemodilusie, lage LSC-specificiteit of onvoldoende technische drempel.
6. Integreer de MRD-stroominterpretatie met eerdere monitoringstijden. Geef modulatie aan van het fenotypische profiel tijdens de behandeling en de dynamiek van de MRD-stroom, inclusief repositiviteit, toename, stabiliteit of afname.
7. Stuur de resultaten door naar de aanvragende behandelaar en onderzoeker met behulp van het klinisch flowrapport volgens de tijdsbestek van het referentieflowlaboratorium.
8. Vat het geharmoniseerde klinische flowrapport samen met de volgende items: beenmergkwaliteit, MRD-identificatiestrategie, LAIP-beschrijving, LOD en LOQ, drempels en interpretatie als MRD-positief, MRD-negatief met LOD-waarde, of MRD-detecteerbaar maar niet-kwantificeerbaar.

Resultaten

Platformspiegeling

Voor de eerste tweeplatformvergelijking tussen CANTO en NAVIOS werden de spanningsinstellingen aangepast door ongecompenseerde 8-piek regenboogkralen te verkrijgen om vooraf gedefinieerde doel-MFI-waarden te bereiken. Doelwaarden van het referentie CANTO-platform werden omgezet naar het tweede NAVIOS-platform met de volgende conversie: nieuw MFI-doel = referentie-MFI-doel/256²². Om bias tussen platforms te detecteren, werden 10 verse EDTA-regeneratieve beenmergmonsters parallel getest. De kleuringsindex tussen positieve en negatieve populaties werd vergeleken tussen monsters en platforms en vertoonde een vergelijkbare scheiding (Supplemental File-Figure S3).

Tijdens het onderzoek werden de platforms geleidelijk geüpgraded van 8- en 10-kleuren configuraties naar LYRIC en DxFLEX 12- en 13-kleuren configuraties (Supplemental File 1). De spiegeling werd uitgebreid over vier perrons met 8-piek regenboogkralen en gekleurd gezonde beenmerg dat met hetzelfde paneel was verkregen. De piekoverlap werd gecontroleerd door alleen de logaritmische schaal van representatie aan te passen. Na toepassing van de gedefinieerde instellingen overlappen de celkleurpatronen elkaar, waarbij het belangrijkste verschil de translatie van de celwolken langs de logaritmische schalen was (Figuur 6 en Supplemental File-Figuur S4 en Figuur S5).

Kwaliteitsbeoordeling en reproduceerbaarheid in stromingslaboratoria

Na de implementatie van de initiële standaardprocedure en de updates tijdens platformupgrades werd regelmatig een natte externe kwaliteitsbeoordeling (EQA) uitgevoerd met verse referentiebeenmergmonsters die werden gedeeld tussen deelnemende centra. Wet EQA werd gebruikt om de wet-lab procedure, platforminstellingen en de gangbare gating-analysestrategie te verifiëren. De gerapporteerde populaties omvatten MNC CD34^+- cellen in de WBC CD45⁺ -noemer en P6 CD34⁺CD38⁻ -cellen in de WBC CD45⁺ -noemer. De resultaten werden geanalyseerd met z-score en/of grafische weergave (Figuur 7).

Sinds 2017 zijn er vijf natte EQA-rondes uitgevoerd, met respectievelijk 22, 15, 17, 26 en 25 deelnemende laboratoria. Voor %CD34⁺CD38⁻ cellen in WBC CD45⁺ en %MNC CD34⁺ cellen in WBC CD45⁺ waren de resultaten als volgt: EQA1, gemiddelde waarden 0,015% en 1,01% (SD 0,09% en 0,24%); EQA2, 0,09% en 1,02% (SD 0,046% en 0,36%); EQA3, 0,097% en 1,46% (SD 0,024% en 0,32%); EQA4, 0,024% en 2,16% (SD 0,015% en 0,59%); en EQA5, 0,027% en 1,9% (SD 0,008% en 0,45%).

Om de standaardisatie van de MRD-analysestrategie tussen centra te realiseren, werd natte EQA aangevuld met droge EQA met gedeelde FCS-bestanden voor diagnose, MRD-follow-up en referentiebeenmerg. Meer dan 90% van de lokaal geanalyseerde gegevens werd opgenomen binnen het gecentraliseerde interval op basis van het seriegemiddelde ± 2 SD: 95,6% en 91,3% voor DryEQA2017, met 22 van de 23 deelnemende laboratoria, en 100% voor DryEQA2024, met 24 van de 25 deelnemende laboratoria (Figuur 8). Er werden twee rondes droge EQA uitgevoerd voor %MRD LAIP in WBC CD45⁺ en %MRD LSC CD34⁺CD38⁻ in WBC CD45⁺. DryEQA2017 liet een gemiddelde LAIP-waarde zien van 11,9% (SD 1,35%) en een gemiddelde LSC-waarde van 0,16% (SD 0,05%). DryEQA2024 toonde een gemiddelde MRD LAIP-waarde van 0,35% (SD 0,26%) en een gemiddelde MRD LSC CD34⁺CD38⁻ waarde van 0,18% (SD 0,06%).

Voorbeeld van multimodale AML MRD-stroommeting met LAIP/DfN- en LSC-strategieën

Om MRD te kwantificeren, werden er systematisch drie benaderingen gebruikt. De eerste benadering stelde bij diagnose de LAIP-cartografie van leukemische blasts vast met behulp van Boolean gating, en deze cartografie werd toegepast op vervolgmonsters van beenmerg (Figuur 9A). De tweede benadering gebruikte DfN-analyse om abnormale cellen te identificeren met atypische expressiepatronen die niet werden waargenomen in "lege doos"-gebieden gedefinieerd door normale myeloïde differentiatie (Figuur 9B). De derde benadering kwantificeerde LSC-verrijkte cellen in de CD34⁺CD38⁻ fractie met behulp van dichotomische LSC-markers en Boolean gating (Figuur 10).

Referentiebeenmergmonsters

In totaal werden 135 referentiebeenmergmonsters bestudeerd, waaronder 25 gezonde donorbeenmergmonsters, 34 ontstekingsbeenmergmonsters en 76 regenererende beenmergmonsters. Gezonde donorbeenmerg werd verkregen van gezonde donoren, met een mediane leeftijd van 31 jaar en een bereik van 21–49 jaar. Ontstekingsbeenmerg werd verkregen van patiënten die voor cytopenie werden verwezen, waaronder bloedarmoede, neutropenie of trombopenie, waarbij beenmergaspiraten geen hematologische maligniteit vertoonden; De mediane leeftijd was 52 jaar, met een spreiding van 25–82 jaar. Regenererend beenmerg werd verkregen tijdens AML-follow-up op verschillende chemotherapietijden, ook na inductie of consolidatie, met negatieve moleculaire MRD-beoordeling op NPM1- of CBF-transcripten; De mediane leeftijd was 54 jaar, met een bereik van 18–65 jaar.

De kwaliteit van deze monsters werd gevalideerd door microscopisch onderzoek. Het verwachte theoretische percentage CD34^+- cellen in onverdunde beenmergmonsters werd ook berekend met de Brooimans-formule, met resultaten >90% voor alle monsters. Deze monsters werden gebruikt om drempels vast te stellen voor LAIP/DfN- en LSC-analyse en om de hemodilusie- en zuiverheidsformule te berekenen. Marker-expressie MFI-variatie volgens beenmergstatus werd bestudeerd voor gezonde donor-, inflammatoire en regenererende beenmergmonsters (Supplemental File-Figure S6). Referentiewaarden werden bepaald voor de meest relevante parameters, waaronder %MNC CD34⁺ uit WBC, %P6 CD34⁺CD38⁻ in MNC CD34⁺, %P7 CD34⁺CD38^dim in MNC CD34⁺, en %P8 CD34⁺CD38^hoog in MNC CD34⁺ (Supplemental File-Figuur S6).

Beoordeling van gevoeligheid en lineariteit

De gevoeligheid werd beoordeeld voor LAIP/DfN- en LSC-specifieke poorten door het aantal abnormale gebeurtenissen in een reeks referentiebeenmergmonsters te meten, waaronder regenererend, inflammatoire en gezonde donorbeenmerg. Seriële verdunning van een bekend aantal blasts in gezond beenmerg werd gebruikt om de kwantificatiegrens en lineariteit van MRD-metingen te verifiëren (Figuur 11 en Figuur 12).

Figuur 1: Gatingstrategie voor MRD LAIP-analyse in AML met primitieve markers (CD34⁺/CD117⁺) in buis 1. Eerste rij: sequentiële tijdsgating, levende cellen gebaseerd op FSC versus SSC, losse cellen gebaseerd op FSC-W versus FSC-H, WBC CD45⁺ cellen op CD45 versus SSC, blasts op CD45^dim/SSC, mononucleaire cellen (MNC) op FSC-A/SSC-A, MNC CD34⁺ cellen op de CD45 versus CD34 plot, en de primitieve markerpoort op de CD34 versus CD117 plot. Tweede en derde rijen: vaste biparametrische dotplots die worden gebruikt om de meest relevante LAIP-poorten te definiëren (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP werd gedefinieerd met de volgende Booleaanse strategie: tijd EN levende cellen EN enkele cellen EN (blasts OF MNC CD34⁺) EN primitieve markers (CD34^+/−CD117^+/−) EN LAIP1 EN LAIP2 EN LAIP3 EN LAIP4 EN LAIP5 EN LAIP6 EN LAIP7 EN LAIP8. In het geïllustreerde geval was MRD 6,8% van de WBC CD45⁺, vergeleken met 0,04% ± 0,03 in gezond beenmerg. Rechts: back-gating van de laatste MRD-poort die wordt gebruikt voor kwantificatie, zodat niet-specifieke gebeurtenissen, erythroblasten en puin kunnen worden opgeruimd. Afkortingen: AML = acute myeloïde leukemie; MRD = meetbare restziekte; LAIP = leukemie-geassocieerd immunofenotype; FSC = voorwaartse verstrooiing; SSC = zijdelingse verstrooiing; WBC = witte bloedcellen; MNC = mononucleaire cellen; hBM = gezond beenmerg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Gatingstrategie voor MRD ^LAIP-analyse in AML met behulp van volwassen blasts (CD34⁻CD117−) in buis 3. Eerste rij: sequentiële tijdsgating, levende cellen gebaseerd op FSC versus SSC, losse cellen gebaseerd op FSC-W versus FSC-H, WBC CD45⁺ cellen op CD45 versus SSC, blasts op CD45^dim/SSC, mononucleaire cellen (MNC) op FSC-A/SSC-A, MNC CD34⁺ cellen op de CD45 versus CD34 grafiek, en de volwassen blastpoort op de CD34 versus CD117 grafiek.
Tweede en derde rijen: vaste biparametrische dotplots die worden gebruikt om de meest relevante LAIP-poorten te definiëren (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP werd gedefinieerd met de volgende Booleaanse strategie: tijd EN levende cellen EN enkele cellen EN blasten EN CD34⁻CD117⁻ blasts EN LAIP1 EN LAIP2 EN LAIP3 EN LAIP4 EN LAIP5 EN LAIP6 EN LAIP7 EN LAIP8. In het geïllustreerde geval was MRD 15% van WBC CD45⁺, vergeleken met 0,09% ± 0,02 in gezond beenmerg.
Rechts: back-gating van de laatste MRD-poort die wordt gebruikt voor kwantificatie, zodat niet-specifieke gebeurtenissen kunnen worden opschoond. Afkortingen: AML = acute myeloïde leukemie; MRD = meetbare restziekte; LAIP = leukemie-geassocieerd immunofenotype; FSC = voorwaartse verstrooiing; SSC = zijdelingse verstrooiing; WBC = witte bloedcellen; MNC = mononucleaire cellen; hBM = gezond beenmerg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Gatingstrategie voor normale hematopoëtische stamcellen (nHSC's) en leukemische stamcellen (LSC)-verrijkte cellen in de CD34⁺CD38⁻ -fractie (buis 2). (A) Normale hematopoëtische stamcellen (nHSC's) en (B) leukemische stamcel (LSC)-verrijkte cellen in de CD34⁺CD38⁻ -fractie (buis 2). Eerste rij: sequentiële tijdsgating, levende cellen gebaseerd op FSC versus SSC, losse cellen gebaseerd op FSC-W versus FSC-H, WBC CD45⁺ cellen op CD45 versus SSC, blasts op CD45dim/SSC, mononucleaire cellen (MNC) op FSC-A/SSC-A, en MNC CD34⁺ cellen op de CD45 versus CD34 grafiek.
Tweede tot vierde rijen: vaste biparametrische puntdiagrammen die worden gebruikt om P6 (CD34⁺CD38⁻), P7 (CD34⁺CD38^laag) en P8 (CD34⁺CD38^hoog) te definiëren, samen met de meest relevante dichotomische LSC-markers, waaronder MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123 en CD45RA. MRD LSC werd gedefinieerd met de volgende Booleaanse strategie: tijd EN levende cellen EN enkele cellen EN blasten EN MNC EN MNC CD34+ EN P6 EN (P6 LSC MIX⁺ OF P6 LSC CD123⁺ OF P6 LSC CD45RA⁺).
Rechts: back-gating van de laatste MRD LSC-poort die wordt gebruikt voor kwantificatie, zodat niet-specifieke gebeurtenissen kunnen worden opschoond.
(A) nHSC's in een gezonde beenmergsteekproef: nHSC's (paarse gebeurtenissen) waren CD34⁺CD38⁻, MIX⁻ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁻, CD123⁻, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ en CD90⁺. De nHSC CD34⁺CD38⁻ fractie vertegenwoordigde 0,02% van de WBC CD45⁺, en LSC CD34⁺CD38⁻ cellen waren negatief. Gerapporteerde assay-drempels waren LOQ 0,0001% en LOD 0,001%.
(B) LSC-verrijkte cellen in een AML-monster: LSC-verrijkte cellen (oranje gebeurtenissen) waren CD34⁺CD38⁻, MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁺, CD123⁺, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ en CD90⁺. De LSC CD34⁺CD38⁻ fractie vertegenwoordigde 3,7% van de WBC CD45⁺. Afkortingen: nHSC's = normale hematopoëtische stamcellen; LSC = leukemische stamcel; MNC = mononucleaire cellen; WBC = witte bloedcellen; SSC = zijdelingse verstrooiing; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = humane leukocytenantigeen-DR; LOQ = kwantificatielimiet; LOD = detectielimiet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Definitie van de CD38⁻ drempel in de CD34^+- populatie met behulp van het CD38 fluorescentie-minus-één (FMO) kanaal. Eerste rij: gating van referentiepopulaties, inclusief blasts op CD45/SSC, MNC CD19⁺ cellen en MNC CD34⁺ cellen.
Tweede rij: signaalniveau in het CD38 FMO-kanaal. De eerste lijn toont blastocyten, de tweede lijn toont MNC CD19⁺ cellen en de derde lijn toont MNC CD34⁺ cellen. De oranje lijn geeft de drempel aan die de P6 CD34⁺CD38⁻ poort definieert.
Derde rij: CD38 PE-Cy7 signaalniveau. De eerste lijn toont blastocyten, de tweede lijn toont MNC CD19⁺ cellen met het CD38 hematogone niveau dat wordt gebruikt om P8 CD34⁺CD38^hoog te definiëren, en de derde lijn toont MNC CD34⁺ cellen, met P6 CD34⁺CD38⁻ cellen oranje, P7 CD34⁺CD38^lage cellen in groen en P8 CD34⁺CD38^hoog Cellen in blauw. Afkortingen: FMO = fluorescentie min één; MNC = mononucleaire cellen; SSC = zijdelingse verstrooiing; PE-Cy7 = fycoerythrine-cyanine 7; P6 = CD34+CD38− breuk; P7 = CD34+CD38 lage fractie; P8 = CD34+CD38 hoge fractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Evaluatie van de representativiteit van beenmergmonsters op basis van MNC CD34⁺ -cellen. (A) Gatingstrategie voor MNC CD34^+- cellen en parameters gebruikt voor formuleberekening: n, aantal MNC CD34^+- cellen; L, aantal WBC CD45⁺ cellen; s, het aandeel MNC CD34^+- cellen in normaal perifeer bloed; en m., het aandeel MNC CD34^+- cellen waargenomen in referentie normaal beenmerg. (B) Schematische weergave van de impact van beenmerg (BM) verdunning door perifeer bloed (PB) op de oorsprong van CD34^+- cellen in BM-monsters. (C) Criteria die worden gebruikt om de zuiverheid van BM te interpreteren. Afkortingen: BM = beenmerg; PB = perifeer bloed; MNC = mononucleaire cellen; WBC = witte bloedcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Vergelijking van expressiepatronen over vier flowcytometerplatforms.
Een normaal beenmerg (BM) monster werd gelijktijdig getest op vier cytometerplatforms met behulp van de gedefinieerde instellingen voor elk platform en de schaalaanpassing. De eerste rij toont MNC-cellen op de CD45/CD33 dot plot; de tweede rij toont MNC-cellen op de primitieve marker CD34/CD117 dot plot; de derde rij toont blastcellen op de CD34/CD38 dot plot; en de vierde rij toont P6 CD34⁺CD38⁻ cellen op de CD45RA/CD90 dot plot. Afkortingen: BM = beenmerg; MNC = mononucleaire cellen; P6 = CD34⁺CD38⁻ breuk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Wet-lab EQA-reproduceerbaarheid tussen deelnemende flowlaboratoria. (A) Vioolgrafiek die de verdeling toont van %P6 CD34⁺CD38⁻ cellen in WBC CD45⁺ cellen over de vijf wet-lab EQA-rondes en deelnemende flowlaboratoria. (B) Vioolgrafiek die de verdeling toont van %MNC CD34^+- cellen in WBC CD45^+- cellen over de vijf nat-lab EQA-rondes en deelnemende flowlaboratoria. Afkortingen: EQA = externe kwaliteitsbeoordeling; P6 = CD34+CD38− breuk; WBC = witte bloedcellen; MNC = mononucleaire cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Droge EQA-beoordeling van LAIP/DfN en LSC MRD-metingen. (A) Droge EQA2017 oefening voor LAIP/DfN en LSC MRD-metingen met zes gedeelde FCS-bestanden uit een 8-kleurenpaneelgroep, inclusief AML-diagnose, AML MRD en normale beenmergreferentiebestanden voor Tube 1 LAIP en Tube 2 LSC-analyse. De oefening werd gedeeld met 23 deelnemende laboratoria. (B) Droge EQA2024 oefening voor LAIP/DfN en LSC MRD-meting met zes gedeelde FCS-bestanden uit een 12-kleuren paneelgroep, inclusief AML-diagnose, AML MRD en normale beenmergreferentiebestanden voor Tube 1 LAIP en Tube 2 LSC-analyse. De oefening werd gedeeld met 24 deelnemende laboratoria. (C) Interplatformvergelijking van %MNC CD34⁺ cellen en %nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ cellen in WBC CD45⁺ cellen gemeten tijdens Wet EQA2025, gedeeld met 25 deelnemende laboratoria. Verwachte waarden waren 1,6% voor MNC CD34^+- cellen en 0,02% voor nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ -cellen. Afkortingen: EQA = externe kwaliteitsbeoordeling; LAIP = leukemie-geassocieerd immunofenotype; DfN = anders-dan-normaal; LSC = leukemische stamcel; MRD = meetbare restziekte; FCS = flowcytometriestandaard; AML = acute myeloïde leukemie; MNC = mononucleaire cellen; nHSC = normale hematopoëtische stamcel; WBC = witte bloedcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Representatieve MRD-meting met LAIP/DfN-benaderingen. (A) Voorbeeld van MRD-meting met de LAIP/DfN-methode. De linkerkant toont LAIP-cartografie van leukemische cellen in het diagnosemonster, en de rechterkant toont de toepassing van dezelfde LAIP-cartografie op het vervolgmonster, waarbij de MRD-populatie zwart is weergegeven. (B) Voorbeeld van MRD-meting met de DfN-methode. Elk paar dotplots vergelijkt gezond beenmerg (hBM; normaal, linker plot) met een MRD-follow-up beenmergmonster (DfN, rechter plot). Het gebied van "lege doos" wordt gedefinieerd op normaal beenmerg, en de aanwezigheid van leukemische cellen in deze lege doos wordt beoordeeld in de vervolgsteekproef, waarbij de abnormale populatie zwart wordt weergegeven. Afkortingen: MRD = meetbare restziekte; LAIP = leukemie-geassocieerd immunofenotype; DfN = anders-dan-normaal; hBM = gezond beenmerg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Representatieve meting van CD34⁺CD38⁻ LSC-verrijkte cellen bij diagnose en follow-up. (A) Voorbeeld van LSC-verrijkte celmeting in een AML-diagnosemonster. De linkerkant toont het LSC-verrijkte profiel, waarbij de oranje populatie MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA, CD117, HLA-DR en CD36 uitdrukt binnen de fractie CD34⁺CD38⁻ .
(B) Follow-up steekproef van dezelfde patiënt die persistentie toont van MRD LSC-verrijkte cellen met hetzelfde immunofenotypische profiel (oranje populatie). Afkortingen: LSC = leukemische stamcel; AML = acute myeloïde leukemie; MRD = meetbare restziekte; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = humane leukocytenantigeen-DR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Analytische gevoeligheid van LSC-detectie. (A) Evaluatie van de limiet van blank (LOB) voor LSC-detectie. De linkerkant toont kwantificatie van CD34⁺CD38⁻ -gebeurtenissen in een samenvoeging van vijf FCS-bestanden uit vijf gezonde beenmergmonsters (5.148.000 WBC-gebeurtenissen verkregen). De rechterkant toont het aantal gebeurtenissen dat behoort tot de LSC Boolean gate met achteren op de CD45/SSC dot plot (14 events), overeenkomend met een LOB van <0,0005% (5 × ^10-6). (B) Evaluatie van lineariteit voor LSC-kwantificatie. De linkerkant toont seriële verdunning door spike-in van LSC-verrijkte cellen in een gezond beenmergmonster. De rechterkant toont de correlatie tussen gemeten MRD-waarden en theoretische waarden, overeenkomend met een kwantificatielimiet (LOQ) van 2 × ^10-5 (0,002%). Afkortingen: LSC = leukemische stamcel; LOB = limiet van leeg; FCS = flowcytometriestandaard; WBC = witte bloedcellen; MRD = meetbare restziekte; LOQ = limiet van kwantificatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 12: Lineariteit en kwantificatiebereik van MRD LAIP-metingen. (A) Evaluatie van lineariteit voor MRD LAIP-kwantificatie door seriële verdunning van blasts met verschillende LAIPs in gezond beenmerg, waarbij de correlatie tussen gemeten MRD-waarden en theoretische waarden wordt getoond, met variabele LOQ volgens de verschillende LAIPs en LOQ <0,1%. (B) Bereik van kwantificatie volgens verschillende LAIPs. De rode lijn geeft de klinische drempel van 0,1% aan. De LOQ bereikte de klinische drempel voor alle geteste LAIPs. Afkortingen: MRD = meetbare restziekte; LAIP = leukemie-geassocieerd immunofenotype; LOQ = limiet van kwantificatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Fluoro chroom	Piek	LYRIC12c	Piek	DxFlex13c	Piek	NAVIOS10c	Piek	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
PE	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
APC	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

Tabel 1: Doelwaarden voor elk platform met 8-piek regenboogkralen. Specifieke doelwaarden worden weergegeven voor elk cytometerplatform (Canto, Lyric, Navios, DxFlex). De behouden pieken werden gekozen om dicht bij de MFI te liggen die voor blastcellen is waargenomen. Dit is vooral belangrijk voor PMT-gebaseerde cytometers, waar de signaalintensiteit niet lineair toeneemt met toenemende PMT-spanning. Daarentegen neemt op APD-gebaseerde cytometers de signaalintensiteit lineair toe met de versterking, waardoor dezelfde piek voor alle detectoren kan worden gebruikt, terwijl voor elk kanaal verschillende pieken vereist zijn op PMT-gebaseerde cytometers. Afkortingen: MFI = mediane fluorescentieintensiteit; PMT = fotomultiplierbuis; APD = lawine-fotodiode. Klik hier om deze tabel te downloaden.

CANTO 8C /NAVIOS 8c

FITC

PE

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

APC

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tube 1 LAIP 8c

CD7 5μL /CD56 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

Tube 2 LSC 8c

CD90 5μL

MIX3(2 0,5μL/AC)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supple mentaire Gran 8c

CD15 5μL

CD56 5μL

HLADR 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD11b 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supplem entaire - Monos 8c

CD36 5μL

CD64 5μL

CD14 10μL

HLADR 5μL

CD34 5μL

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

LYRIEK 10-12c

FITC

PE

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

APC

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tube 1LAIP 12c

CD7 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD56 5μL

CD10 2μL

CD36 2μL

Tube 2 LSC 12c

CD90 5μL

MIX3(2. 5μL/AC)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD200 5μL

CD19 5μL

CD36 2μL

T3 Supple mentaire 12c-Monos

CD15 5μL

CD64 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD14 5μL

CD11b 5μL

CD36 2μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 Navios 10c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T2 Navios 10c

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supple mentaire 10c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD11b 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13c

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD36 5μL

CD10 2μL

/

T2 DxFLEX 12-13c

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

/

CD200 5μL

HLADR SNV786 (3μL)

T3 Supple mentaire 12c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD64 5μL

CD11b 5μL

/

Tabel 2: Antilichaampaneelconfiguraties voor AML MRD LAIP/DFN en LSC-analyse. De tabel vat de panelconfiguraties van 8, 10, 12 en 13 kleuren samen volgens cytometerplatform. Buis 1 wordt gebruikt voor LAIP/DfN-analyse, buis 2 voor CD34⁺CD38⁻ LSC-verrijkte celanalyse, en buis 3 voor monocytische/granulocytaire differentiatiemarkers. Antilichaamvolumes en fluorochroomtoewijzingen worden voor elk platform weergegeven. MIX3 komt overeen met CD97, TIM3 en CLL1. Afkortingen: AML = acute myeloïde leukemie; MRD = meetbare restziekte; LAIP = leukemie-geassocieerd immunofenotype; DfN = anders-dan-normaal; LSC = leukemische stamcel; MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Volledig verlies van normaal tot expressie gebrachte markers op myeloïde precursoren

CD13++CD33-/CD34+ of CD117+

CD13-CD33++/CD34+ of CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

Expressie van kruislijnige lymfoïde markers op myeloïde voorlopers

CD7+CD13+/CD34+ of CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ of CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ of CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ of CD117+

CD19+CD117+/ of CD13+ of CD33+

Overexpressie op myeloïde voorlopers

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

Verminderde expressie op myeloïde precursors

CD38loCD34+CD33+CD117+

Tabel 3: LAIP-gebaseerde DfN-definities van "lege doos". De tabel geeft vooraf gedefinieerde verschillende-van-normale (DfN) "lege doos"-patronen weer die worden gebruikt om abnormale myeloïde precursorpopulaties te identificeren. Categorieën omvatten volledig verlies van normaal expressieve markers, cross-line expressie van lymfoïde markers, marker-overexpressie en verminderde markerexpressie op myeloïde precursors. Afkortingen: LAIP = leukemie-geassocieerd immunofenotype; DfN = anders-dan-normaal. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Holdrinet et al.17
Broolmans et al.15
Zuiverheid van het beenmerg = (1 − (GRMO/GRSG) x (GBSG/GBMO)) x 100	>80%
Björlund et al.19	GPA > 15%
	CD3 < 20%
Loken et al.18	CD16hoogste < 30%
Theunissen et al.20; Dworzak et al.21
Flow of Ctr DIL cytologisch: PNN < 40%, Ebl > 5%, Ly < 20%	CD16++ CD11b++ < 40%
	GPA > 5%
	CD3 < 20%
BM-zuiverheid %: MNC 34+/WBC45+	BM-zuiverheid 100-10%

Tabel 4: Methoden voor controle van beenmergverdunning voor AML MRD-stroomrapportage. De tabel vat gepubliceerde methoden voor beenmergverdunning en representatieve controle samen die gebruikt kunnen worden voor AML MRD-flowklinische rapporten. Ten minste één verdunnings- en controlemethode moet worden toegepast om de interpretatie van MRD-resultaten te ondersteunen. De CD34/WBC45^+- benadering van beenmergzuiverheid is opgenomen als een aanvullende kwaliteitsbeoordeling. Afkortingen: AML = acute myeloïde leukemie; MRD = meetbare restziekte; BM = beenmerg; WBC = witte bloedcellen; CD34/WBC45⁺ = CD34⁺ cellen onder CD45⁺ witte bloedcellen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Aanvullende achtergrond, platformharmonisatie, referentiebeenmerg en prognostische ondersteuningsmaterialen. Dit aanvullende bestand bevat ondersteunende figuren en tabellen met betrekking tot LSC-identificatie, AML-fenotypische heterogeniteit, interplatformspiegeling, platformspecifieke optimalisatie, referentieprofielen voor beenmergmarker-expressieprofielen, longitudinale panelevolutie en de prognostische drempel die wordt gebruikt voor LSC-kwantificatie bij diagnose. Deze materialen bieden extra context voor de multicenter MRD flow cytometrie-workflow, waaronder de onderbouwing voor CD34⁺CD38⁻ LSC-verrijkte celbeoordeling, de technische basis voor platformharmonisatie en ondersteunende gegevens die worden gebruikt om referentie-mergachtergrond, panelmigratie en klinische drempelselectie te interpreteren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Kritieke stappen in het protocol

Monsterkwaliteit is cruciaal voor nauwkeurige kwantificatie van MRD en LSC. Verse beenmergmonsters moeten bij kamertemperatuur worden vervoerd en idealiter binnen 24–48 uur worden verwerkt, en indien nodig binnen 72 uur na de verzameling^{van 23} uur. Hemodilusie moet op elk tijdstip worden geëvalueerd en opgenomen in het klinische flowrapport. De behandelaar moet het behandeltijdstip specificeren, bijvoorbeeld na inleiding, consolidatie, gerichte immunotherapie, minder intensieve behandeling zoals azacitidine/venetoclax, of allograft. Het landschap van differentiatie hangt nauw samen met behandeling en tijdstip en is belangrijk om te integreren in MRD-interpretatie. Tijdens longitudinale follow-up moet dezelfde instrumentgevoeligheid en analysebetrouwbaarheid worden gehandhaafd door regelmatige controles van doelwaarden met regenboogcontrolekorrels, regelmatige EQA en collegiale beoordeling van FCS-bestanden gedurende het hele onderzoek.

Een hoog niveau van standaardisatie en intercenterbetrouwbaarheid van MRD-stroomkwantificatie wordt gehandhaafd door regelmatige webgebaseerde educatieve training in de stroomgroep. Er werd minstens één webtrainingssessie per maand gehouden, en meer dan 100 gevallen van MRD LAIP/DfN, MRD LSC of diagnostische LSC-kwantificatie werden in deze jaren besproken en beoordeeld. Deze permanente educatie is belangrijk omdat het interpreteren van stroomgegevens een hooggekwalificeerde bioloog vereist, vooral voor laag-niveau MRD, fysiologische achtergrondpopulaties, regenererend merg en fenotypische switches die worden behandeld.

Kwantificatie van CD34⁺CD38⁻ LSC-verrijkte populaties is een andere cruciale stap. Er is geen universele marker om normale hematopoëtische stamcellen of LSC's te vangen. De HOFFON-groep introduceerde LSC-monitoring bij AML-diagnose en follow-up met behulp van een 8-kleurenpaneel inclusief een set relevante "dichotomische" LSC-markers³. Dichotomische markers worden gedefinieerd als geen expressie in normale hematopoëtische stamcellen, maar positieve expressie in LSC-verrijkte populaties, met zwakke, intermediaire, hoge, heterogene of bimodale patronen. Er is interesse in het opnemen van een mix van specifieke dichotomische LSC-markers, zoals CLL1, TIM3 en CD97, in één kanaal, omdat als er slechts één positief is, LSC-verrijkte cellen nog steeds kunnen worden gedetecteerd. Andere markers moeten apart worden gebruikt in specifieke kanalen omdat hun expressie kan overlappen met die van normale hematopoëtische stamcellen, afhankelijk van de toestand van het beenmerg, inclusief regenererend of gestresst merg²⁴. De volledige definitie van LSC-verrijkte cellen is gebaseerd op Booleaanse operatoren, inclusief abnormale expressie van markers in de CD34⁺CD38⁻ -fractie. Omdat dit een fenotypische definitie blijft, moet de populatie worden geïnterpreteerd als CD34⁺CD38⁻ LSC-verrijkte cellen in plaats van als functioneel bewezen LSC's in elke steekproef. Dit LSC-panel is ook toepasbaar bij patiënten met MDS met een overschot aan blastocysten en AML MRC met hetzelfde protocol.

Aanpassingen en probleemoplossing van de methode

Tijdens de evolutie van platforms en panelen moet de standaardisatie-/harmoniseringsaanpak binnen het laboratoriumnetwerk worden gehandhaafd, vooral bij de overstap van panelen met 8 naar 10 kleuren naar panelen met 12 tot 13 kleuren. Met de evolutie van machines is het noodzakelijk om een gemeenschappelijke ruggengraat van antilichamen te behouden en dezelfde gevoeligheid te behouden bij het opsporen van fenotypische afwijkingen gedurende de klinische studie. Tijdens de evolutie van het platform blijven de fluorochromen van antilichamen in de ruggengraat stabiel en gemeenschappelijk over alle machines (CD34/CD38/CD45/CD117). Voor sommige kanalen is echter een verandering van fluorochromen noodzakelijk vanwege de machinespecifieke optische bank, die een harmonisatiebenadering vereist. Bij de overstap van een PMT-detectorcytometer naar een APD-detectorcytometer moet rekening worden gehouden met de hoge gevoeligheid van APD-detectoren bij hoge golflengten. Daarom moet in sommige gevallen de keuze van fluorochromen voor bepaalde antilichamen worden aangepast om dezelfde kleuringsindex te behouden en overmatige verspreiding tussen kanalen te voorkomen, waardoor een optimalisatiebenadering wordt toegepast. Huidige klinische cytometers ondersteunen panelen van 12 tot 13 kleuren, wat de specificiteit in de detectie van LAIP verhoogt en de interpretatie verbetert door de toevoeging van markers die besmettende cellen in de MRD-poort elimineren. Dit verhoogt echter ook de complexiteit van analyse²³.

De upgrade van 8-kleuren naar 12-kleuren panelen verbeterde in sommige gevallen de gevoeligheid en specificiteit van MRD-beoordeling (Supplemental File 1). In buis 1 werden HLA-DR, CD36, CD10 en CD56 toegevoegd, gescheiden van CD7. In buis 2 werden HLA-DR, CD36, CD200 en CD19 toegevoegd. In buis 3 werden CD4, CD64, CD38, CD36 en CD14 toegevoegd. HLA-DR, nu systematisch gecombineerd met CD38 in elke buis, geeft een duidelijkere definitie van LAIP en gewijzigde differentiatiepatronen. CD36, nu systematisch opgenomen in elke buis, is een belangrijke marker voor het identificeren van erythroblasten, rode bloedcellen, bloedplaatjes en afval, en voor het verfijnen van de uiteindelijke MRD-poort. CD19 in de LSC-buis helpt ook bij het identificeren van hematogonen. Door monocyt- en granulocytdifferentiatiemarkers in één buis te combineren, kunnen monocytische en granulocytische differentiatiepatronen beter worden onderscheiden en helpt het afwijkingen te onderscheiden om LAIP te identificeren. Bij de overstap van 8-kleuren naar 10-kleuren panelen kwam de belangrijkste verbetering door LAIP-detectie, vooral met de toevoeging van HLA-DR en CD56 die gescheiden waren van CD7 in buis 1 en HLA-DR en CD19 in buis 2. Bij de overstap van 10-kleur naar 12-kleur panelen kwam de verbetering door een betere reiniging van de blast- en LSC-poorten met de toevoeging van CD36 in elke buis, voltooid door CD10 in buis 1 en CD200 in buis 2. Dit was vooral nuttig voor patiënten met een laag-niveau MRD boven de detectiegrens maar onder de kwantificatiegrens. Gezamenlijk waren de meeste patiënten met MRD-positiviteit op de klinische drempel ≥ 0,1% al geïdentificeerd met het 8-kleurenpaneel; echter, het gebruik van meer markers in de buisjes verbeterde de specificiteit en interpretatie van de MRD-beoordeling, vooral voor laag-niveau MRD zoals vermeld in de richtlijnen van ELN 2025.

Beperkingen van de methode

Het kiezen van een multicenter-aanpak kan een uitdaging zijn. De haalbaarheid van dit concept vereist verplichte stappen voordat MRD-flow in AML-klinische proeven worden geïmplementeerd: harmonisatie van instrumentgevoeligheid en monstervoorbereiding, en training en systematische educatie voor analytische operators²⁵. Naarmate platforms zich ontwikkelen, moet de multicenter, multiplatformstrategie worden aangepast om de robuustheid en reproduceerbaarheid van de resultaten te behouden. Dit omvat standaardisatie, waarbij hetzelfde paneel en dezelfde instellingen voor hetzelfde platformtype worden gebruikt; harmonisering, waarbij hetzelfde paneel op meerdere platforms met geharmoniseerde instellingen wordt gebruikt; en optimalisatie, met behulp van een paneel en specifieke instellingen die aan elk platform zijn afgestemd.

Hemodilusie is een van de meest uitdagende en kritieke punten voor de kwantificatie van de stroming van MRD. De CD34/WBC-representatieve formule die in dit protocol wordt beschreven, moet worden gebruikt als aanvullende kwaliteitscontrole voor het beenmergmonster en mag niet worden gebruikt om MRD-resultaten te normaliseren. De interpretatie ervan kan worden beïnvloed door mergregeneratie, behandelingseffecten, restziekte en minder intensieve regimes. Evenzo mogen markers zoals CD56, CD123 en CD45RA niet worden geïnterpreteerd als zelfstandige DfN- of LSC-markers. Ze moeten worden geïnterpreteerd binnen de volledige gatingstrategie, cleanup gates, referentie van beenmergachtergrond en klinische context.

Betekenis van de methode ten opzichte van bestaande of alternatieve methoden

Volgens de ELN 2025-richtlijnen is MRD een belangrijke prognostische marker bij patiënten met AML, ongeacht de techniek of het tijdstip van de beoordeling. Het gebruik van verschillende MRD-stromingstechnieken en markers is zeer complementair. Multimodale MRD, inclusief LAIP/DfN- en LSC-analyse, is nuttig mits de analyse wordt uitgevoerd binnen een gestandaardiseerd netwerk met geharmoniseerde rapportage van de resultaten. MRD-beoordeling maakt een betere definitie van therapeutische respons en terugval mogelijk. Multicenter- en multimodale MRD-flow, samen met moleculaire MRD, zal een strategische rol spelen in toekomstige klinische onderzoeken binnen een steeds complexer therapeutisch landschap dat nieuwe gerichte therapieën, eerste- en tweedelijnsbehandelingen, allogene transplantatie en laag-intensieve therapieën omvat.

Belang en potentiële toepassingen van de methode in specifieke onderzoeksgebieden

De HOVON- en ALFA-groepen rapporteerden dat kwantificering van CD34⁺CD38⁻ LSC-verrijkte populaties bij AML-diagnose klinisch effect heeft (Supplemental File 1). Het lijkt cruciaal om klinisch significante drempels voor LSC te definiëren op basis van de kwantificatiemethode. Zoals eerder gerapporteerd met de hier beschreven methode, was een LSC-drempel ≥1% geassocieerd met een ongunstig resultaat (Supplemental File 1)²⁶. Bij AML-behandeling kan differentiële integratie van MRD, LSC-monitoring en klonale hematopoëse helpen om de therapeutische interpretatie te verfijnen. De grootste uitdaging ligt in het onderscheiden van MRD, die mogelijk aanvullende behandeling vereist, van stabiele preleukemische klonen, die mogelijk^{niet 27} zijn. Een geïntegreerd rapportagesysteem voor het berekenen van het percentage explosies werd onlangs aanbevolen voor AML-follow-up in de 2025 EHA/ELN-richtlijnen²⁸. Het integreert MRD-resultaten met morfologische vergelijking voor een geharmoniseerde beoordeling van blasts en zou consistente rapportage in klinische onderzoeken moeten faciliteren om responscategorieën bij AML-patiënten te definiëren.

Zowel de HOVON-studie als de ALFA/FILO BIG1-studie tonen aan dat een score die LAIP/DfN- en LSC-benaderingen combineert het mogelijk maakte om patiënten in vier groepen te classificeren: LAIP⁻/LSC⁻, LAIP⁺/LSC⁻, LAIP⁻/LSC⁺ en LAIP⁺/LSC⁺, met verschillende 3-jaars totale overlevingspercentages ^3,26,29. Al met al illustreren deze resultaten het prognostische klinische effect van de gecombineerde MRD LAIP/DfN en LSC-status. In de context van allogene hematopoëtische stamceltransplantatie is de aanwezigheid van CD34⁺CD38⁻ LSC-verrijkte cellen ook gerapporteerd als voorspeller van falen na transplantatie, zelfs wanneer het totale aantal blasts minder dan 5% is^. Deze klinische gegevens ondersteunen de relevantie van gecombineerde MRD-stroomstrategieën, maar het huidige protocol richt zich op het standaardiseren van de technische workflow en rapportage tussen centra.

Als perspectief kan spectrale stroomtechnologie het panel van markers die gelijktijdig worden getest uitbreiden in een multidimensionale flowcytometrie-benadering, waardoor de specificiteit van gemonitorde LAIP's toeneemt en biologische achtergrondruis door hematopoëtische regeneratie wordt verminderd. De evaluatie van spectrale stroomreproducerbaarheid over platforms, panels en centra, zoals hier voorgesteld, zal een uitdaging zijn voor klinische implementatie. Nieuwe ongecontroleerde analyse-algoritmen, waaronder FlowSOM, t-SNE en UMAP, kunnen het onderscheiden van normale hematopoëse en het leukemisch compartiment vergemakkelijken, van de CD34⁺CD38⁻ LSC-verrijkte fractie tot de blastbulk. Het dieper opvangen van LSC-fracties kan helpen om de monitoring van engraftment in patiënt-afgeleide xenograftmodellen^{te verbeteren 31,32}. ELN-werkgroepen zijn opgericht om deze nieuwe benaderingen te valideren en te harmoniseren^33,34.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antibodies (CANTO 8C-LYRIC12C)	Fluorochroom	Bedrijf	Catalogusnummer
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
Antibodies (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	Fluorochroom	Bedrijf	Catalogusnummer
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500