Real-time tweefotonbeeldvorming van de hersenendotheliale NAD+ metabolisme bij muizen

Samenvatting

Dit protocol maakt realtime monitoring mogelijk van het metabolisme van het adenine dinucleotide metabolisme van het endotheliale nicotinamide in de hersenen in levende muizen met behulp van endotheliale biosensorexpressie, craniale venstervoorbereiding en twee-foton beeldvorming.

Samenvatting

We presenteren een reproduceerbare workflow voor realtime visualisatie van nicotinamide adenine-dinucleotide (NAD⁺) biosensor-kanaalresponsen in hersenmicrovasculaire endotheelcellen in levende muizen met behulp van craniaal-venster twee-fotonmicroscopie en een endotheliaal-gerichte fluorescerende NAD^+- sensor. Het protocol omvat (1) adeno-geassocieerd virus (AAV)-gemedieerde expressie van de NAD⁺ -sensor selectief in cerebrovasculair endotheel met behulp van AAV-X1.1 onder de Cdh5-promotor  (vasculaire endotheliale cadherine), (2) chirurgische voorbereiding van een stabiel 3 mm × 3 mm corticaal craniaal venster, en (3) dual-wavelength twee-fotonbeeldvorming om gelijktijdig het 920 nm geëxciteerde groene sensorkanaalsignaal en het 1040 nm geexciteerde intravasculaire tetramethylrhodamine (TMR)–dextran vast te leggen Referentiekanaal. Het TMR–dextran-kanaal biedt een referentie voor het vasculaire lumen en ondersteunt de keuze van het vat, bewegingsbeoordeling en de evaluatie van de vasculaire integriteit. Als toepassingsvoorbeeld beschrijven we nicotinamide-mononucleotide gerelateerde veranderingen in fluorescentie van endotheliale sensorkanaal na drinkwater, orale gavage of intraveneuze toediening. Dit protocol legt de nadruk op kritieke stappen, aanbevolen virale dosering en titeroverwegingen, probleemoplossing en kwantitatieve analysestrategieën, waardoor laboratoria in vivo monitoring van cerebrovasculaire NAD⁺ biosensor-kanaaldynamica kunnen implementeren voor studies naar neurometabolisme in gezondheid en ziekte.

Inleiding

Nicotinamide adeninedinucleotide (NAD⁺) is een centrale cofactor voor redoxbalans, mitochondriale activiteit, DNA-reparatie en stressresponsieve signalering. In de cerebrale vasculatuur wordt endotheliale NAD⁺ -homeostase steeds meer erkend als een actieve regulator van barrièreintegriteit, vasculaire tonus en neurovasculaire koppeling in plaats van als een passieve^{metabole uitleg}. Verstoring van het endotheliale NAD^+- metabolisme is in verband gebracht met verouderingsgeassocieerde bloed-hersenbarrière (BBB) lekkage en een verstoorde neurovasculaire homeostase, wat de noodzaak benadrukt van methoden die de endotheliale metabole dynamiek direct in levend hersenweefsel kunnen oplossen².

De meest momenteel gebruikte benaderingen om NAD⁺ te kwantificeren zijn gebaseerd op eindpuntbiochemische metingen, vaste weefselkleuring of ex vivo sensoruitlezingen. Hoewel informatief, behouden deze benaderingen de intacte microvasculaire architectuur niet, kunnen ze snelle veranderingen binnen dieren in de loop van de tijd niet gemakkelijk onderscheiden en bieden ze beperkte celtypespecificiteit wanneer toegepast op heterogeen hersenweefsel. Daarentegen maakt chronische crniaal-venster twee-foton beeldvorming herhaalde visualisatie van corticale microvaten in levende muizen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk, waardoor het zeer geschikt is voor het monitoren van metabolisch responsieve endotheelsignalen onder gedefinieerde fysiologische of farmacologische interventies ^3,4,5.

Het algemene doel van dit protocol is om een end-to-end workflow te bieden voor realtime monitoring van hersenendotheliale NAD⁺-dynamiek in vivo. De methode combineert systemische levering van een endotheel-getargete, verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP)-gebaseerde NAD⁺-sensor, verpakt in adeno-geassocieerd virus (AAV)-X1.1 en aangedreven door de Cdh5-promotor, een stabiel schedelvenster van 3 mm × 3 mm voor optische toegang ^6,7,8, en dual-wavelength twee-fotonbeeldvorming met een intravasculair tetramethylrhodamine (TMR)–dextran referentiekanaal¹. Het sensormechanisme is als volgt verduidelijkt: de Cambronne et al. LigA-cpVenus cytoplasmatische NAD⁺ biosensor is een inverse respons cpVenus-gebaseerde sensor. NAD^+-binding vermindert cpVenus/eGFP-achtige fluorescentie in de standaard 488 nm excitatieweergave, terwijl een 405 nm excitatiekanaal dient als referentie voor ratiometrische normalisatie. Daarom moet rauwe groene fluorescentie niet worden geïnterpreteerd als een directe positieve maat voor de NAD⁺-concentratie. In deze twee-fotonimplementatie wordt 920 nm excitatie gebruikt om het groene sensorkanaalsignaal te verkrijgen, terwijl 1040 nm excitatie wordt gebruikt voor het TMR–dextran vasculaire referentiekanaal; Daardoor is de huidige 920/1040 nm-opname niet gelijk aan een gekalibreerde ratiometrische meting van 488/405 nm. De biosensor van Cambronne et al. werd gekozen omdat deze uitgebreid is gevalideerd voor het monitoren van intracellulaire NAD⁺-dynamiek en compatibel is met de huidige dual-wavelength beeldvorming. Hoewel nieuwere indicatoren zoals FiNad alternatieve benaderingen bieden voor het monitoren van NAD⁺-dynamiek, zou hun implementatie aanpassing vereisen van het rode fluorescentiekanaal dat momenteel wordt gebruikt voor TMR–dextran vasculaire referentielabeling. De Cambronne-sensor rapporteert relatieve veranderingen in NAD^+-beschikbaarheid binnen een eindig dynamisch bereik en is gevalideerd in cellulaire en subcellulaire toepassingen; echter, signaalinterpretatie kan worden beïnvloed door expressieniveau, pH, fotobleaching en variabiliteit in het optische pad, en absolute NAD^+-kwantificatie vereist kalibratie of orthogonale biochemische validatie. AAV-X1.1 werd gekozen omdat endotheel-tropische AAV-varianten gerapporteerd zijn als efficiënt transducerende bloedvaten^van het centrale zenuwstelsel ^6,7. In onze voorlopige vergelijking van verschillende AAV-serotypen, waaronder AAV9, AAV-BR1, AAV-ENT en AAV-X1.1, waarbij CAG- of Cdh5-gedreven verbeterde groene fluorescerende eiwitexpressie als rapportage werd gebruikt, produceerde AAV-X1.1 het meest gunstige vasculair geassocieerde expressiepatroon onder de geteste serotypen. De Cdh5-promotor werd vervolgens gebruikt om transgenexpressie verder te beperken tot vasculaire endotheelcellen, in overeenstemming met eerdere rapporten die endotheelselectieve transgenexpressie in vivo⁶ aantoonden.

In vergelijking met ex vivo NAD⁺-assays behoudt deze aanpak het intacte vasculaire netwerk, maakt longitudinale metingen bij hetzelfde dier mogelijk en maakt gelijktijdige beoordeling van endotheliale metabole signalen en een vasculaire lumenreferentie mogelijk. De workflow is vooral nuttig voor studies naar veroudering, ontstekingsstress, BBB-disfunctie en snelle reacties op metabole interventies zoals toediening van nicotinamidemononucleotide (NMN) 9,10,11,12,13. Deze methode is het meest geschikt wanneer de experimentele vraag herhaalde visualisatie vereist van corticale microvaten bij levende muizen en relatieve veranderingen in een endotheliale sensorkanaalsignaal. Het is minder geschikt voor absolute NAD^+-kwantificatie zonder aanvullende ratiometrische kalibratie of biochemische validatie. Praktische beperkingen zijn onder andere corticale optische toegankelijkheid, beperkingen op beeldvormingsdiepte, afhankelijkheid van succesvolle endotheliale AAV-transductie, mogelijke craniaalvenster-geassocieerde ontsteking en de noodzaak voor een dual-wavelength tweefotonmicroscoop. Chronische crniaal-venster-implantatie kan lokale ontsteking, vasculaire reactiviteit, gliose, ondoorzichtigheid of weefselremodellering veroorzaken, die allemaal invloed kunnen hebben op de endotheelfysiologie en sensorkanaalmetingen ^1,3,4. Om deze verstorende factoren te minimaliseren, vereist het protocol aseptische chirurgie, intermitterende boringen met frequente koeling, zorgvuldige hemostase, het vermijden van hechtend contact met de dura, postoperatieve analgesie, dagelijkse monitoring en het uitsluiten van dieren met aanhoudende ondoorzichtigheid, ontstekingsafval, infectie, instabiele vasculaire morfologie of slechte signaalstabiliteit op de basislijn.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de University of Health and Rehabilitation Sciences onder het project getiteld "Mechanistic Study of Metabolic Probe-Based Observation of Blood–Brain Barrier Integrity" (goedkeuringsnummer KFDX: NO. 2023-1023). Voer alle operaties uit onder aseptische omstandigheden en bied perioperatieve analgesie en ondersteunende zorg volgens het goedgekeurde dierenprotocol. In de representatieve workflow dient u buprenorfinehydrochloride (0,05–0,1 mg/kg, subcutaan) toe vóór of direct na de operatie en vervolgens elke 8–12 uur gedurende 24–48 uur indien nodig. Haal muizen terug in een verwarmde kooi en houd ze in de gaten totdat normale houding, spontane beweging en stabiele ademhaling zijn hersteld.

1. Experimenteel overzicht

1. Gebruik volwassen C57BL/6J-muizen van 10–12 weken oud en met een gewicht van 23–25 g voor de representatieve experimenten.
2. Houd muizen onder specifiek-pathogene vrije omstandigheden met een licht/donker-cyclus van 12 uur, een omgevingstemperatuur van 22°C–24°C, een relatieve luchtvochtigheid van 40%–60% en ad libitum toegang tot voedsel en water.
3. Acclimatismeer de dieren minstens 7 dagen voor de ingrepen.
4. Gebruik elk geslacht als het experimenteel plan passend is. Rapporteer geslacht, dieraantallen en groepstoewijzing voor elk experiment. De hier getoonde representatieve beeldvormingsdataset gebruikte N = 3 muizen.
5. Dien eerst systemische AAV toe en geef een expressieperiode van 3–4 weken vóór beeldvorming.
6. Voer een craniaal-vensteroperatie uit 3–5 dagen voor beeldvorming.
7. Verdoving van muizen op de beeldvormingsdag, injecteer TMR–dextran intraveneus en voer beeldvorming uit na voldoende tracercirculatie.
8. Dien NMN toe volgens het geselecteerde interventieschema. Geef 5 dagen drinkwatersuppletie vóór beeldvorming, voer orale gavage uit op het vooraf bepaalde interval vóór beeldvorming, of dien intraveneuze NMN toe tijdens de beeldvorming na de basisverwerving.
   OPMERKING: Pauzeer het protocol na AAV-toediening tijdens de expressieperiode van 3–4 weken en houd dieren onder routinematige gezondheidsmonitoring en standaard huisvestingsomstandigheden. Pauzeer het protocol na een craniaal-vensteroperatie tijdens de herstelperiode van 3–5 dagen. Controleer voordat je met beeldvorming begint een stabiel lichaamsgewicht, normale verzorging en activiteit, het ontbreken van infectie of overmatige ontsteking, en een vrij schedelraam.

2. Craniale vensterchirurgie voor longitudinale corticale beeldvorming

1. Pre-operatieve voorbereiding
   1. Steriliseer alle chirurgische instrumenten en vestig een steriel veld voordat de anesthesie wordt ingeleid.
   2. Stel het homeothermische verwarmingssysteem zo in dat het de lichaamstemperatuur op 36,5°C–37,5°C blijft, bij voorkeur met een rectale probe feedbackcontroller.
   3. Bereid ademhalingsmonitoringapparatuur voor en bevestig een stabiele operatie vóór de operatie.
   4. Bereid steriele zoutoplossing, absorberende wattenstaafjes, hemostatische materialen, een steriele nr. 1,5 glazen dekmantel, een metalen kopplaat en tandcement voor voordat u met de procedure begint.
   5. Gebruik een steriele No. 1,5 glazen deklaag ter grootte om het 3 mm × 3 mm hoofdraam volledig te bedekken en vlak op de schedelrand te zitten.
   6. Bereid een hogesnelheidsmicroboor voor met een braam van 0,5–1,0 mm.
   7. Bedien de boor op ongeveer de helft van de maximale snelheid en controleer dat steriele zoutwaterirrigatie direct kan worden toegepast tijdens het verdunnen van de schedel.
   8. Breng tijdens het boren steriele zoutoplossing op kamertemperatuur aan met een wattenstaafje of druppelaar om de schedel af te koelen en botstof te verwijderen.
2. Anesthesie, hoofdhuidvoorbereiding en schedelblootstelling
   1. Verdoving van muizen met vers bereide Avertine-werkoplossing (1,25%, 12,5 mg/mL) door intraperitoneale injectie bij 200–250 mg/kg.
      1. Bereid de werkoplossing van Avertine voor uit 2,2,2-tribromoethanol en 2-methyl-2-butanol volgens de standaardprocedures van de institution, bescherm de oplossing tegen licht en gooi preparaten met neerslag of verkleuring weg.
   2. Bevestig een stabiel chirurgisch vlak door verlies van de pedaalterugtrekkingsreflex en stabiele ademhaling.
   3. Breng onmiddellijk na de inleiding van de anesthesie oogzalf aan op beide ogen.
   4. Als inhalatie-anesthesie wordt gebruikt, induceer dan anesthesie met 3%–4% isofluraan.
   5. Houd een anesthesie met 1%–2% isofluraan in zuurstof bij 0,5–1,0 L/min en pas aan op ademhaling en reflexen.
      VOORZICHTIG: Behandel anesthesia volgens institutionele veiligheidsprocedures en gebruik geschikte opvangsystemen bij het toedienen van inhalatie-anesthesie.
   6. Zet de muis vast in een stereotacisch frame of een aangepaste hoofdhouder die stabiele toegang tot de dorsale schedel biedt.
   7. Houd de lichaamstemperatuur op 36,5°C–37,5°C met behulp van een terugkoppelingsgestuurde verwarmingskussen en rectale sonde wanneer beschikbaar.
   8. Scheer de hoofdhuid en verwijder losse haren uit het operatieveld.
   9. Desinfecteer de hoofdhuid met afwisselend povidon-jodium- of jodofoplossing en 70% ethanol gedurende drie cycli.
   10. Vermijd het toelaten van desinfectiemiddel in de ogen of schedelopening.
   11. Maak een incisie op de hoofdhuid in het midden en trek de huid voorzichtig terug.
   12. Laat de schedel voldoende bloot om zowel het creëren van schedelvensters als de fixatie van de hoofdplaat mogelijk te maken.
   13. Verwijder het periost en het resterende bindweefsel met fijne tangen of een scalpelmes.
   14. Droog de schedel voorzichtig met steriele wattenstaafjes gedurende ongeveer 10–20 seconden totdat het oppervlak mat lijkt in plaats van nat.
   15. Voorkom overmatige uitdroging van blootgesteld weefsel.
3. Het markeren van een 3 mm × 3 mm craniotomie
   1. Identificeer bregma en lambda onder de chirurgische microscoop.
   2. Gebruik deze anatomische herkenningspunten om de middellijn te oriënteren en het cortexale gebied te targeten.
   3. Markeer een vierkant van 3 mm × 3 mm op één halfrond van de dorsale somatosensorische cortex.
   4. Plaats de voorste rand ongeveer 0,5 mm achter de bregma en de mediale rand ongeveer 1,0 mm lateraal ten opzichte van de middenlijn.
   5. Vermijd grote schedelhechtingen en grote oppervlaktevaten waar mogelijk.
4. Boren en botflapverwijdering
   1. Verdun de schedel langs de gemarkeerde omtrek met intermitterende booraanraking in plaats van continue druk.
   2. Breng tijdens het boren herhaaldelijk steriele zoutoplossing aan om thermische schade te voorkomen.
   3. Geef ongeveer 20–50 μL steriele zoutoplossing per toepassing, of genoeg om het schedeloppervlak vochtig en koel te houden.
   4. Herhaal de irrigatie elke 10–20 seconden of wanneer botstof zich ophoopt of warmteophoping wordt vermoed.
   5. Blijf dunner worden totdat het bot uniform doorschijnend en licht flexibel wordt.
   6. Bevestig voldoende dunner worden door zichtbare durale vaten, behouden durale pulsatie en afwezigheid van corticale compressie of thermische verkleuring te observeren.
   7. Stop onmiddellijk met boren als er overmatige warmteopbouw, bloedingen of verminderde durale pulsatie optreden.
   8. Spoel het gebied en beoordeel opnieuw voordat je verder gaat.
   9. Til de botflap voorzichtig op vanaf één hoek met fijne pincetten of een naaldpunt.
   10. Dunner de omtrek opnieuw als er weerstand blijft.
   11. Behoud de dura intact tijdens het verwijderen van de botflap.
   12. Spoel botstof af met steriele zoutoplossing.
   13. Beheers lichte bloedingen met milde zoutoplossing en absorberende wattenstaafjes.
   14. Beschouw bloeding als acceptabel als het binnen 1–2 minuten na spoeling en contact met absorberend wattenstaafje verdwijnt.
   15. Sluit het dier uit of stop de procedure als het bloeden langer dan ongeveer 5 minuten aanhoudt.
   16. Sluit het dier uit of beëindig de procedure als de dura gescheurd is, corticale compressie optreedt of bloed het beeldgebied belemmert.
       OPMERKING: De procedure kan tijdelijk worden gepauzeerd na volledige hemostase en vóór het plaatsen van de dekmantel. Houd de blootgestelde dura vochtig met steriele zoutoplossing en hervat pas nadat je hebt bevestigd dat er geen actieve bloeding is.
5. Raamafdichting en bevestiging van kopplaten
   1. Controleer of de blootgestelde dura schoon, vochtig en vrij van actieve bloedingen is.
   2. Plaats een steriel dekbedekking over de craniotomie.
   3. Plaats de dekmantel op de schedelrand rondom de craniotomie zonder de dura samen te drukken.
   4. Controleer de juiste positie door een vlak deklaag te controleren, het ontbreken van gevangen luchtbellen, de behouden durale pulsatie en een vrij optisch pad.
   5. Bereid tandcement of Super-Bond C&B-type lijm voor volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Voor de representatieve Super-Bond C&B-bereiding mengt u 1 schep poeder met 1 druppel katalysator en 4 druppels monomeer in een voorgekoelde keramische schaal die direct voor toepassing op ongeveer −20°C wordt gehouden.
   6. Breng alleen lijm aan rond de buitenste schedelrand rondom de dekmantel.
   7. Vermijd lijmcontact met de dura en vermijd capillaire wick-back onder het glas.
   8. Laat de lijm ongeveer 5–10 minuten uitharden bij kamertemperatuur.
      VOORZICHTIG: Tandcement en lijmcomponenten kunnen vluchtige of irriterende chemicaliën bevatten. Behandel ze volgens de institutionele veiligheidsprocedures en gebruik de juiste ventilatie.
   9. Plaats een op maat gemaakte titanium hoofdplaat rond het schedelraam.
   10. Gebruik een hoofdplaat met een centrale opening van ongeveer 10 mm die compatibel is met de houder voor de beeldvormingskop.
   11. Centreer het schedelraam binnen de opening van de hoofdplaat.
   12. Breng tandcement alleen aan op schedelcontactgebieden buiten het optische venster.
   13. Laat het cement ongeveer 5–10 minuten volledig uitharden voordat je het dier verplaatst.
6. Postoperatief herstel en kwaliteitscontrole van het raam
   1. Dien postoperatieve analgesie toe volgens het goedgekeurde dierprotocol.
   2. In de representatieve workflow dient u buprenorfinehydrochloride toe bij 0,05–0,1 mg/kg subcutaan elke 8–12 uur gedurende 24–48 uur.
   3. Haal muizen terug in een verwarmde kooi.
   4. Monitor dagelijks ademhaling, houding, beweging, verzorging en lichaamsgewicht.
   5. Neem schedelvensters met een transparant glas, zichtbare corticale bloedvaten, intacte dura, minimale restbloed, geen lijm onder de dekfolie, geen infectie en stabiele fixatie van de hoofdplaat.
   6. Sluit dieren met uitgesproken ondoorzichtigheid, aanhoudende bloedingen, ontstekingsresten uit, infectie, raamverplaatsing, ernstig gewichtsverlies (>15%) of slechte verzorging en activiteit.
   7. Ga na 3–5 dagen herstel door met beeldvorming.
   8. Bevestig normale activiteit, normaal verzorgingsgedrag, stabiel lichaamsgewicht, afwezigheid van pijn of infectie, en een transparant schedelvenster met duidelijk zichtbare bloedvaten vóór de beeldvorming.
      OPMERKING: Het protocol kan worden gepauzeerd tijdens de postoperatieve herstelperiode. Houd muizen onder standaard huisvestingsomstandigheden, monitor dagelijks het lichaamsgewicht en de helderheid van het raam, en hervat de beeldvorming pas nadat aan alle herstelcriteria is voldaan.

3. AAV-gemedieerde endotheliale NAD⁺ sensorexpressie

1. Virale constructie en voorbereiding
   1. Gebruik een eGFP/cpVenus-gebaseerde genetisch gecodeerde NAD⁺ -biosensor, aangedreven door de endotheliale Cdh5-promotor.
   2. Gebruik de Cambronne et al. LigA-cpVenus cytoplasmatische NAD⁺ biosensorsequentie (bijvoorbeeld Addgene plasmide #186787 of een gelijkwaardig sequentie-geverifieerd insert).
   3. Klonen van de Cdh5-promotor stroomopwaarts van de NAD⁺ biosensorcoderingssequentie met behulp van de CV232-vectorbackbone.
   4. Verpak de expressiecassette in de AAV-X1.1 capside als een aangepaste virale voorbereiding.
      1. Noteer de leverancier van virale productie, zuiveringsmethode, viraal-genoom kwantificatiemethode, productiebatchnummer en analysecertificaat voor elke AAV-voorbereiding.
   5. Noteer de plasmidkaart, sequentieverificatieresultaten, virale productie-informatie, zuiveringsinformatie, virale genoomtiter en certificaat van analyse voor elke virale preparat.
      1. Registreer de constructkaart, sequentieverificatierapport, virale productiebatchnummer, kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) titerrapport, zuiveringsdocumentatie en analysecertificaat voor elke virale preparaat die in de studie wordt gebruikt.
   6. Raadpleeg de Materiaaltabel voor alle details van het construct.
   7. Gebruik hoog-titer AAV-preparaten met lot-specifieke qPCR-titers, doorgaans groter dan 2 × 10¹³ vg/mL.
   8. Bewaar wegwerp-aliquots op −80°C.
   9. Vermijd herhaalde vries-dooicycli.
   10. Noteer de productielot, qPCR-titer, opslagduur en acceptabele variatie per partij vóór gebruik.
2. Systemische AAV-administratie
   1. Ontdooi een virale aliquot op ijs.
   2. Verdun het virus in steriele fosfaatgeborrelde zoutoplossing (PBS) tot een eindinjectievolume van 100–200 μL per muis.
   3. Houd een einddosis van 2 × 10 ๲ vg per muis bij dieren aan.
      1. Bereken het injectievolume uit de lot-specifieke viraal-genoom titer. Voor de representatieve voorbereiding met een qPCR-titer van 1,39 × 10¹³ vg/mL, injecteer je ongeveer 144 μL om een dosis van 2 × 10¹² vg per muis toe te dienen.
   4. Het virus wordt toegediend door een retro-orbitale veneuze sinusinjectie met een steriele 29 G insulinespuit.
   5. Injecteer de virale suspensie langzaam over ongeveer 10–20 seconden.
   6. Bevestig de succesvolle bevalling door te controleren of er geen lekkage, overmatig bloedverlies of oogletsel is.
   7. Valideer en rapporteer elke alternatieve administratieroute apart.
   8. Observeer de muis totdat de normale houding en spontane beweging zijn hersteld.
   9. Bevestig stabiele ademhaling en afwezigheid van bloedingen of stress.
   10. Breng het dier pas na volledige herstel terug in zijn thuiskooi.
   11. Houd 21–28 dagen voor sensorexpressie in vóór beeldvorming.
   12. Houd een consistent expressieinterval aan binnen elke vergelijkingsset.
   13. Valideer expressieintervallen buiten het 21–28-dagen bereik apart.
       OPMERKING: Het protocol kan worden gepauzeerd tijdens de AAV-expressieperiode. Houd routinematige verzorging en gezondheidsmonitoring bij en ga pas door met een schedelraamoperatie nadat de geplande expressieperiode is verstreken en het dier gezond blijft.
3. Validatie van endotheelrestrictie
   1. Screenen dieren voordat je formele gegevensverzameling hebt.
   2. Accepteer dieren wanneer het groene sensorkanaalsignaal detecteerbaar is en het vaatstelsel volgt.
   3. Bevestig dat het signaal verrijkt is langs de vatwanden naast de TMR–dextran–positieve lumen.
   4. Bevestig de afwezigheid van dominante diffuse parenchymale fluorescentie.
   5. Pas identieke acceptatiecriteria toe bij alle experimentele groepen.
   6. Perfusen muizen met PBS gevolgd door 4% paraformaldehyde wanneer post-hoc validatie vereist is.
   7. Verzamel de hersenen en bereid 30–40 μm coronale of sagittale secties voor.
   8. Kleursecties met endotheelmarkers zoals tomatenlectine, CD31, of vasculaire endotheliale cadherine (VE-cadherine).
      1. Noteer de bron van de antistoffen, catalogusnummer, lotnummer, gastsoort, verdunning, incubatiecondities en detectiemethode voor elk validatie-experiment.
   9. Beoordeel nicotinamide fosforibosyltransferase (NAMPT) en poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) expressie indien nodig.
   10. Gebruik primaire antilichaamverdunning die geoptimaliseerd is voor de weefselvoorbereiding.
   11. Verwijder fluorescentie- of confocale beelden met identieke acquisitie-instellingen over groepen heen.
   12. Kwantificeer colocalisatie als het aandeel sensor-positief signaal dat overlapt met of direct aangrenzt aan vasculaire marker-positieve regio's.
   13. Sluit dieren uit wanneer het meest detecteerbare signaal zich buiten de vaatstructuren bevindt.
   14. Sluit dieren uit wanneer verrijking van de vatwand ontbreekt.
   15. Sluit dieren uit wanneer off-target parenchymale fluorescentie betrouwbare selectie van interessegebied verhindert.
   16. Sluit dieren uit wanneer sensorkanaalfluorescentie verzadigd of instabiel is tijdens de basisverwerving.

4. Twee-foton beeldvorming en kwantitatieve analyse

1. Voorbereiding op beeldvormingsdagen en intravasculaire referentielabeling
   1. Verdoof muizen met vers bereide Avertine-werkoplossing (1,25%, 12,5 mg/mL) door intraperitoneale injectie bij 200–250 mg/kg, of gebruik het anesthesieregime dat is goedgekeurd door het institutionele dierprotocol.
   2. Bevestig een stabiel chirurgisch vlak door verlies van pedaalterugtrekking en stabiele ademhaling.
   3. Breng direct na de inleiding oogzalf aan.
   4. Als inhalatie-anesthesie wordt gebruikt, induceer dan anesthesie met 3%–4% isofluraan.
   5. Houd een anesthesie met 1%–2% isofluraan in zuurstof bij 0,5–1,0 L/min en pas aan op ademhaling en reflexen.
   6. Bereid 70 kDa TMR–dextran voor in steriele PBS bij 10–25 mg/mL.
   7. Bescherm de TMR–dextran-oplossing tegen licht en filter de oplossing indien vereist door institutionele praktijk.
   8. Injecteer TMR–dextran intraveneus met 20 mg/kg.
   9. Pas het injectievolume aan volgens de voorraadconcentratie. Voor een muis van 25 g geef je ongeveer 0,5 mg totale kleurstof.
   10. Bereid de tracer vers voor of bewaar aliquots beschermd tegen licht volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
   11. Laat TMR–dextran 5–10 minuten circuleren voordat er beelden worden verworven.
2. Microscoopconfiguratie
   1. Gebruik een twee-fotonmicroscoop met dubbele golflengte, geconfigureerd voor 920 nm excitatie van het eGFP-gebaseerde sensorkanaal.
   2. Gebruik een excitatiepad van 1040 nm voor het TMR–dextran vasculaire referentiekanaal.
   3. Representatieve beeldvorming werd uitgevoerd op een Nikon A1 MP/A1R MP+ multifotonmicroscoop die werd aangestuurd door NIS-Elements AR/AR Analysis software (versie 5.42.06).
   4. Noteer de laserbronnen, pulsparameters, bundelcombinatieconfiguratie, detectortype en softwareversie voor elk beeldvormingssysteem.
   5. Configureer detectiekanalen om het sensorkanaalsignaal te scheiden van het TMR–dextran-signaal.
   6. Gebruik niet-gedescande fotomultiplierbuis (PMT) of galliumarsenidefosfide (GaAsP) detectoren.
   7. Verzamel groene sensorkanaalemissie tussen ongeveer 500 en 550 nm.
   8. Verzamel TMR–dextran-emissie tussen ongeveer 570 en 650 nm.
      1. In de representatieve dataset wordt groene sensorkanaalemissie verzameld met een 525/50 nm emissiefilter en TMR–dextran-emissie met een 575/25 nm of 610/75 nm emissiefilter.
   9. Minimaliseer spectrale doorvloeiing tussen kanalen.
   10. Houd de versterking en offset van de detector constant binnen elke vergelijkingsset.
   11. Controleer kanaalafstand met enkelkanaalbediening wanneer beschikbaar.
   12. Gebruik een Nikon CFI75 Apochromat 25XC W 1300 wateronderdompelingsobjectief of gelijkwaardig (25×, numeriek diafragma 1,10, werkafstand 2,0 mm).
   13. Bevestig kanaalcoregistratie met vaste vasculaire herkenningspunten zoals bifurcaties en lumenranden.
   14. Herhaal de co-registratieverificatie na elke aanpassing van het optische pad.
   15. Meet de laserkracht op het monstervlak vóór beeldvorming.
   16. Houd een laservermogensconstante van 920 nm binnen elke vergelijkingsset.
   17. Houd een laservermogensconstante van 1040 nm binnen elke vergelijkingsset.
   18. Gebruik ongeveer 10–20 mW bij 920 nm en 8–18 mW bij 1040 nm als representatieve werkbereiken.
   19. Pas de laserkracht aan op basis van beelddiepte en de kwaliteit van het schedelraam.
   20. Sluit velden uit die meer dan 20% signaalverlies tonen tijdens de 120 seconden basisperiode.
   21. Sluit velden uit die zichtbare fototoxische veranderingen tonen.
3. Verwervingsinstellingen
   1. Selecteer gezichtsvelden met een helder optisch venster, scherp gefocuste microvaten en minimale beweging.
   2. Accepteer ramen met een transparante dekmantel, zichtbare corticale bloedvaten, intacte dura, minimale restbloed, geen lijm onder de dekmantel, geen infectie en stabiele fixatie van de hoofdplaat.
   3. Sluit dieren met duidelijke ondoorzichtigheid, aanhoudende bloedingen, ontstekingsresten uit, infectie, raamverplaatsing, ernstig gewichtsverlies (>15%) of slechte verzorging/activiteit.
   4. Maak time-lapse beelden van 512 × 512 pixels.
   5. Verzamel representatieve stilstaande beelden op 1024 × 1024 pixels wanneer hogere ruimtelijke details vereist zijn.
   6. Houd pixelgrootte, zoom, scansnelheid en gezichtsveld constant binnen elke vergelijkingsset.
   7. Verkrijg z-stacks met een stapgrootte van 1–3 μm.
   8. Beeld corticale microvaten in op dieptes van ongeveer 200–250 μm onder het piale oppervlak.
   9. Verhoog de beeldingsdiepte tot ongeveer 400 μm wanneer de raamkwaliteit het toelaat.
   10. Houd de beeldingsdiepte constant voor gekoppelde vergelijkingen.
   11. Behaal een 120 s baseline met intervallen van 1 s vóór acute interventies.
   12. Ga door met de acquisitie gedurende de vooraf bepaalde periode na de interventie.
   13. Registreer intraveneuze NMN-responsen ongeveer 10–30 minuten na injectie.
   14. Verkrijg drinkwater- en orale gavage-datasets op vooraf gedefinieerde experimentele eindpunten.
   15. Houd identieke acquisitie-instellingen aan voor alle vergelijkingsgroepen.
4. NMN-interventie (toepassingvoorbeeld)
   1. Los NMN op in steriel drinkwater.
   2. Pas de NMN-concentratie aan om ongeveer 100 mg/kg/dag te leveren.
   3. Bescherm de drinkfles tegen licht.
   4. Vervang drinkwater met NMN elke 24–48 uur.
   5. Monitor het waterverbruik met behulp van het flesgewicht.
   6. Bereken de geschatte NMN-inname met behulp van waterconsumptie en lichaamsgewicht.
   7. Ga 5 dagen door met supplementatie voordat je beeldvorming krijgt.
   8. Bereid NMN voor op 1 mg/mL voor orale gavage.
   9. Geef 200 μL per muis met een 20G, 38 mm ronde punt-gavagenaald.
   10. Voer beeldvorming uit 30–60 minuten na de gavage.
   11. Bereid NMN voor op 1 mg/mL voor intraveneuze toediening.
   12. Injecteer 100 μL per muis via de retro-orbitale veneuze sinus of staartven.
   13. Geef de injectie langzaam over 10–20 seconden.
   14. Begin onmiddellijk met beeldvorming of binnen 5 minuten na de injectie.
   15. Verkrijg drinkwaterdatasets na 5 dagen supplement.
   16. Verkrijg orale gavage-datasets op een vast tijdstip na gavage.
   17. Neem direct voor intraveneuze injectie een basislijn.
   18. Registreer acute reacties ongeveer 10–30 minuten na intraveneuze injectie.
5. Beeldverwerking en signaalextractie
   1. Voer bewegingscorrectie uit wanneer er bewegingsartefacten aanwezig zijn.
   2. Gebruik Fiji/ImageJ (versie 1.8.0 of later) met StackReg, TurboReg, of een gelijkwaardig rigid-body registratie-algoritme.
   3. Gebruik vasculaire herkenningspunten in het TMR–dextran-kanaal om registratie te sturen.
   4. Accepteer datasets alleen wanneer de restverplaatsing na correctie kleiner is dan ongeveer 1–2 pixels.
   5. Bevestig dat de grenzen van de vasculaire regio van belang (ROI) gedurende de overname stabiel blijven.
   6. Gebruik het TMR–dextran-kanaal om vatlumens te segmenteren.
   7. Definieer endotheel-ROI's direct naast het lumen.
   8. Selecteer microvaten met stabiele lumenlabeling, minimale beweging en zichtbaar sensorkanaalsignaal.
   9. Analyseer vatdiameters van ongeveer 5–80 μm.
   10. Definieer endotheel-ROI's als gebieden, die aan de vatwand zijn geassocieerd, ongeveer 2–5 μm breed.
   11. Analyseer 3–5 schepen per gezichtsveld wanneer beschikbaar.
   12. Analyseer 1–3 gezichtsvelden per muis wanneer beschikbaar.
   13. Definieer achtergrond-ROI's in weefselgebieden zonder tracer- en sensorsignaal.
   14. Plaats achtergrond-ROI's minstens 20 μm van de geanalyseerde vaten en beeldartefacten.
   15. Trek de gemiddelde achtergrondintensiteit af van elk kanaal vóór normalisatie.
   16. Pas dezelfde achtergrond-subtractiestrategie toe op alle samples.
   17. Haal tijdreeks-gemiddelde intensiteitswaarden uit voor F_sensor(t).
   18. Haal tijdreeksgemiddelde intensiteitswaarden uit voor F_ref(t).
   19. Voer metingen uit met NIS-Elements AR/AR-analyse of Fiji/ImageJ.
   20. Exporteer raw-afbeeldingsbestanden als ND2-bestanden.
   21. Exporteer analysekopieën als 16-bits TIFF-stacks wanneer mogelijk.
   22. Exporteer ROI-tijdreeksgegevens als CSV-bestanden.
   23. Bereken achtergrond-afgetrokken fluorescentiewaarden vóór normalisatie.
   24. Bereken ΔF/F₀ met behulp van ΔF/F₀ = (F(t) − F₀)/F₀.
   25. Definieer F₀ als het gemiddelde signaal tijdens de 120 seconden basisperiode.
   26. Bereken vasculaire referentienormalisatie als F_sensor(t)/F_ref(t).
   27. Rapporteer piekverandering, tijd tot piek, oppervlakte onder de curve en herstelkinetiek wanneer de verwervingsduur het toelaat.
   28. Interpreteer het 920 nm sensorkanaalsignaal niet als een gekalibreerde NAD⁺ -concentratie.
   29. Voer aanvullende ratiometrische kalibratie of biochemische validatie uit wanneer kwantitatieve NAD^+- metingen vereist zijn.
6. Statistieken en verslaggeving
   1. Definieer de muis als de biologische experimentele eenheid.
   2. Gemiddelde metingen op vatniveau binnen elke muis vóór groepsanalyse of toepassing van een genest statistisch model.
   3. Gebruik gepaarde tweezijdige t-tests voor normaal verdeelde vergelijkingen binnen de muis.
   4. Gebruik Wilcoxon matched-pairs teken-rank tests wanneer aan normaliteitsaannames niet wordt voldaan.
   5. Gebruik herhaalde metingen (ANOVA) of gemengde effecten modellen voor analyses met meer dan twee gerelateerde aandoeningen.
   6. Pas passende multiple-comparison correcties toe.
   7. Voer statistische analyses uit met GraphPad Prism of vergelijkbare software.
   8. Definieer statistische significantie als p < 0,05.
   9. Rapporteer de exacte statistische test in elke figuurlegende.
   10. Codeer afbeeldingsbestanden vóór ROI-selectie en kwantificatie waar mogelijk.
   11. Houd analistenblinding totdat ROI-metingen en kwaliteitscontrolebeslissingen zijn afgerond.
   12. Gebruik N = 3 muizen als de biologische experimentele eenheid in de representatieve dataset.
       OPMERKING: Pauzeer de beeldverwerving niet tijdens actieve time-lapse beeldvorming. Beeldverwerking en kwantitatieve analyse kunnen worden gepauzeerd na de export van ruwe gegevens. Sla ND2-bestanden, TIFF-analysebestanden, ROI-bestanden, metadata en CSV-meettabellen op in een back-up. Noteer laservermogen, detectorinstellingen, beeldvormingsdiepte, dieridentificatie, behandelingstoewijzing en uitsluitingsbeslissingen voor elke beeldvormingssessie.

Resultaten

Een succesvolle voorbereiding levert een transparant en mechanisch stabiel schedelvenster op dat geschikt is voor longitudinale beeldvorming. Figuur 1A vat de procedurele workflow samen van anesthesie en schedelblootstelling via craniotomie, plaatsing van de dekmantel, fixatie van de hoofdplaat en postoperatief herstel. Figuur 1B toont representatieve seriële foto's van de belangrijkste chirurgische stappen. Vensters die geschik...

Discussie

Dit protocol biedt een end-to-end workflow om het endotheliale NAD⁺ -metabolisme van de hersenen in vivo te monitoren. Belangrijke factoren voor succes zijn: (i) vensterhelderheid en stabiliteit, waaronder het minimaliseren van thermische schade en het beheersen van bloedingen tijdens het boren; (ii) endotheelspecificiteit en adequate sensorexpressie bereikt door passende selectie van het AAV-capside, promotor, dosis en expressieinterval; en (iii) consistente beeldvor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	VOORZICHTIG: Toxische/schadelijke chemische stof. Gebruikt om Avertin-anesthesieoplossing voor schedelvensterchirurgie te bereiden. Typische werkoplossing: 1,25% (12,5 mg/mL), intraperitoneaal toegediend bij 200–250 mg/kg.
2-Methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	VOORZICHTIG: Toxische/schadelijke chemische stof. Oplosmiddel gebruikt voor bereiding van geconcentreerde Avertin-basisoplossing. Beschermen tegen licht en preparaten met bezinking of verkleuring weggooien.
Absorbente watten	Winner Medical	Steriele medische watten	Gebruikt voor hemostase, schedeldrogen, irrigatie en onderhoud van het operatieveld.
AAV-X1.1-Cdh5-cytoplasmatische NAD+ biosensor-SV40 pA	Shanghai GeneChem Co., Ltd.; Addgene bronnen voor plasmiden	GeneChem construct GCPV5052075; Addgene #186787; Addgene #196836	Endotheliaal-gerichte NAD+ biosensor verpakt in AAV-X1.1. Expressiecassette: Cdh5-promotor–cytoplasmatische NAD+ biosensor–SV40 poly(A). Representatieve injectiedosis: 2 × 10¹² vg/muis. Bewaar aliquots bij −80 °C en vermijd herhaaldelijke vries-ontdooi-cycli. Noteer lotspecifiek qPCR-titer, batchnummer, plasmide kaart, sequentie-verificatie en certificaat van analyse.
Analgetisch middel (buprenorfinehydrochloride)	MCE	HY-B0071	Perioperatieve en postoperatieve pijnbestrijding. Representatieve dosis: 0,05–0,1 mg/kg subcutaan elke 8–12 uur gedurende 24–48 uur.
Anesthesie-toedieningssysteem	RWD Life Science	R500 met R580 verdamper	Gebruikt voor isofluraane-toediening tijdens beeldvorming. Typische zuurstofstroom: 0,5–1,0 L/min.
Anesthetisch middel (isofluraan)	RWD Life Science	R510-22 serie	Gebruikt voor beeldvormingsanesthesie. Typische instellingen: 3–4% inductie en 1–2% onderhoud.
Dekglas	Op maat gemaakt	Geen catalogusnummer	Steriele No. 1,5 glazen dekglas met grootte om een 3 × 3 mm schedelvenster volledig te bedekken en vlak op de schedelrand te zitten.
Tandartscement/kleefstof	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	Gebruikt voor het afdichten van schedelvensters en het bevestigen van titanium hoofdplaatjes. Representatieve voorbereiding: 1 schepje poeder, 1 druppel katalysator en 4 druppels monomeer. Ongeveer 5–10 min harden bij kamertemperatuur.
Tandartsboor	RWD Life Science	78001 microboor	Hogesnelheidsboor gebruikt voor schedelverdinning en craniotomie. Gebruik ongeveer de helft van de maximale snelheid met frequente zoutoplossingskoeling.
Desinfectieoplossing	Winner Medical	Povidon-jodium/iodofoor en 70% ethanol	Gebruikt voor hoofdhuidvoorbereiding vóór de operatie. Wisselende desinfectiemiddelen gedurende drie cycli toepassen.
Fijne pincetten	JZ Brand	JD1050/JD1070	Gebruikt voor het verwijderen van het periosteum, weefselmanipulatie en het optillen van botflaps.
Gavagenaald	RWD Life Science	20G, 38 mm, kogeltip	Gebruikt voor orale NMN-toediening.
Hoofdplaatje	Op maat gemaakt	Geen catalogusnummer	Titanium hoofdplaatje met een centrale opening van ongeveer 10 mm compatibel met de beeldvormingshouders.
Verwarmingskussen/homeothermische controller	RWD Life Science	69020 met 69023 kussen	Gebruikt om de lichaamstemperatuur tijdens operatie en beeldvorming op ongeveer 36,5–37,5 °C te houden.
Beeldverwervingssoftware	Nikon	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	Gebruikt voor microscoopbediening en beeldverwerving. Representatieve instellingen omvatten 512 × 512 of 1024 × 1024 pixels, 1–3 µm z-stap en 1 s time-lapse interval.
Beeldanalysesoftware	NIH	Fiji/ImageJ v1.8.0 of later	Gebruikt voor bewegingscorrectie, ROI-selectie, achtergrondafschrijving, intensiteitsextractie en CSV-export.
Intraveneuze injectiebenodigdheden	BD	329461	Steriele 1 mL insulinesyringe met 29G naald voor AAV-, TMR–dextran- en NMN-injecties.
NMN (nicotinamide mononucleotide)	Selleck Chemicals	S5259	NAD+-precursor gebruikt voor drinkwater-, orale-gavage- en intraveneuze toedieningsexperimenten.
Oftalmische zalf	Lokaal gecertificeerde apotheek	Niet van toepassing	Gebruikt om hoornvliesdroging tijdens anesthesie te voorkomen.
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)	Servicebio	G4202-100ML of G4202-500ML	Steriele 1× PBS gebruikt voor virale verdunning, tracer-voorbereiding, weefselspoeling en reagensvoorbereiding.
Ademhalingsbewakingssysteem	RWD Life Science	Geïntegreerd bewakingsmodule	Gebruikt voor het bewaken van ademhaling en anesthesiediepte tijdens operatie en beeldvorming.
Zoutoplossing (0,9% NaCl, steriele)	Servicebio	G4702-500ML	Gebruikt voor schedelkoeling, irrigatie, weefselbevochtiging en oplossingsvoorbereiding.
Stereotactische frame/hoofdhouter