Efficiënte identificatietechnieken voor 61 oliethee (Camellia oleifera abel) cultivars met behulp van de MCID-strategie en DNA-markers

Samenvatting

Deze studie gebruikte een handmatig cultivaridentificatiediagram (MCID) afgeleid van Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) bandpatronen om efficiënt en reproduceerbaar 61 Camellia oleifera Abel-cultivars te identificeren voor gebruik van germplasma-hulpbronnen en identificatie van olietheecultivars.

Samenvatting

Het is cruciaal om de germplasmamaterialen en cultivars van Camellia oleifera Abel [Oliethee (Ot)] te identificeren voor het evalueren van germplasmbronnen en het beoordelen van mechanismen ter bescherming van Ot-variëteiten. Deze studie maakte gebruik van een geoptimaliseerde RAPD-techniek door de lengte van de RAPD-primer te vergroten en de PCR-annealingtemperatuur te screenen, waarmee 61 Ot-cultivars uit verschillende regio's werden geïdentificeerd. Daarnaast werd een MCID ontwikkeld om efficiënte RAPD-markers te ontwerpen voor cultivaridentificatie. Uit 80 RAPD willekeurige 11-nt primers werden 10 primers geselecteerd die duidelijke polymorfe banden (PB's) produceerden voor PCR-analyse van de 61 cultivars. Bovendien werd de MCID-strategie gebruikt om handmatig 61 cultivars te onderscheiden op basis van de PB's die in DNA-vingerafdrukken werden waargenomen van de 10 primers, wat het Ot-cultivaridentificatiediagram (Ot-CID) genereerde. Deze Ot-CID gaf elk cultivar afzonderlijk aan, waarbij PB's werden gebruikt voor cultivaridentificatie, met de juiste primers nauwkeurig geplaatst op de Ot-CID. De MCID-strategie biedt een eenvoudige en praktische aanpak voor plantidentificatie met behulp van DNA-markers. Bovendien biedt deze aanpak een praktische en efficiënte methode voor cultivaridentificatie. De resulterende Ot-CID van 61 Ot-cultivars onderscheidde effectief Ot-varianten met behulp van RAPD-markers, waardoor de differentiatie van cultivars werd vergemakkelijkt voor bescherming van cultivarrechten en vroege zaailingidentificatie in de kwekerijindustrie.

Inleiding

Camellia oleifera Abel [Oliethee (Ot)] behoort tot de belangrijkste houtachtige eetbare olieboomsoorten ter wereld¹. China wordt beschouwd als het oorsprongs- en diversiteitscentrum voor Ot, met overvloedige germplasma-bronnen². De oude traditie van Ot, vegetatieve vermeerdering en diverse wereldwijde kweekprogramma's heeft geleid tot het ontstaan van talrijke cultivars³. De wijdverspreide wereldwijde teelt van de Ot-cultuur heeft geleid tot cultivars met homoniemen (verschillende cultivars met dezelfde naam) en synoniemen (cultivars met meer dan één naam)⁴. Daarom is het cruciaal om technieken te ontwikkelen voor het beheren van een breed scala aan Ot-germplasma en het nauwkeurig onderscheiden van verschillende cultivars ^3,5.

Ondanks de toepassing van DNA-gebaseerde moleculaire markers bij cultivarkarakterisering, genetisch onderzoek en Ot-identificatie, die genetische diversiteit kunnen verduidelijken en plantenindividuen kunnen onderscheiden, heeft geen enkele studie met succes een aanzienlijk aantal Ot-cultivars geïdentificeerd of een betrouwbare basis voor cultivardifferentiatie^geleverd 6,7,8,9 . Het gebrek aan betrouwbare methoden is de belangrijkste beperking voor de toepassing van DNA-markers bij de identificatie van plantengewassen. Dit kan komen doordat de analytische technieken die voor DNA-vingerafdrukken worden gebruikt, geen relevante informatie kunnen opleveren die duidelijk primers en polymorfe markers specificeert om de cultivars te onderscheiden die identificatie vereisen. De analytische technieken voor DNA-bandpatronen (clusteranalyses genoemd) zijn ongeschikt om cultivars of soorten effectief te onderscheiden.

Hoewel DNA-moleculaire identificatiekaarten (ID's) zijn ontwikkeld voor meer dan 200 Ot-cultivars met SNP-markers ^2,3,10,11, zijn er nog steeds verschillende uitdagingen: (1) Het Ot-genoom is complex, waarbij de meerderheid van de gekweekte camelia's hexaploid is, terwijl het referentiegenoom dat wordt gebruikt voor het construeren van de DNA-moleculaire ID's triploïde is, wat tot zekere onnauwkeurigheid kan leiden³. (2) Whole-genome sequencing is duur, vooral voor laboratoria met beperkte faciliteiten, waardoor de brede toepassing voor grootschalige variëteitsanalyses wordt verhinderd. Bovendien vereisen PCR-versterkingsproducten sequencing of fluorescentiedetectie, wat proces¹² verder bemoeilijkt. (3) Bij afwezigheid van onderscheidende markers voor nieuwe variëteiten is het noodzakelijk nieuwe markerprimers te ontwikkelen, wat ook de hercodering van ID-kaartcodes voor bestaande types vereist. Dit resulteert in een overweldigend aantal codeposities, wat de effectiviteit van variëteitsdifferentiatie vermindert. Daarom is het essentieel om technieken toe te passen die eenvoudige, betrouwbare, betrouwbare en praktische verificatie van Ot-cultivars biedt voor de Ot-kwekerijsector, landbouwbedrijven, plantpatentbescherming en het behoud en de beoordeling van genetische hulpbronnen⁵.

Traditionele strategieën voor cultivaridentificatie waren gebaseerd op morfologische, fysiologische en agronomische kenmerken, maar deze kenmerken kennen hun grenzen omdat ze gevoelig zijn voor omgevingsinvloeden en een uitgebreide evaluatie van volledig ontwikkelde planten vereisen^13,14. Bovendien hebben moleculaire markers het duidelijke voordeel dat ze niet worden beïnvloed door omgevingsvariabelen, waardoor ze een efficiënt hulpmiddel zijn voor de nauwkeurige karakterisering van cultivars^14,15. Onlangs zijn er verschillende DNA-gebaseerde indices vastgesteld voor het beoordelen van vingerafdrukken, genetische diversiteit, cultivar en zuiverheid 16,17,18,19,20,21,22. De RAPD-marker is voordelig voor cultivaranalyse vanwege zijn eenvoud, efficiëntie en het ontbreken van eerdere sequentiegegevens^23,24. De RAPD-benadering kan worden verbeterd door 11-nucleotide (nt) primers samen met hun gespecificeerde PCR-annealingtemperatuur te selecteren voor toepassing in plantenvingerafdrukken, waardoor RAPD een voorkeursmethode wordt voor plantenvariëteitidentificatie en evaluatie van genetische diversiteit^25,26. Deze markers zijn uitgebreid gebruikt in gewasdifferentiatie en genetische correlatiestudies van verschillende plantensoorten, waaronder abrikoos²⁷, sierperzik²⁸, granaatappel²⁹, landrassen²⁰ en walnoot³⁰ (Çilesiz et al., 2025). Ondanks hun wijdverspreide gebruik blijven veel DNA-marker-gebaseerde methoden onpraktisch of gestroomlijnd voor routinematige plantensoortidentificatie.

Daarom maakte deze studie gebruik van een nieuwe analytische techniek voor de reproduceerbare identificatie van verschillende Ot-cultivars. De MCID afgeleid van RAPD-bandpatronen onderscheidde 61 Ot-cultivars voor het gebruik van germplasm-hulpbronnen en cultivaridentificatie.

De hier beschreven RAPD-MCID-strategie (Figuur 1) is het meest geschikt voor karakterisering van germplasma op kleine tot middelgrote schaal in laboratoria met standaard PCR- en gelelektroforese-infrastructuur, maar beperkte toegang tot sequencingfaciliteiten. Het is ook goed geschikt voor snelle, kosteneffectieve voorlopige screening voordat er een meer gedetailleerde genetische analyse plaatsvindt. De belangrijkste operationele beperkingen van de methode zijn onder meer de afhankelijkheid van dominante markers en de noodzaak van zorgvuldige standaardisatie van PCR-condities om replicatie-mogelijkheden tussen laboratoriums te waarborgen. Voor grootschalige germplasmabanken of legale variëteitregistratie wordt het complementaire gebruik van co-dominante markers zoals SSR's of SNP's aanbevolen.

Protocol

1. Plantmateriaal

1. Verzamel jonge bladeren van gezonde, actief groeiende scheuten van elke olietheecultivar bij het National Camellia Germplasm Repository, Shucheng County, provincie Anhui.
2. Zie Tabel 1 voor de namen en herkomst van deze cultivars.

2. Genomische DNA-extractie

1. Extraheer het volledige genomische DNA met een plant-DNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
2. Het DNA werd geëlueerd met 1× TE-buffer. Controleer na elusie of de geëxtraheerde DNA-oplossing helder en kleurloos lijkt. Meet de DNA-concentratie met een microvolumespectrofotometer.
3. Pas de DNA-concentratie aan op 30 ng·^μL-1 met 1× TE-buffer en bewaar de aangepaste DNA-oplossing bij -20 °C.

3. RAPD-primerselectie

1. Ontwikkel 80 willekeurige primers voor RAPD-analyse en analyseer ze met behulp van een paar genotypen. Selecteer 11-nt RAPD-primers die duidelijke en ondubbelzinnige bandpatronen produceren over alle geteste genotypen.
2. Gebruik de geselecteerde primers voor genotypering om de geloofwaardigheid van de versterkte fragmenten te vergroten. Selecteer 10 goed opgeloste primers met reproduceerbare banden voor verdere analyse, zoals vermeld in Tabel 2.

4. Willekeurig versterkte polymorfe DNA (RAPD) PCR

1. Bereid de versterkingsreacties voor door de eerder beschreven methode²³ licht aan te passen. Bereid de reactieoplossingen voor volgens de samenstelling die in Tabel S1 is vermeld.
2. Voer PCR uit met een thermische cycler onder de volgende voorwaarden: pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 5 minuten; 42 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 30 seconden, uitgloeien van 1 minuut bij de geoptimaliseerde temperatuur zoals vermeld in Tabel 2, en verlenging bij 72 °C voor 2 minuten; en een laatste verlenging bij 72 °C voor 10 minuten.

5. Detectie en analyse van PCR-producten

1. Scheid de geamplificeerde DNA-fragmenten met gelelektroforese bij 100 V in 1,3% agarose (w/v) bereid in 1× TAE-buffer met 0,001 M EDTA en 0,04 M Tris-acetaat bij pH 8,0. Kleur de gels met ethidiumbromide bij 0,5 μg·^μL-1.
   VOORZICHTIG: Ethidiumbromide is een krachtig mutageen. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van ethidiumbromide-oplossingen of gekleurde gels.
2. Laat de gel 45–60 minuten op een constante spanning van 100 V draaien, of totdat het bromofenolblauwe kleurstoffront ongeveer tweederde van de gellengte is getransformeerd. Na het kleuren en ontkleuren observeer je de gel onder UV-transilluminatie.
   OPMERKING: Bevestig dat duidelijke DNA-banden duidelijk zichtbaar zijn onder UV-transilluminatie. Zorg ervoor dat de DNA-ladder scherpe, goed gescheiden banden vertoont variërend van 100 bp tot 2.000 bp.
3. Noteer de polymorfe banden (PB's) van de cultivars op basis van hun aanwezigheid of afwezigheid onder ultraviolet licht.
4. Voer elke PCR-versterking driemaal uit om reproduceerbaarheid te garanderen. Score alleen banden die consistent aanwezig of afwezig zijn in alle drie de onafhankelijke replica's voor downstream analyse. Bevestig dat de concordantieratio van bandscores tussen replicaten boven 95% uitkomt.

6. Data-analyse

1. Beoordeel de banden voor cultivaridentificatie op basis van hun aanwezigheid of afwezigheid door "+ o" toe te kennen aan duidelijk zichtbare banden en "−" aan afwezige banden op de overeenkomstige molecuulgrote positie over alle cultivars. Neem alleen banden op die consequent worden waargenomen over drie onafhankelijke replicaten.
2. Classificeer cultivars met duidelijke banden in de vingerafdruk die door één primer wordt geproduceerd, onafhankelijk. Classificeer cultivars met identieke bandpatronen in dezelfde subgroep. Differentieer alle olietheecultivars geleidelijk en volledig op basis van deze parameters.

7. Toepassing en efficiëntie van het diagram bij cultivaridentificatie

1. Selecteer willekeurig twee oliethee-cultivargroepen uit de intra- en inter-groepen om de toepasbaarheid en functionaliteit van het diagram met 61 oliethee-cultivars te verifiëren. Voer de selectie handmatig uit door te verwijzen naar verschillende takken van het Ot-CID-diagram, zonder gebruik te maken van software.
   OPMERKING: 2 Ot-cultivargroepen werden willekeurig geselecteerd om de toepasbaarheid en functionaliteit van het diagram met 61 Ot-cultivars te verifiëren.
2. Wijs de twee geselecteerde groepen aan als "A" en "B". Bekijk de relevante primers voor elke groep vanuit de Ot-CID.

8. Richtlijnen voor de verwijdering van gevaarlijk afval

1. Bereid alle ethidiumbromide-oplossingen voor en behandel deze in een aangewezen gebied. Verzamel al het met ethidiumbromide besmette vast afval en vloeibaar afval apart voor verwijdering volgens de institutionele richtlijnen voor gevaarlijk afval.
2. Verwijder alle met ethidiumbromide besmette materialen in aangewezen containers voor gevaarlijk afval. Neem contact op met het institutionele kantoor voor milieu, gezondheid en veiligheid voor goedgekeurde verwijderingsprocedures als u onzeker is.

Resultaten

De hier gepresenteerde representatieve resultaten illustreren de volledige workflow van de RAPD-MCID-strategie, van de eerste primerscreening via hiërarchische cultivardiscriminatie tot de uiteindelijke validatie. Het proces van stapsgewijze discriminatie is gedocumenteerd in Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4, Figuur...

Discussie

DNA-markers zijn krachtige hulpmiddelen die worden gebruikt om plantenrassen en soort²⁴ te identificeren. Deze markers zijn ontwikkeld en gebruikt in duizenden studies over genetische analyse, cultivaridentificatie, enzovoort; ze zijn echter noch gemakkelijk noch breed gebruikt bij het genotyperen^{van 24,31}. Dit komt door het gebrek aan efficiënte en eenvoudige methoden die DNA-markers gebruiken vo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Centrifuge	Eppendorf,Duitsland	5427R	Gebruikt voor genomische DNA-extractie uit olie-theeblaadjes
Hi-DNAsecure Plant Kit	Tiangen, China	DP350	Gebruikt voor genomische DNA-extractie uit olie-theeblaadjes
PCR-genamplificatie-instrument	Monad, China	MP60901	Gebruikt voor PCR-amplificatie
SolarRed Agarose LE	Solarbio, China	A8202	Gebruikt voor PCR-fragmentelektroforese
TAE	Tsingke, China	TSG001	Gebruikt voor PCR-fragmentelektroforese
TaKaRa Ex Taq	Takara, Japan	RR001A	Gebruikt voor PCR-amplificatie
Thermo Scientific NanoDrop 2000C spectrofotometer	ABI,USA		Gebruikt om RNA-concentratie te bepalen