Isolatie en validatie van Podoplanine-positieve mesenchymale stamcelsubpopulaties met behulp van een indirecte magnetische kraalstrategie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een magnetische kralen-gebaseerde sorteermethode waarbij fycoerythrine (PE)-gelabelde flowcytometrie-antilichamen en anti-PE-microkorrels worden gebruikt om specifieke mesenchymale stamcelsubpopulaties met hoge postsort-doelmarkerpositiviteit en geconserveerde CCK-8-gebaseerde proliferatie/metabole activiteit onder de geteste omstandigheden te isoleren, zonder dure celsorteerders of doelspecifieke op maat gemaakte kralen te vereisen.

Samenvatting

De studie van functionele heterogeniteit in mesenchymale stamcellen is afhankelijk van de efficiënte isolatie van specifieke subpopulaties (bijv. podoplanine (PDPN)-positieve cellen). Voor de meeste membraaneiwitdoelen zijn direct beschikbare commerciële magnetische korrels voor sortering echter beperkt. Om dit aan te pakken heeft ons laboratorium een gestandaardiseerd magnetisch korrelsorteringsprotocol opgezet en getest, gebaseerd op het indirecte koppelingsprincipe van "phycoerythrine (PE)-gelabelde flowcytometrie-antilichamen/anti-PE magnetische kralen." Met PDPN-positieve cellen als modeldoelpopulatie verrijkt dit protocol een fractie van de doelcellen zonder te vertrouwen op dure flowcytometrische celsorters.

Onderzoekers kunnen compatibele PE-gelabelde flowcytometrie-antilichamen gebruiken die zich richten op toegankelijke celoppervlak-eiwitten en deze combineren met commercieel verkrijgbare anti-PE-microkorrels om een sorteerworkflow op te zetten voor geselecteerde doelen na doelspecifieke optimalisatie. Deze aanpak voorkomt de lange levertijden en hoge kosten die gepaard gaan met het aanpassen of bestellen van doelspecifieke magnetische kralen voor elk nieuw doel, waardoor het bijzonder geschikt is voor toegankelijke oppervlaktemarkers die zeldzaam of onderbelicht zijn. In het hier geteste PDPN-modelsysteem maakte het protocol verrijking mogelijk van de doelsubpopulatie met een hoge postsorteer-PDPN-positiviteit en behield CCK-8-gebaseerde proliferatie/metabole activiteit in vergelijking met ongesorteerde MSC's.

Inleiding

In de orthopedie leiden verwondingen zoals kraakbeenschade en laesies in de avasculaire zone (witte zone) van de meniscus vaak tot onomkeerbare gewrichtsbeschadiging en functieverlies, wat uiteindelijk leidt tot artrose. Dit is grotendeels toe te schrijven aan het slechte regeneratieve vermogen van deze weefsels, dat voortkomt uit een gebrek aan directe bloed- en lymfetoevoer, evenals de aanwezigheid van sterk gedifferentieerde cellen met beperkte capaciteit voor proliferatie en migratie 1,2,3,4. Om deze uitdaging aan te pakken, zijn verschillende klinische strategieën onderzocht, waaronder het gebruik van exosomen ^5,6, autologe of allogene chondrocyttransplantatie ^7,8, en weefselengineeringbenaderingen 9,10,11,12. In de afgelopen jaren zijn mesenchymale stamcellen (MSC's) naar voren gekomen als veelbelovende celbron voor regeneratieve reparatie, dankzij hun multilineage differentiatiepotentieel en immunomodulerende eigenschappen, wat nieuwe hoop biedt voor kraakbeenregeneratie 13,14,15,16.

Ondanks hun therapeutisch potentieel vertonen MSC's aanzienlijke heterogeniteit. Zelfs binnen één enkele weefselbron, zoals beenmerg of navelstreng, kunnen verschillende subpopulaties van MSC's aanzienlijke variabiliteit vertonen in proliferatiecapaciteit, multilineagedifferentiëringspotentieel (vooral chondrogene differentiatie) en regeneratieve functie in vivo 17,18,19. Daarom is de precieze identificatie en isolatie van functioneel gedefinieerde MSC-subpopulaties—zoals die met een verhoogde chondrogene capaciteit—essentieel om ons begrip van hun biologische eigenschappen te vergroten en de effectiviteit van kraakbeenherstel te verbeteren. Dit is een cruciale stap in ons onderzoek.

Naarmate het onderzoek vordert, zijn steeds meer nieuwe membraaneiwitten geïdentificeerd als markers van functioneel verschillende MSC-subpopulaties. Het vertalen van deze ontdekkingen naar effectieve celsorteerstrategieën blijft echter technisch uitdagend. Conventionele fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), hoewel krachtig, vereist gespecialiseerde instrumentatie en technische expertise, waardoor de toegankelijkheid in veel laboratoria beperkt wordt. Aan de andere kant wordt immunomagnetische celsortering—hoewel vaker gebruikt—beperkt door de beperkte beschikbaarheid van commerciële reagentia, die voornamelijk zijn ontworpen voor enkele goed gevestigde membraandoelen. Bijgevolg zijn er voor veel nieuw ontdekte markers met potentiële biologische betekenis geen commercieel verkrijgbare magnetische kralen, wat het moeilijk maakt om deze waardevolle MSC-subpopulaties specifiek te verrijken.

Om deze beperking te overwinnen, streeft deze studie ernaar een flexibel, kosteneffectief en efficiënt protocol voor positieve celselectie vast te stellen en te standaardiseren. Deze benadering is gebaseerd op de indirecte conjugatie van commercieel verkrijgbare phycoerythrine (PE)-geconjugeerde antilichamen met anti-PE immunomagnetische kralen. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat podoplanine-positieve (PDPN⁺) MSC's een superieure stam-onderhouds- en differentiatiecapaciteit hebben vergeleken met hun PDPN-tegenhangers²⁰. Bovendien is de betrokkenheid van ^PDPN+ MSC's bij kraakbeenregeneratie en de progressie van artrose (OA) gedocumenteerd in de literatuur^21,22. Met podoplanine (PDPN)—een recent geïdentificeerde kandidaatmarker van functionele MSC-subpopulaties—als modeldoel, sorteerden we PDPN-positieve cellen uit beenmerg-afgeleide MSC's. Wij bieden een gedetailleerd stapsgewijs protocol over de voorbereiding van single-cell suspensie, het labelen van antilichamen en magnetische korrels, en de magnetische scheiding. Daarnaast evalueren we de opbrengst, postsorteer-PDPN-positiviteit en CCK-8-gebaseerde proliferatie/metabole activiteit van de gesorteerde cellen. Door dit protocol te standaardiseren, streven we ernaar onderzoekers een veelzijdige, toegankelijke methode te bieden om doelcelsubpopulaties te isoleren met compatibele antilichamen tegen toegankelijke celoppervlakmarkers, waardoor fundamenteel stamcelonderzoek en toekomstige translationele toepassingen in de regeneratieve geneeskunde worden vergemakkelijkt.

Protocol

MSC's afkomstig van menselijke beenmerg werden commercieel verkregen (zie de Materiaaltabel). De leverancier bevestigde de MSC-identiteit door positieve expressie van CD73, CD90 en CD105; negatieve expressie van CD34, CD45 en HLA-DR; en het differentiëringspotentieel van trilineage. Cellen werden in cultuur uitgebreid en gebruikt bij passages 3–5. Al het werk aan menselijke cellen werd uitgevoerd in een klasse II biologische veiligheidskast onder steriele omstandigheden. Omdat de cellen commercieel waren verkregen en er geen menselijke proefpersonen direct werden gerekruteerd of bemonsterd in dit protocol, was geen directe IRB-goedkeuring vereist.

1. Bereiding van enkelcelige suspensie

OPMERKING: De kwaliteit van de single-cell suspension beïnvloedt direct de sorteerefficiëntie. Zorg ervoor dat cellen goed verspreid zijn, zeer levensvatbaar en vrij van klonten. Zichtbare klonten moeten worden verspreid door herhaaldelijk zacht pipetteren totdat de klonten niet meer zichtbaar zijn.

1. Selecteer MSC's (passages 3–5) die 80–90% confluentie hebben bereikt. Laat het cultuurmedium varen.
2. Was de cellen met 2 × 10 ml vooropgewarmde PBS. Wieg het vat voorzichtig en gooi de PBS weg.
3. Voeg 2 ml 0,25% trypsine-EDTA toe en incubeer bij 37 °C gedurende 3–5 minuten. Bekijk de cellen onder een microscoop totdat ze zich afronden en beginnen los te laten.
4. Voeg 4 ml kweekmedium toe met 16,5% FBS (zie de Materiaaltabel) om het trypsine te neutraliseren. Pipette de cellen voorzichtig om volledige loslating te garanderen. Breng de celsuspensie over naar een 15 mL centrifugebuis.
   OPMERKING: Controleer onder de microscoop om te bevestigen dat alle cellen zijn verzameld.
5. Centrifugeer op 300 × g gedurende 3 minuten en gooi het supernatant weg.
6. Sussief de celpellet opnieuw in 1 mL buffer (zie de Tabel van Materiaal). Ga door met celtellen.

2. Celtelling en concentratieaanpassing

OPMERKING: Als het totale celaantal kleiner is dan 1 × 10⁷, voeg dan alsnog de antilichamen en magnetische reagentia toe op basis van het standaardvolume voor 1 × 107^cellen om de labelefficiëntie te waarborgen.

1. Centrifugeer de celsuspensie opnieuw op 300 × g gedurende 3 minuten en gooi het supernatant weg.
2. Stil de cellen in Buffer opnieuw om een dichtheid van 1 × 10^{à 8} cellen/mL te bereiken.
   OPMERKING: Om bijvoorbeeld 1 × 10^{7 cellen} te verwerken, suspendeer je de pellet opnieuw in 100 μL buffer.
3. Breng de celsuspensie over in een 5 mL polystyreen buis met een ronde bodem.

3. Antistoflabeling

1. Voeg 10 μL Fc gamma RII-blokker toe (zie de Materiaaltabel) per 1 × 10^{7 cellen} . Meng voorzichtig en laat het 10 minuten op kamertemperatuur incuberen.
2. Voeg 5 μL PE-geconjugeerd anti-menselijk PDPN-antilichaam toe (zie de Materiaaltabel) per 1 × 10^{7 cellen} , volgens de aanbevolen concentratie van de fabrikant. Meng voorzichtig en laat ze 15–20 minuten op kamertemperatuur incuberen, beschermd tegen licht.
   OPMERKING: Het antilichaamvolume moet worden aangepast volgens het datasheet van het specifieke flowcytometrie-antilichaam dat wordt gebruikt, aangezien de concentraties per product kunnen variëren.

4. Magnetische kralenetikettering

OPMERKING: Houd alle reagentia op ijs voor gebruik en zet ze direct na elke toevoeging terug in het ijs om activiteit en consistentie te behouden.

1. Voeg 10 μL Selection Cocktail toe per 1 × 10^{7 cellen} (zie de Tabel van Materialen). Meng voorzichtig en laat het 15 minuten op kamertemperatuur incuberen.
2. Voeg 5 μL magnetische kralen toe per 1 × 10^{7 cellen} (zie de Materiaaltabel). Meng voorzichtig en laat het 10 minuten op kamertemperatuur incuberen.
   OPMERKING: Vortex de magnetische kralen 30 seconden lang voor gebruik om een gelijkmatige verspreiding te garanderen.

5. Magnetische scheiding

1. Plaats een 5 mL polystyreen buis met een ronde bodem met het gelabelde celmonster in de magnetische scheidingsstandaard (zie de Tabel van Materiaal).
2. Voeg buffer toe aan de buis om het totale volume op 2,5–3 mL te brengen. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur.
3. Voer de scheiding uit: Houd de magneet en buis samen als één eenheid, keer ze om om het supernatant in een nieuwe verzamelbuis te gieten. Deze verzamelde fractie bevat de PDPN-negatieve cellen; Houd deze buis op ijs.
   OPMERKING: Verwijder de buis tijdens deze stap niet van de magnetische standaard, omdat dit de scheiding verstoort en de procedure kan laten mislukken.
4. Herhaal stappen 5.1–5.3 3 keer per gang. Voeg elke keer buffer toe aan de originele buis in de magneet, wacht 5 minuten en giet het supernatant in dezelfde negatieve fractie verzamelbuis als in stap 5.4.
5. Na de laatste wasbeurt verwijder je de buis met de magnetisch gebonden cellen van de standaard. Deze buis bevat de PDPN-positieve celfractie.
6. Voeg 3 mL buffer toe om de positieve cellen opnieuw te laten ophangen. Breng deze suspensie over in een verse, gelabelde buis (de positieve fractiebuis).

6. Verzameling, kweek en validatie van doelcellen

1. Tel de cellen uit zowel de positieve als negatieve fractiebuisjes. Noteer de celopbrengst voor elke fractie.
2. Centrifugeer de positieve fractiecelsuspensatie op 300 × g gedurende 3 minuten. Gooi het supernatant weg.
3. Sussion de celpellet opnieuw in MEM Alpha cultuurmedium met 16,5% FBS. Pas de celdichtheid aan indien nodig en zaai de cellen in kweekplaten of kolven.
4. Incubeer de cellen bij 37 °C in een incubator met 5% CO₂.

7. Monstervoorbereiding voor zuiverheid en functionele validatie

1. Tel de cellen en zaai ze op een 100 mm kweekschaal met een dichtheid van 3 × 10 à⁶ cellen per schaal in 12 mL kweekmedium. Vierentwintig uur na het zaaien observeer celhechting. Vervang het kweekmedium door een nieuw medium om eventuele resterende magnetische pareltjes en niet-hechtende cellen te verwijderen.
2. Oogst de cellen door trypsinisatie. Pipetteer voorzichtig 10–15 keer omhoog en omlaag om magnetische kralen en resterende antilichamen los te maken en te verwijderen.
3. Beoordeel het percentage PDPN-PE-positieve cellen met flowcytometrie (zie Supplemental File 1 voor het gedetailleerde protocol).
4. Verzamel cellen tijdens de logaritmische groeifase. Zaai ze in een bord met 96 putten. Voeg op verschillende tijdstippen (0 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur) CCK-8 reagens toe (zie de Materiaaltabel) en meet de absorptie volgens de instructies van de fabrikant. Plot een proliferatiecurve op basis van de gegevens.

Resultaten

Het algemene principe en de workflow van het experiment worden geïllustreerd in Figuur 1. Alle daaropvolgende experimentele gegevens zijn gebaseerd op passage 5-cellen. Na magnetische scheiding werden de verkregen PDPN^+-cellen 24–48 uur gekweekt. Na het vervangen van het kweekmedium om niet-hechtende cellen en potentiële resterende magnetische kralen te verwijderen (Figuur 2A), evalueerden we de sorteerefficiëntie en ...

Discussie

In deze studie hebben we een op magnetische kralen gebaseerd protocol opgesteld om PDPN+-cellen te isoleren uit beenmerg-afgeleide MSC's. Deze aanpak maakt efficiënte verrijking van de PDPN-positieve subpopulatie mogelijk, terwijl CCK-8-gebaseerde proliferatie/metabole activiteit onder de geteste omstandigheden behouden blijft.

In vergelijking met conventionele directe immunomagnetische sorteermethoden ligt het grootste voordeel van deze strategie in de veelzi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
7-AAD Cell Viability Assay Kit	KeyGEN	KGD1202-50
Anti-human CD32 Blocker (Fc gamma RII Blocker)	STEMCELL Technologies	18520
Buffer	STEMCELL Technologies	20104	Buffer
CCK-8	Meilunbio	MA0218-5
Dextran Magnetic Particles	STEMCELL Technologies	50100	Magnetic Particles
Fetal Bovine Serum	Gibco	16050-122
Magnet	STEMCELL Technologies	18000	magnetic separation stand
MEM Alpha Medium	Gibco	C12571500BT	MEM Alpha Medium (82,5%) + FBS (16,5%) + Penicillin-Streptomycin (1,0%)
MSCs	KeyGEN	KGG5575-1	Human bone marrow-derived mesenchymale stamcellen
PE-conjugated Anti-Human PDPN Antibody	ABclonal	A26770	PDPN-PE
PE Selection Cocktail	STEMCELL Technologies	18151	Selection Cocktail
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072