Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Samenvatting

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde in vitro. workflow voor consistente meting van natuurlijke, chimere antigeenreceptor-gemedieerde en antistofafhankelijke cytotoxiciteit van menselijke natuurlijke moordenaars met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie.

Samenvatting

Natuurlijke killercellen (NK) zijn aangeboren lymfocyten die een cruciale rol spelen in beschermende immuniteit tegen diverse intracellulaire pathogenen en kankers. Hun primaire functie is het doden van doelcellen die geïnfecteerd, kwaadaardig getransformeerd zijn of bedekt zijn met antilichamen via antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC). NK-cellen kunnen ook genetisch worden gemodificeerd om chimerische antigeenreceptoren (CAR's) tot expressie te brengen die gerichte herkenning van specifieke antigenen mogelijk maken. Kwantitatieve meting van NK-cel cytotoxiciteit is essentieel voor het beoordelen van de basisfunctionaliteit en voor preklinische evaluatie van monoklonale antilichamen en CAR-engineeringstrategieën. Functionele tests in vitro blijven echter sterk variabel tussen laboratoria vanwege verschillen in celvoorbereiding, doelcellen, effector-doelverhoudingen, co-incubatietijden en uitleesmethoden, wat de reproduceerbaarheid en kruisvergelijkingen beperkt. Dit artikel presenteert een gestandaardiseerd protocol voor kwantitatieve beoordeling van NK-cel cytotoxiciteit met behulp van flowcytometrie en real-time live-cel beeldvorming. Primaire menselijke NK-cellen en NK-92-cellen die CAR expressief maken, werden geëvalueerd op hun vermogen om kankercellen en antilichaam-gecoate doelcellen te doden in een 96-well plaatformaat om natuurlijke cytotoxiciteit, CAR-gemedieerde doding en ADCC te meten. De overleving van doelcellen werd gemeten, ofwel continu met behulp van live-celbeeldvorming, hetzij op een bepaald tijdstip door flowcytometrie, wat ook fenotypische karakterisering van NK-cellen en doelcellen mogelijk maakte. Deze protocollen bieden een robuust kader met behulp van routinematige weefselkweek, beeldvorming en flowcytometriemethoden om reproduceerbare kwantificering van de functies van NK-cel-effectoren mogelijk te maken voor studies naar aangeboren immuniteit en op NK-cellen gebaseerde immunotherapieën.

Inleiding

Natuurlijke killercellen (NK) zijn aangeboren lymfocyten die een centrale rol spelen in immuunsurveillance tegen viraal geïnfecteerde en kwaadaardige cellen, en vertonen snelle en krachtige cytotoxiciteit¹. In tegenstelling tot B- en T-cellen expresseren NK-cellen geen antigeenspecifieke receptoren en vertrouwen ze in plaats daarvan op een reeks activerende en remmende receptoren om verlies van de grote histocompatibiliteitscomplex-klasse I-expressie of cellulaire stress te detecteren. Dit stelt hen in staat directe cytotoxiciteit te mediëren door cytotoxische korrels met perforine en granzymen vrij te geven of, in sommige gevallen, door doodsreceptoren 1,2,3,4 te activeren. Naast natuurlijke cytotoxiciteit expresseren NK-cellen FcγRIII (CD16), een receptor die het Fc-gedeelte van immunoglobuline G (IgG) herkent en antistofafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) bemiddelt tegen IgG-gecoate doelcellen ^5,6.

Vanwege hun intrinsieke cytotoxische mechanismen en gunstige veiligheidsprofiel zijn NK-cellen naar voren gekomen als veelbelovende kandidaten voor cellulaire immunotherapie. Met het potentieel voor allogene toepassingen kunnen NK-cellen functioneren als een "kant-en-klaar" therapie met minimaal risico op graft-versus-host ziekte, wat een bredere klinische toepassing en lagere kosten mogelijk maakt⁷. Recente ontwikkelingen hebben het therapeutische potentieel van NK-cellen verder uitgebreid door middel van genetische engineeringstrategieën, waaronder de introductie van chimerische antigeenreceptoren (CAR's) die NK-cellen omleiden om specifieke tumorantigenen te herkennen. CAR-NK-cellen hebben antitumoreffectiviteit aangetoond in in vivo xenograftmodellen en klinische studies, met verminderde toxiciteit vergeleken met CAR-T-cellen ^8,9,10. Daarom is er groeiende interesse in het ontwikkelen van gemodificeerde NK-celplatforms en antilichaam-gebaseerde therapeutische strategieën. In deze context is nauwkeurige en kwantitatieve meting van de dodelijke capaciteit van NK-cellen essentieel voor het begrijpen van de biologie van NK-cellen, het beoordelen van de effectiviteit van CAR of andere gemodificeerde NK-celtherapieën, en het evalueren van monoklonale antilichamen die afhankelijk zijn van ADCC.

Verschillende in vitro assays zijn breed gebruikt in laboratoria om NK-cel cytotoxiciteit te evalueren. Veelvoorkomende methoden zijn radioactieve chroom-51 release assays, lactaatdehydrogenase release assays en calcein–acetoxymethyl release assays^11,12. Hoewel deze traditionele methoden veel zijn gebruikt om cytotoxiciteit te meten, zijn ze afhankelijk van indirecte uitlezingen van celdood, leveren ze eindpuntmetingen in plaats van kinetische gegevens, en bieden ze beperkte gevoeligheid en dynamisch bereik. Ze geven ook geen informatie over het fenotype of de activatietoestand van effectorcellen. Meer recentelijk zijn live-cel beeldvormingsplatforms en flowcytometrie steeds vaker toegepast omdat ze directe kwantificatie van de overleving van doelcels, monitoring van doodsgedrag in de tijd en gelijktijdige fenotypische analyse van effector- en doelcellen^{mogelijk maken 13,14}. Echter, zelfs binnen deze nieuwere benaderingen bestaat er aanzienlijke variabiliteit tussen laboratoria en gepubliceerde studies, waaronder verschillen in doelcel-voorbereiding, effector-tot-doel (E:T) verhoudingen en co-incubatietijden, wat reproduceerbaarheid en kruisvergelijkingen beperkt, vooral in preklinische evaluaties van NK-celgebaseerde immunotherapieën.

Dit artikel presenteert een gestandaardiseerde workflow voor kwantitatieve beoordeling van NK-celcytotoxiciteit met behulp van twee onafhankelijke, complementaire platforms: real-time live-celbeeldvorming (IncuCyte SX5) en op flow cytometrie gebaseerde eindpuntassays. Live-cell imaging maakt continue monitoring van de overleving van doelcellen mogelijk tijdens co-kweek met effectorcellen, waardoor kinetische evaluatie van cytotoxiciteit over meerdere E:T-verhoudingen en experimentele omstandigheden mogelijk is met minimale assaymanipulatie¹⁵. Daarentegen biedt flowcytometrie een zeer gevoelige eindpuntmeting van doelcelsterfte, samen met gelijktijdige fenotypische karakterisering van NK-cellen en doelcellen met behulp van een multimarkerkleuringspaneel.

Daarnaast bevat dit protocol gestandaardiseerde experimentele parameters, waaronder E:T-verhoudingen, incubatiecondities, plaatformaat en analytische workflows, om de reproduceerbaarheid te verbeteren en de vergelijking van cytotoxiciteitsmetingen tussen laboratoria en studies te vergemakkelijken. De workflow maakt kwantitatieve beoordeling mogelijk van meerdere NK-effectorfuncties, waaronder natuurlijke cytotoxiciteit, CAR-gemedieerde doding en ADCC, en is compatibel met primaire menselijke NK-cellen en NK-cellijnen. Dit protocol biedt een praktisch kader voor studies naar de NK-celbiologie en preklinische evaluatie van de ontwikkeling van NK-celgebaseerde immunotherapieën.

Protocol

Het gebruik van de menselijke donormonsters voor onderzoek werd goedgekeurd door de Institutional Review Board en uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen (Approval #2022P000699).

1. Realtime live-cell imaging doodstest

1. Mantelplaten
   1. Voeg 50 μL/put poly-D-lysine (0,1 mg/mL in fosfaatgeborduurde zoutoplossing [PBS]) toe aan een 6 × 10 rooster in een platbodemplaat met 96 putten. Schud de plaat voorzichtig om te zorgen dat de bodem van elke put volledig bedekt is.
   2. Incubeer de plaat 2 uur op kamertemperatuur (RT; 18°C–26°C) met het deksel erop.
   3. Was putten 3× met 200 μL/put PBS en gooi het supernatant weg.
      OPMERKING: Gecoate platen kunnen worden afgesloten met parafilm en tot 1 week bij 4°C worden opgeslagen, waarbij 200 μL PBS aan elke put wordt toegevoegd. Zorg dat platen steriel blijven, gooi PBS weg en laat ze in evenwicht zijn tot RT voordat je ze gebruikt.
2. Bereid doelcellen voor
   1. Bereid 10 mL 2× SYTOX Orange (200 nM) voor door SYTOX Orange stock oplossing (250 μM in DMSO) te verdunnen in NK-92 kweekmedium (voeg 8 μL voorraad toe aan 10 mL totaal volume) in een 15 mL conische bodem centrifugebuis.
      OPMERKING: Het kweekmedium voor NK-92-cellen bestaat uit Advanced RPMI-1640 medium, 10% foetaal rundereserum (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 100 μg/mL primocine en 500 U/mL humaan IL-2.
      VOORZICHTIG: SYTOX Orange is een fluorescerende kleurstof en kan risico's opleveren bij blootstelling aan huid of ogen. Behandel met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en volgens de veiligheidsrichtlijnen van de instelling.
   2. Tel doelcellen met behulp van een op kleurstof gebaseerde celtelmethode (bijv. trypan blauw) of een gelijkwaardige gevalideerde methode (bijv. geautomatiseerde celteller).
      OPMERKING: In deze test waren de doelcellen Ramoscellen, een B-cel rijpingsantigeen-expressief (BCMA⁺) B-cel lymfoomcellijn, die we hebben ontwikkeld om het nabij-infrarood (NIR) fluorescerende eiwit emiRFP670 tot expressie te brengen.
   3. Breng de benodigde hoeveelheid over in een 15-mL centrifugebuis met een conische bodem.
   4. Centrifuge (5 min, 300 × g, RT, acceleratie = maximum; vertraging [rem] = maximaal).
   5. Gooi het supernatant weg.
   6. Resuspendeer doelcellen tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 × 10⁵ cellen/mL (2,5 × 10⁴ cellen/100 μL) in 2× SYTOX Orange media.
      OPMERKING: Hersuspendeerde doelcellen kunnen tot 30 minuten op 37°C worden gehouden met 5% CO₂ in de buis tijdens het voorbereiden van effectorcelverdunningen.
      OPMERKING: Voor één volledige plaat × 60 putten 2,5 × 10⁴ cellen per put = 1,5 × 10^{6 totale} doelcellen. Bereid 2.0 × 10^{6 cellen} voor om het verlies te compenseren. Pas celnummers aan op basis van assaygrootte en gewenste zaaidichtheid.
3. Bereid effectorcellen voor
   1. Beoordeel de concentratie en levensvatbaarheid van NK-92-cellen met behulp van een op kleurstofuitsluiting gebaseerde celtelmethode (bijv. trypanblauw) of een gelijkwaardige gevalideerde methode. Ga alleen door als de levensvatbaarheid ≥80% is, omdat een lagere levensvatbaarheid de assayprestaties kan beïnvloeden.
      OPMERKING: NK-92-cellen die zijn ontworpen om het fluorescerende eiwit ZsGreen stabiel tot expressie te brengen, hetzij alleen (controle) of met BCMA-gerichte CAR-constructen, werden gebruikt als effectorcellen.
   2. Tel en breng het vereiste aantal cellen over in individuele 15-mL conische centrifugebuizen.
      OPMERKING: Bereken het totale aantal benodigde effectorcellen door het aantal benodigde cellen op te tellen over alle E:T-verhoudingen voor één replicat, te vermenigvuldigen met het aantal replicates, en 50% overschot toe te voegen om celverlies te compenseren. Ronde nummers indien nodig om de voorbereiding te vergemakkelijken. Bijvoorbeeld, voor E:T-verhoudingen variërend van 2:1 tot 0,25:1, gebruik 1,5 × 10⁵ NK-cellen per replicate. Voor driedubbele exemplaren bereid je 4,5 × 10^{cellen per} conditie voor op basis van de plaatindeling beschreven in Aanvullende Figuur 1A.
   3. Centrifugecellen (5 min, 300 × g, RT, acceleratie = maximum; vertraging [rem] = maximaal).
   4. Gooi het supernatant weg.
   5. Sussen cellen opnieuw tot een eindconcentratie van 5,0 × 10⁵ cellen/mL (5,0 × 10⁴ cellen/100 μL).
4. Bereid effectorcelverdunningen voor
   1. Bereid effectorcelverdunningen voor, inclusief een doel-only controle, in een ronde bodemplaat met 96 putten (zie aanvullende figuur 1A voor een representatieve plaatindeling met vier voorwaarden in drievoudige versies). Elke voorwaarde wordt in drievoud voorbereid.
   2. Voeg 240 μL/put van effectorcellen (5,0 × 10⁵ cellen/mL) toe aan putten die overeenkomen met een E:T-verhouding van 2:1.
   3. Voeg 120 μL/put aan media toe aan alle overgebleven putten.
   4. Voer 2-voudige seriële verdunningen uit van E:T = 2:1 putten tot en met E:T = 0,25:1 putten. Meng grondig door ≥5 keer te pipetteren en tips te wisselen tussen de overdrachten.
      OPMERKING: Als er geen beeldvormingsoperaties zijn ingepland op het beeldvormingssysteem, plan deze dan voordat je de co-kweek opzet. Voorbereide effectorcelverdunning kan tot 30 minuten worden gehandhaafd bij 37°C met 5% CO₂ in een ronde bodemplaat met 96 putten tijdens het opzetten van het live-cel beeldvormingssysteem.
5. Co-cultuur opzetten
   1. Verkrijg de poly-D-lysine gecoate platbodemplaat met 96 putjes.
   2. Voeg 100 μL/put van doelcel-suspensie toe aan alle putten. Onmiddellijk voor het dispenseren opnieuw opsuspensieer van doelcellen door ≥5 keer op en neer te pipetteren met een geschikte pipet (bijv. 200 μL) en voorkom bubbelvorming tijdens de overdracht.
   3. Voeg 100 μL/put effectorcel-suspensie toe aan de overeenkomstige wellen. Repussion de effectorcellen grondig direct voor het afgeven door ≥5 keer op en neer te pipetteren met een geschikte pipet (bijv. 200 μL) en voorkom bubbelvorming tijdens de overdracht.
   4. Voeg 200 μL/put PBS toe aan de omliggende ongebruikte putten.
   5. Centrifugeer de plaat (2 min, 100 × g, RT, acceleratie = laag [bijv. 2]; vertraging [rem] = laag [bijv. 2]).
      OPMERKING: Deze zachte spin is cruciaal om cellen snel en gelijkmatig over de bodem van de put te laten zakken voor nauwkeurige beeldvorming op de IncuCyte SX5. We gebruiken een Eppendorf Centrifuge 5810R compatibele benchtop rotor met de versnellings- en vertragingsinstellingen op 2 (van de 9).
   6. Plaats de plaat in het live-cell imaging systeem en maak elke 1 uur beelden gedurende 24 uur (uitbreidbaar tot 72 uur indien nodig). Zorg ervoor dat beeldvorming wordt uitgevoerd onder standaard incubatieomstandigheden (37°C/5% CO₂).
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat beeldvorming bij t = 0 uur nauwkeurig de basislijn doelceltellingen weergeeft, start beeldverwerving binnen 10–15 minuten na co-kweekopstelling en centrifugatie. Voor een volledige plaat met drie beeldkanalen (d.w.z. groen, oranje en NIR) is de scantijd ongeveer 10 minuten per uur voor 3 beelden per put bij 20× vergroting.
   7. Controleer de beeldkwaliteit na de eerste scan en pas de instellingen aan indien nodig.
6. Instrumentinstellingen
   1. Stel spectrale ontmenging in om fluorescentieoverloop van SYTOX Orange naar het groene kanaal te corrigeren. Pas de unmix-waarde in de software aan door de groene en oranje kanalen te vergelijken en te bevestigen dat Orange⁺ dode cellen niet ten onrechte als Green⁺ worden gedetecteerd. Voor het representatieve experiment (Figuur 1) werd de bijdrage van het oranje kanaal aan het groene kanaal ingesteld op 8,5%. Deze waarden zijn dataset-specifiek en moeten voor elk experiment worden geoptimaliseerd.
   2. Configureer niet-adherent cel-voor-cel-analyse om nauwkeurige segmentatie en maskering van alle cellen binnen elk gezichtsveld te garanderen (zie aanvullende figuur 1B voor representatieve opstelling). De volgende parameters worden aanbevolen voor het live-cel beeldvormingssysteem met behulp van suspensie-effector- en doelcellijnmodellen:
      1. Stel de verwachte objectdiameter in op 15 μm (ongeveer celdiameter).
      2. Stel de drempelgevoeligheid en textuurgevoeligheid in op 5.
      3. Stel de randgevoeligheid in op 10 om de scheiding van celclusters te vergemakkelijken.
      4. Stel het geaccepteerde filterbereik van objectgebieden in op 50–2000 μm² om puin en grote objecten uit te sluiten.
      5. Stel het excentriciteitsmaximum in op 0,95 om niet-cellulaire objecten uit te sluiten.
   3. Stel classificatiedrempels in (zie aanvullende figuur 1C voor representatieve gating). Gebruik target-only control wells om de basislijn NIR⁺/Orange⁻ levende doelcelpopulatie te definiëren. Gebruik vervolgens co-cultuurputten op latere tijdstippen (bijv. t = 4 uur) om een duidelijke scheiding te bevestigen met minimale overlap tussen NIR⁺/⁻ en Oranje⁺/⁻ populaties. Voorbeeldclassificatiedrempels en analyseparameters zijn weergegeven in Aanvullende Figuur 1C.
      1. Stel de Oranje intensiteitsdrempel in op ongeveer 15.
      2. Stel de NIR-intensiteitsdrempel in op ongeveer 0,1.
         OPMERKING: Parameter- en drempelwaarden kunnen variëren afhankelijk van het instrument, de software, het cellijnmodel en de intensiteit van het fluorescentiesignaal.
         OPMERKING: Dit protocol kan worden aangepast voor primaire menselijke NK-cel cytotoxiciteit of ADCC-assays als doelcellen stabiel NIR-fluorescentie tot expressie brengen (bijv. emiRFP670). Het kan ook worden aangepast voor op flowcytometrie gebaseerde dodelijke assays door poly-D-lysinecoating weg te laten en plat-bodem of rondbodem 96-wellplaten te gebruiken.

Figuur 1. Kwantificering van kinetiek en potentie van de door de chimere antigeenreceptor (CAR) NK-92 celgemedieerde cytotoxiciteit met behulp van realtime live-cell beeldvorming. (A) Schematisch overzicht van de IncuCyte live-cel beeldvormingsassay voor het monitoren van NK-cel-gemedieerde cytotoxiciteit. ^BCMA+ Ramos-doelcellen die emiRFP670 (nabij-infrarood [NIR] kanaal) tot expressie brengen, worden geco-cultureerd met NK-92 effectorcellen die ZsGreen (groen kanaal) tot expressie brengen, en celdood wordt gedetecteerd met SYTOX Orange (oranje kanaal). (B) Representatieve fluorescentieafbeelding van een co-cultuurput met een effector-tot-doel (E:T) verhouding van 1:1 op 12 uur. Levende doelcellen (emiRFP670⁺) worden weergegeven in blauw, NK-92 effectorcellen (ZsGreen⁺) in groen, en dode cellen (SYTOX Orange⁺) in rood. Beelden werden gemaakt met behulp van de niet-adherente Cell-by-Cell analysemodule met 20× vergroting. Schaalbalk = 100 μm. (C) Kwantificering van de groei en overleving van doelcellen over tijd bij variërende E:T-verhoudingen voor controle- en CAR-expressieve NK-92-cellen. (D) Kwantificering van overleving van doelcel als functie van de E:T-verhouding op meerdere tijdstippen (4, 8, 16 en 24 uur). Doelceltellingen werden genormaliseerd naar doel-only wells (E:T = 0:1) op elk tijdspunt. (E) Schematische weergave van kwantitatieve metrieken die worden gebruikt om cytotoxiciteit te beoordelen: KR₅₀, killer-tot-doelverhouding vereist om 50% doding na 12 uur te bereiken; KT₅₀, tijd nodig om 50% doden te bereiken bij een E:T-verhouding van 1:1; en IKI₅₀, een geïntegreerde killerindex gedefinieerd als het gebied van de heatmap onder de 50% survival isocline. (F) Heatmaps die de groei en overleving van doelcellen tonen als functie van de E:T-verhouding en tijd voor elke effectorconditie. Kwantitatieve waarden voor KR₅₀, KT₅₀ en IKI₅₀ worden voor elke aandoening aangegeven. Ruwe levende zielceltellingen werden verkregen uit de gegated NIR^+/SYTOX Orange^– populatie met behulp van Cell-by-Cell classificatieanalyse in de IncuCyte 2021C-software. Alle condities werden driemaal uitgevoerd (n = 3). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. Niet-lineaire regressieanalyse werd gebruikt om cytotoxiciteitstrends in panelen D en F te modelleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Kwantificering van antistofafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit door middel van flowcytometrie

1. Bereid primaire menselijke NK-cellen voor
   OPMERKING: Primaire menselijke NK-cellen werden geïsoleerd uit leukocytenverrijkt perifere bloed, verkregen van gezonde volwassen donoren met behulp van een NK-celverrijkingsmethode gevolgd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie, zoals eerder beschreven³. Gezuiverde NK-cellen werden gecryopconserveerd bij 5 × 10⁶ cellen/mL in vriesoplossing (90% FBS en 10% dimethylsulfoxide [DMSO]) als 0,5 mL aliquots in cryovials en opgeslagen bij minder dan −150°C tot gebruik³.
   1. Ontdooi één flesje met 5 × 10^{à 6} primaire menselijke NK-cellen door het cryoviaal voorzichtig te bewegen in een 37°C waterbad gedurende ongeveer 1 minuut, totdat er slechts een klein ijskristal overblijft.
      VOORZICHTIG: Behandel alle monsters van mensen met passende bioveiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling.
      VOORZICHTIG: DMSO bevordert de opname van chemicaliën op de huid. Draag geschikte beschermende uitrusting en vermijd direct contact.
   2. Overbreng de ontdooide cellen naar een 15 mL conische centrifugebuis met 10 mL voorverwarmde (37°C) NK-celkweekmedium en meng door zacht draaien.
      OPMERKING: NK-celkweekmedia bestaat uit Advanced RPMI-1640, aangevuld met 10% FBS, 10% humaan AB-serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 100 μg/mL primocine en 50 U/mL humaan IL-2.
   3. Centrifugecellen (5 min, 300 × g, RT, acceleratie = maximum; vertraging [rem] = maximaal).
   4. Gooi het supernatant weg.
   5. Susselt de pellet opnieuw in 5 mL voorverwarmd (37°C) NK-celkweekmedium.
   6. Centrifugecellen (5 min, 300 × g, RT, acceleratie = maximum; vertraging [rem] = maximaal).
   7. Gooi het supernatant weg.
   8. Suspendeer de pellet opnieuw in 1 mL voorverwarmd NK-celkweekmedium.
   9. Breng de suspensie over in één put van een 24-put weefselkweekplaat.
   10. Voeg 1 ml steriel PBS toe aan omliggende putten om verdamping te minimaliseren.
   11. Incubeer de 24-wellplaat onder een hoek van 45° (met een plaatrek of steun om de hoek te behouden) bij 37°C met 5% CO₂ gedurende 16–24 uur om NK-celherstel mogelijk te maken.
       OPMERKING: Primaire menselijke NK-cellen hebben nauw contact tussen cellen nodig voor maximale overleving en herstel, wat kan worden bereikt door de 24-wellplaat te kantelen en accumulatie aan de rand van putten toe te staan. Houd een consistente incubatietijd bij alle experimenten heen.
       OPMERKING: Na de herstelperiode gaat u direct over tot de voorbereiding van de doelcel en co-kweek.
2. Kleurdoelcellen met carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE).
   1. Verkrijg 5 × 10⁵ doelcellen en breng ze over in een 15-mL centrifugebuis met conische bodem.
      OPMERKING: Een CD38⁺ patiënt-afgeleide lymfoomcellijn werd gebruikt als doelcel¹⁶.
   2. Was cellen één keer met 10 mL PBS.
   3. Centrifugecellen (5 min, 300 × g, RT, acceleratie = maximum; vertraging [rem] = maximaal).
   4. Bereid een 0,5 μM werkoplossing van CFSE voor in PBS met een 5 mM stockoplossing door 1 μL 5 mM CFSE-voorraad te verdunnen in 10 mL PBS in een 15 mL conische bodem centrifugebuis.
      VOORZICHTIG: CFSE is een reactieve amine-bindende fluorescerende kleurstof en kan risico's met zich meebrengen bij blootstelling aan huid of ogen. Behandel met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en verwijder ongebruikte reagens volgens de lokale bioveiligheidsrichtlijnen.
   5. Gooi het supernatant weg.
   6. Sussief de pellet opnieuw op ongeveer 1 × 10^{6 cellen} /mL in de CFSE-oplossing.
   7. Incubeer 15 minuten bij 37°C met de buis omwikkeld met aluminiumfolie of plaats ze in een ondoorzichtige container ter bescherming tegen licht.
   8. Demp de reactie door 5–10 volumes kweekmedium toe te voegen.
   9. Breng 5 minuten uit bij 37°C.
   10. Centrifugecellen (5 min, 300 × g, RT, acceleratie = maximum; vertraging [rem] = maximaal).
   11. Gooi het supernatant weg.
   12. Suspensieer cellen bij 2,5 × 10⁵ cellen/mL zodat 100 μL 2,5 × 104^cellen bevat.
       OPMERKING: Ga direct over tot plating om een consistente CFSE-signaalintensiteit en levensvatbaarheid van de doelcel te behouden.
3. Plaatdoelcellen
   1. Verkrijg een ronde bodemplaat met 96 putjes.
   2. Voeg 100 μL/put van doelcellen (2,5 × 10⁵ cellen/mL) toe aan aangewezen putten met behulp van een multikanaals pipet (zie aanvullende figuur 2). Elke voorwaarde wordt in drievoud geplateerd.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de celsuspensie homogeen is voordat je het plateert.
4. Bereid antilichaam voor en voeg het toe
   1. Bereid 200 μL 4× antistofoplossing (100 μg/mL) voor in NK-celkweekmedium voor elk testantilichaam en de bijbehorende isotypecontrole.
      OPMERKING: Deze stap is modulair en kan worden aangepast aan elk antilichaam dat ADCC bemiddelt tegen de gekozen doelcellijn. De concentraties en formuleringen van antistoffenvoorraad kunnen variëren; Pas de verdunning dienovereenkomstig aan. Conserveermiddelen zoals azide kunnen de overleving van doelcellen en de functionaliteit van NK-cellen beïnvloeden. Hoewel een reeks antistofconcentraties getest kan worden, wordt hier een uiteindelijke concentratie van 25 μg/mL gebruikt.
   2. Verspreid antilichaamoplossingen naar een diepe putplaat.
   3. Voeg 50 μL/put antistofoplossing toe aan doelcellen en meng grondig door ≥5 keer te pipetten.
   4. Voeg 50 μL/put NK-celkweekmedium toe aan controleputten zonder antistoffen en meng grondig door ≥5 keer te pipetten.
   5. Incubeer 25–30 minuten bij 37°C met 5% CO₂.
5. Bereid NK-cellen voor en voeg ze toe
   1. Tel en verkrijg 2 × 10⁵ NK-cellen met behulp van een op kleurstof gebaseerde celtelmethode (bijv. trypan blauw) of een gelijkwaardige gevalideerde methode. Het aantal is voldoende voor drie NK-cel-bevattende condities die in driemaal worden geplateerd, met een overtollige toevoeging om pipetverliesverlies te compenseren (zie aanvullende figuur 2). Ga door als de levensvatbaarheid ≥75% is, omdat een lagere levensvatbaarheid de assayprestaties kan beïnvloeden.
   2. Resuspendeer cellen tot 2,5 × 10⁵ cellen/mL in 800 μL van het primaire menselijke NK-celkweekmedium (eindconcentratie = 1,25 × 10⁴ cellen/50 μL).
   3. Voeg 50 μL/put NK-cellen toe aan de bijbehorende putten en meng grondig door ≥5 keer te pipetten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de celsuspensie homogeen is voordat je het plateert.
   4. Voeg 50 μL/put kweekmedium toe om de putjes te controleren en meng grondig door ≥5 keer te pipetten.
6. Definitieve co-cultuur opzetten
   1. Controleer zorgvuldig de ronde bodemplaat met 96 putten om te bevestigen dat alle putten 200 μL bevatten met uniforme meniscuswaarden en geen bellen.
   2. Centrifugeer de plaat (2 min, 100 × g, acceleratie = laag [bijv. 2]; vertraging [rem] = laag [bijv. 2]).
      OPMERKING: Deze zachte spin is belangrijk om cellen snel te laten zakken en het contact tussen cel te vergroten. We gebruiken een Eppendorf Centrifuge 5810R compatibele benchtop rotor met de versnellings- en vertragingsinstellingen op 2 (van de 9).
   3. Incubeer 16–18 uur ('s nachts) bij 37°C met 5% CO₂.
      OPMERKING: Deze incubatieduur is geoptimaliseerd voor cytotoxiciteitsuitlezing in plaats van degranulatie, wat het beste wordt beoordeeld door CD107a-expressie op eerdere tijdstippen (2–6 uur) te meten. Daarom kunnen piekdegranulatieresponsen worden onderschat.
      OPMERKING: Verleng de incubatie niet langer dan 18 uur, omdat langdurige co-kweek kan leiden tot overmatige doelceldood in controleputten en een verminderd dynamisch bereik tussen experimentele omstandigheden.
7. Voer flowcytometrie uit
   1. Centrifuge (5 min, 300 × g, acceleratie = maximaal; vertraging [rem] = maximaal).
   2. Gooi het supernatant weg.
   3. Was alle putten met 200 μL/put FACS-buffer (2% FBS, 2 mM EDTA in PBS).
   4. Bereid een oppervlakte-antilichaam-mastermix voor in FACS-buffer door CD56-BV421 toe te voegen bij verdunning van 1:50, CD16-BV785 bij verdunning van 1:50 en CD107a-PE-Cy7 bij verdunning van 1:25.
      OPMERKING: Bereken het totale volume van de master mix op basis van het experimentele plaatontwerp (aantal putten × 50 μL/put + 20% overschot). Antistofklonen kunnen variëren in kleuringsintensiteit en toegankelijkheid van epitoopen. Klonen die in de representatieve gegevens worden gebruikt, worden vermeld in de Materiaaltabel, en alternatieve klonen kunnen titratie vereisen. Extra antilichamen kunnen worden opgenomen voor fenotypering van NK-celsubsets (bijv. KIRs, NKG2A/C/D en CD57) en activatiemarkers (bijv. CD69 en HLA-DR).
   5. Sussen cellen opnieuw in 50 μL/put van antilichaam, master mix en meng grondig door ≥5 keer te pipetten.
   6. Incubeer 15 minuten op 4°C met het bord omwikkeld in aluminiumfolie of in een ondoorzichtige container geplaatst om het licht te voorkomen.
   7. Voeg 150 μL/put FACS-buffer toe.
   8. Centrifuge (5 min, 300 × g, acceleratie = maximaal; vertraging [rem] = maximaal).
   9. Gooi het supernatant weg.
   10. Sussen cellen opnieuw in 100 μL/put van 5 μM 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in een FACS-buffer en ga direct over tot flowcytometrie-acquisitie. Er is geen pre-acquisitie-incubatie vereist.
   11. Verzamel gegevens door flowcytometrie en registreer fluorescentiekanalen voor CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI en eventuele extra fluoroforen.
       OPMERKING: Acquisitie-instellingen (bijv. detectorspanningen, compensatie en gating) kunnen optimalisatie vereisen. Gebruik ongekleurde en enkelgekleurde controles voor compensatie en gating, met compensatiekralen of representatieve cellen indien nodig. Fluorescentie-minus-één controles moeten worden overwogen voor markers met continue of zwakke expressie (bijv. CD107a). Houd consistente instellingen en gatingstrategie, inclusief live/dead gating en identificatie van doel- en effectorpopulaties, over experimenten heen.
       OPMERKING: Zowel Stap 1 als Stap 2 kunnen worden aangepast voor hechtende doelcellen. Zaaddoelcellen (met hun respectievelijke kweekmedia) in een plate-bodemplaat met 96 putten één dag voor co-kweek met een dichtheid die op de dag van de assay ongeveer 70% confluentie bereikt. Na bevestiging van de hechting wordt het doelcel-medium weggegooid en vervangen door 100 μL verse NK-celmedia, waarna effectorcellen worden toegevoegd om co-cultuur te starten. Vanwege verschillen in celgrootte en morfologie moeten IncuCyte Cell-by-Cell analyseparameters worden geoptimaliseerd voor elke hechtende cellijn.
       OPMERKING: Voor op flow cytometrie gebaseerde assays met hechtende cellen, centrifugeer na co-cultuur de plaat (300 × g, 5 min) en verwijder het supernatant. Voeg 100 μL/put TrypLE toe en incubeer bij 37°C met 5%_CO2 gedurende ongeveer 5–15 minuten (afhankelijk van de cellijn) om cellen los te koppelen. Voeg 100 μL/put FACS-buffer toe, meng door op en neer te pipetteren in een cirkelvormige beweging, en breng alle cellen over op een ronde bodemplaat met 96 putten. Inspecteer putten microscopisch om volledige loslating te bevestigen voordat je begint met kleuring (Stap 2, Substap 7). Optimaliseer de incubatietijd van TrypLE indien nodig om een single-cell suspension te bereiken.

Resultaten

Om NK-celcytotoxiciteit in realtime te kwantificeren, werden NK-92 effectorcellen die zijn ontworpen om anti-BCMA CAR's tot expressie te brengen, geco-cultureerd met BCMA⁺ Ramos doelcellen in een zwarte, transparante platbodemplaat met 96 wells en gemonitord met live-cell imaging (Figuur 1A en aanvullende figuur 1A). Effectorcellen werden toegevoegd met E:T-verhoudingen van 0:1 (alleen doel), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 en 2:1, waarbij elke voorwaarde in drievoud werd uitgevoerd. Drie verschillende CAR NK-92-constructen werden geëvalueerd: CAR1 zonder co-stimulerend domein, CAR2 met een 4-1BB (CD137) co-stimulerend domein, en CAR3 met een DAP10 co-stimulerend domein, samen met controle-NK-92-cellen die een ZsGreen-only vector expresseren. Alle effectorcellen werden gegenereerd via lentivirale transductie, zoals eerder beschreven^met ZsGreen-P2A-CAR transgencassettes. Ramos-doelcellen werden op vergelijkbare wijze getransduceerd met een emiRFP670-coderende lentivirale vector. De groei en overleving van doelcellen werden elk uur gevolgd over een periode van 24 uur met behulp van het live-cell imaging-instrument, waarbij groene fluorescentie werd gemeten voor ZsGreen⁺ NK-92-cellen, oranje fluorescentie voor SYTOX Orange⁺ dode cellen, en NIR-fluorescentie voor emiRFP670⁺ doelcellen (Figuur 1A en aanvullende Figuur 1B en 1C).

Microscopische beelden werden op bepaalde tijdsintervallen gemaakt om effectorcellen, levende doelcellen en dode cellen tijdens co-kweek te visualiseren (Figuur 1B). Kwantificering van de groei en overleving van doelcellen toonde aan dat CAR2- en CAR3 NK-92-cellen snellere dodelijke kinetiek vertoonden dan CAR1 NK-92-cellen, vooral op eerdere tijdstippen met een E:T-verhouding van 1:1. Het doden van doelcellen nam toe met hogere E:T-verhoudingen, ook in controlecellen NK-92, die natuurlijke cytotoxiciteit vertoonden (Figuur 1C). Deze metingen benadrukken het vermogen van live-cel beeldvorming om dynamische veranderingen in cytotoxische activiteit vast te leggen. De overleving van doelcel en doelcel werd ook geanalyseerd als functie van de E:T-verhouding op bepaalde tijdstippen om de potentie van CAR NK-92 te vergelijken. CAR2- en CAR3 NK-92-cellen vertoonden een grotere potentie bij lagere E:T-verhoudingen op latere tijdstippen (bijv. E:T = 0,25:1 op 24 uur) en op intermediaire E:T-verhoudingen op eerdere tijdstippen (bijv. E:T = 1:1 op 4 uur) (Figuur 1D). Er werden geen significante verschillen in doding waargenomen tussen CAR2- en CAR3 NK-92-effectorcellen in de analyses.

Een heatmap die de E:T-verhouding, co-incubatietijd en overleving van doelcellen integreert, biedt een uitgebreide visualisatie van natuurlijke en CAR-gemedieerde cytotoxiciteit in alle effectorpopulaties en maakt kwantitatieve beoordeling mogelijk. Drie parameters werden gedefinieerd om potentie en kinetiek te kwantificeren: KR₅₀, de killer-tot-doel-ratio die 50% dodelijke (na 12 uur) bereikt; KT₅₀, de co-incubatietijd die nodig is om 50% doding te bereiken (bij een E:T-verhouding van 1:1); en IKI₅₀, de geïntegreerde killer-index die het gebied van de heatmap onder 50% overleving vertegenwoordigt, gedefinieerd door de 50% overlevingsisoclina (Figuur 1E). Deze meetwaarden maken het mogelijk om de potentie van CAR NK-92-cellen (KR₅₀), dodelijke kinetiek (KT₅₀) en geïntegreerde cytotoxische prestaties (IKI₅₀) te vergelijken (Figuur 1F). Deze analyse toont aan hoe de assay kwantitatief gemanipuleerde NK-celplatforms kan vergelijken over meerdere parameters binnen één enkel experiment.

Flowcytometrie met celtelling werd gebruikt om ADCC te meten door fluorescentief-gelabelde doelcellen te cocultiveren met primaire menselijke NK-cellen in aanwezigheid of afwezigheid van therapeutische antilichamen en het kwantificeren van de resterende levende doelcelpopulatie na 16–18 uur incubatie (Figuur 2A). Flowcytometers zoals Cytek Aurora, BD Symphony of BD Fortessa met een high-throughput sampler kunnen worden gebruikt. In de representatieve opstelling (Aanvullende Figuur 2) werden CD38⁺ patiënten-afgeleide lymfoomdoelcellen geplateerd in een ronde bodemplaat met 96 putjes, en werd daratumumab (of isotype-antilichaam) toegevoegd aan de geschikte putten. NK-cellen werden vervolgens geco-cultureerd met een E:T-verhouding van 0,5:1, een verhouding geoptimaliseerd voor deze doelcellen om natuurlijke doding te minimaliseren en tegelijkertijd ADCC te kunnen detecteren. Na incubatie werd flowcytometrie uitgevoerd om celpopulaties te onderscheiden via voorwaartse en zijwaartse verstrooiing, niet-levensvatbare gebeurtenissen met DAPI uit te sluiten en CFSE⁺ doelcellen te scheiden van CD56⁺CD16⁺ NK-cellen voor parallelle analyse (Figuur 2B). Dit ontwerp maakt gelijktijdige meting van cytotoxiciteit en fenotypische karakterisering mogelijk.

Figuur 2. De op flow cytometrie gebaseerde antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) test maakt gelijktijdige kwantificatie van overleving van doelcellen en activatie van NK-cellen mogelijk. (A) Schematisch overzicht van de ADCC-assay. CFSE-gelabelde CD38⁺ lymfoomdoelcellen werden geplateerd met 2,5 × 10^{4 cellen} per put en onder vijf omstandigheden gekweekt: alleen doelcellen; doelcellen met daratumumab (25 μg/mL); doelcellen met NK-cellen (E:T = 0,5:1); doelcellen met NK-cellen en daratumumab; en doelcellen met NK-cellen en isotypecontrole-antilichamen (25 μg/mL). (B) Vertegenwoordigende flow cytometrie gatingstrategie. Gebeurtenissen werden eerst gegated door forward scatter en side scatter, gevolgd door het uitsluiten van niet-levensvatbare cellen met behulp van DAPI. Doelcellen werden geïdentificeerd als CFSE⁺-gebeurtenissen, en NK-cellen als CD56⁺ en CD16^+-gebeurtenissen. NK-celdegranulatie werd beoordeeld met CD107a-expressie. (C) Kwantificering van de overleving van doelcels, uitgedrukt als percentage ten opzichte van de doel-only controlevoorwaarde (ingesteld op 100%). (D) Kwantificering van NK-celdegranulatie, weergegeven als het percentage CD107a⁺-cellen binnen de NK-celpopulatie. Balken stellen gemiddelde ± standaarddeviatie voor, en overliggende punten vertegenwoordigen individuele replicatieputjes (n = 3). Statistische analyse werd uitgevoerd met eenrichtingsvariantie met Tukey's post hoc meervoudige vergelijkingstest. De statistische significantie wordt als volgt aangegeven: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het primaire eindpunt is overleving van doelcel, berekend binnen de live CFSE⁺ poort en genormaliseerd naar de doel-only conditie, die is ingesteld op 100% overleving. Deze normalisatie controleert voor spontane verlies van doelcellen en maakt directe vergelijking tussen omstandigheden mogelijk. In representatieve gegevens (Figuur 2C) verminderde de toevoeging van alleen daratumumab de overleving van doelcellen niet, wat bevestigt dat het antilichaam geen direct effect heeft op de levensvatbaarheid van doelcellen zonder effectorcellen. Co-kweek met alleen NK-cellen verminderde de overleving van doelcellen tot ongeveer 70%, wat wijst op natuurlijke cytotoxiciteit op de basislijn. De toevoeging van daratumumab verlaagde de overleving verder tot ongeveer 37%, wat consistent is met een verhoogde antilichaam-gemedieerde doding, terwijl de isotypecontroleconditie een overleving van ongeveer 62% liet zien, vergelijkbaar met de NK-only aandoening. Succesvolle experimenten tonen een duidelijke scheiding aan tussen antilichaambehandelde en controleomstandigheden met hoge reproduceerbaarheid over replicaten.

Secundaire fenotypering van NK-cellen biedt complementaire bevestiging van de relatie tussen doelceldoding en effectoractivatie. NK-celdegranulatie, gemeten als het percentage CD107a⁺ NK-cellen, was het laagst bij NK-cel-doelcel co-kweek zonder antilichaam en hoogst in de met daratumumab behandelde aandoening (ongeveer 31%), waarbij de isotypecontrole intermediaire degranulatie vertoonde (ongeveer 19%) die antilichaam-gemedieerde activatie ondersteunde (Figuur 2D). Deze resultaten tonen aan dat de assay het doden van doelcellen kan onderscheiden van effectoractivatie. Hoewel degranulatie- en overlevingstrends over het algemeen op elkaar af zijn, overlappen ze niet volledig, wat aangeeft dat ze verwante maar verschillende biologische processen vertegenwoordigen.

Suboptimale experimenten tonen doorgaans verminderde scheiding tussen omstandigheden, variabiliteit in celtellingen tussen putten, hoge sterfte van doelcellen in controleputten, zwakke CFSE-kleuring of verhoogde achtergronddegranulatie. Deze uitkomsten kunnen het gevolg zijn van slechte levensvatbaarheid van doelcellen, inconsistente NK-celherstel, onvoldoende menging of variabiliteit in kleuring en verwerving. Omdat de assay onafhankelijk doel- en effectorcompartimenten identificeert, kan deze worden uitgebreid met aanvullende fenotypering van doelcellen (bijv. antigeendichtheid of ligandexpressie) en bredere karakterisering van NK-cellen. De opname van een "alleen NK"-voorwaarde kan de basisdegranulatie en de levensvatbaarheid van NK-cellen verder kwantificeren. Dit multiparameterontwerp is een belangrijk voordeel, omdat functionele cytotoxiciteit kan worden geïnterpreteerd naast mechanistische immuunfenotypes.

Aanvullende figuur 1. Workflow voor representatieve plaatindeling en analyse voor cytotoxiciteitstest met levende cellen. (A) Representatieve 96-put plaatindeling voor de CAR NK-cel dodelijke assay. Vier effectorcelcondities zijn gerangschikt in kwadranten, elk getest op E:T-verhoudingen van 0:1 (alleen doelcontrole), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 en 2:1, waarbij elke conditie in drievoudig formaat wordt uitgevoerd (in totaal 60 assayputten). (B) Representatieve configuratie van niet-adherent cel-voor-cel analyse in IncuCyte 2021C-software, die spectrale ontmenging, segmentatie en maskeringsparameters illustreert die worden gebruikt om individuele effector- en doelcellen te identificeren, terwijl afval en aggregaten worden uitgesloten. (C) Representatieve cel-voor-cel classificatiegatingstrategie met NIR versus SYTOX Orange fluorescentie om de levende doelcelpopulatie te definiëren. Doel-only putten en co-cultuurputten op een voorbeeldmoment (t = 4 uur) worden gebruikt om de scheiding tussen levende en dode celpopulaties te bevestigen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2. Representatieve plaatindeling voor op flowcytometrie gebaseerde ADCC-assay. Representatieve 96-put plaatindeling die vijf experimentele condities illustreert, verplaatst in drievoud over rijen B–D en kolommen 2–6 (totale assay wells = 15): (1) doel-only controle, (2) doelcellen met daratumumab, (3) doelcellen met NK-cellen, (4) doelcellen met NK-cellen en daratumumab, en (5) doelcellen met NK-cellen en isotypecontrole-antilichaam. Doelcellen werden geplateerd met 2,5 × 10⁴ cellen per put, en NK-cellen werden toegevoegd bij 1,25 × 10^{4 cellen} per put om een E:T-verhouding van 0,5:1 te bereiken. Antilichamen werden gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 25 μg/mL. Omliggende putten werden gevuld met PBS om verdamping te minimaliseren. De target-only conditie werd gebruikt om de overleving van doelcellen te normaliseren, en de isotypecontrole hield rekening met antistofformuleringseffecten, onafhankelijk van antigeenspecificiteit. Optimalisatie van de E:T-verhouding kan nodig zijn, afhankelijk van de gevoeligheid van de doelcellijn. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Deze protocollen bieden twee complementaire benaderingen om cytotoxiciteit van NK-cellen te kwantificeren in een gestandaardiseerd 96-well-plaatformaat. Stap 1 maakt gebruik van realtime live-cell imaging om continu het verlies van doel-cel te monitoren en is zeer geschikt voor het beoordelen van de kinetiek van natuurlijke en CAR-gemedieerde killing over meerdere E:T-verhoudingen. Stap 2 gebruikt flowcytometrie om ADCC te kwantificeren na een gedefinieerde co-incubatieperiode, terwijl tegelijkertijd doel- en effectorcompartimenten worden gescheiden voor fenotypische analyse¹⁷. Deze methoden, die worden gepresenteerd als complementaire assayplatforms die kunnen worden gebruikt om verschillende biologische processen te modelleren, zijn ook gemakkelijk uitwisselbaar. Primaire menselijke NK-cellen kunnen worden gebruikt voor live-celbeeldvormende ADCC-assays en kunnen ook worden ontwikkeld voor CAR-gemedieerde doding in flowcytometrie-assays. Bovendien, hoewel wildtype NK-92-cellen CD16-expressie¹⁸ missen, stelt introductie van CD16 (bijvoorbeeld via lentivirale transductie) NK-92-cellen gemakkelijk in staat om krachtige ADCC te bemiddelen. Als zodanig kunnen beide assays worden afgestemd op individuele wetenschappelijke en translationele behoeften.

Er zijn verschillende stappen die bijzonder belangrijk zijn voor reproduceerbaarheid in beide assays. Kleine veranderingen in het aantal effectorcellen en het fenotype kunnen de overleving van doelcellen drastisch beïnvloeden. Nauwkeurige celtelling en grondige herophanging tijdens het plateren zijn essentieel om afwijkingen in celtellingen en onvolledige menging te minimaliseren. Evenzo moet celvoorbereiding consistent blijven tussen de experimenten, inclusief levensvatbaarheid, hersteltijd en eerdere blootstelling aan cytokinen, om een uniforme effectorfunctionaliteit te waarborgen. Plaatgeometrie is een andere belangrijke factor voor assayprestaties. In de live-cel beeldvormingsworkflow ondersteunen platen met platte bodem gecoate platen stabiele beeldverwerving en consistente veldanalyse, terwijl in de flowcytometrieworkflow ronde bodemplaten cel-cel contact bevorderen en het herstel van niet-hechtende coculturen aan het eindpunt bevorderen. Daarnaast moet de kwaliteit van fluorescerende labeling worden bevestigd vóór de test, omdat slechte doelceldifferentiatie door beeldvorming of zwakke CFSE-scheiding door flowcytometrie de kwantificatie en interpretatie zullen belemmeren.

Deze twee workflows brengen verschillende technische overwegingen met zich mee. In de live-cell imaging assay zijn veelvoorkomende oorzaken van slechte datakwaliteit ongelijkmatige celplating, dichte celclustering of -klontering, en suboptimale drempelwaarden voor beeldanalyse, die allemaal gemakkelijk te corrigeren zijn. Deze problemen kunnen het aantal cellen verstoren en leiden tot inconsistente tracking in de loop van de tijd. In de op flow cytometrie gebaseerde assay worden suboptimale uitkomsten vaker veroorzaakt door hoge achtergronddood van doelcelen, zwakke scheiding van doel- en effectorpopulaties, slechte antistofkleuring of inconsistente pipetten tussen replicate wells. Omdat deze assays zijn ontworpen voor vergelijkende analyse, is het opnemen van passende interne controles essentieel voor interpretatie, waaronder doel-only controles voor normalisatie en gematchte negatieve controles voor antistof- of CAR-specifieke aandoeningen.

Bij deze methoden moeten verschillende gedeelde en assay-specifieke beperkingen worden meegenomen. De live-cell beeldvormingstest biedt temporele resolutie, maar is afhankelijk van nauwkeurige fluorescentielabeling en beeldanalyseparameters, die beide beïnvloed kunnen worden door celclustering, spectrale overlap of veranderingen in morfologie tijdens co-cultuur¹⁵. In sommige gevallen, vooral wanneer assays primaire effectorcellen betreffen, is het bereiken van adequate fluorescentielabeling zonder het veranderen van de dodelijke dynamiek moeilijk of niet haalbaar. De op flow cytometrie gebaseerde assay biedt een hogere fenotypische resolutie op een bepaald eindpunt, maar maakt geen onafhankelijk onderscheid tussen vroege en late killing, tenzij meerdere gematchte tijdstippen worden verzameld, wat kostbaar en^tijdrovend kan zijn. Daarnaast kunnen eindpuntmetingen niet alleen de dood van doelcellen weerspiegelen, maar ook verschillen in proliferatie van doelcels, effectorverlies of herstel tijdens het behandelen van monsters. Mechanistische uitlezingen zoals CD107a zijn daarom het beste te interpreteren als complementaire indicatoren van activatie van effectorcellen in plaats van directe substituten voor doelceleliminatie¹⁹. In bredere zin reproduceert geen van beide platforms volledig de ruimtelijke architectuur, stromale interacties, cytokinegradiënten of traffickingbeperkingen die de functie van NK-cellen in vivo vormgeven.

Verschillende biologische factoren moeten ook worden meegenomen bij het interpreteren van NK-celdodende assays. Donor-tot-donor variabiliteit is intrinsiek aan experimenten met primaire menselijke NK-cellen, die verschillen in cytotoxisch potentieel en deelverzameling door donorleeftijd, geslacht, infectieziektegeschiedenis en receptorpolymorfismen²⁰. Het gebruik van NK-92-cellen vermindert de variabiliteit aanzienlijk, maar deze cellen kunnen nog steeds bron- en doorgangsgerelateerde veranderingen^{vertonen 18}. Ons protocol beperkt technische of experimentele verschillen door gestandaardiseerde parameters en gelijke-plaatvergelijkingen om deze biologische factoren nauwkeuriger te beoordelen. Waar mogelijk raden wij aan om gedefinieerde NK-92 passage-bereiken met vaste levensvatbaarheidsdrempels te gebruiken. Voor primaire NK-cellen moeten assays NK-cellen van meerdere donoren voor elke aandoening gebruiken, waarbij statistische analyses rekening houden met donor-tot-donor variabiliteit (bijvoorbeeld gepaarde of gemengde effectmodellen), aangezien relatieve verschillen tussen aandoeningen over het algemeen tussen donoren behouden blijven. Bovendien kunnen extra NK-celmarkers (bijv. KIR's, NKG2A/C/D en CD57) worden opgenomen in antilichaampanelen die worden gebruikt voor flowcytometrie om subsetfrequenties tussen donoren te vergelijken en subset-specifieke NK-celactivatie (d.w.z. CD107a en CD69-expressie) te beoordelen, wat de interpretatie van resultaten verder vergemakkelijkt. Tot slot moeten voor alle NK-cel dodelijke assays bepaalde aanvullende scenario's worden overwogen. Expressie van gerichte antigenen op NK-cellen, hetzij door endogene expressie of door het verwerven van antigenen van doelcellen via trogocytose, kan leiden tot NK-celbroedermoord en verwarde resultaten. Daratumumab kan bijvoorbeeld CD38 targeten die op NK-cellen tot expressie komt en fratricide²¹ induceren, waardoor de omvang van ADCC tegen de beoogde doelwitten wordt beperkt. Gelukkig maken live-cell imaging en flowcytometrie-assays kwantificering van NK-cellen mogelijk om fratricide te beoordelen.

Ondanks deze beperkingen biedt het gecombineerde gebruik van live-celbeeldvorming en flowcytometrie een praktisch kader voor reproduceerbare functionele NK-celtests in een reeks basis- en preklinische toepassingen. De beeldvormingsworkflow is voordelig wanneer temporeel gedrag belangrijk is, zoals het onderscheiden van snelle en vertraagde cytotoxische reacties of het vergelijken van dodelijke kinetiek tussen CAR-ontwerpen²². De op flow cytometrie gebaseerde workflow is voordelig wanneer functionele uitlezingen samen met effector- en doelcelfenotypes binnen hetzelfde monster moeten worden geïnterpreteerd. Samen maken deze benaderingen kwantitatieve beoordeling mogelijk van natuurlijke doding, CAR-gemedieerde cytotoxiciteit en ADCC via breed toegankelijke experimentele platforms. Door een gestandaardiseerd en schaalbaar kader op te zetten, faciliteert dit systeem rigoureuze benchmarking en mechanistische onderzoeken over NK-celgebaseerde modaliteiten, wat de ontwikkeling en klinische vertaling van next-generation immunotherapieën versnelt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	Basal medium voor NK-92 en primaire humane NK-celcultuurmedia (zie protocol voor volledige formulering)
Anti-human CD107a-antilichaam, PE-Cy7-geconjugeerd (clone H4A3)	BioLegend	328618	Degranulatiemarker voor flowcytometrie
Anti-human CD16-antilichaam, BV785-geconjugeerd (clone 3G8)	BioLegend	302046	Flowcytometrie
Anti-human CD56-antilichaam, BV421-geconjugeerd (clone HCD56)	BioLegend	318328	Flowcytometrie
Benchtop centrifuge met slingerbekerrotor compatibel met 15-mL buizen en 96-well platen (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	Gebruikt voor celpelleting en platencentrifugatie (100–300 × g)
Carboxyfluoresceine succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Celproliferatiekleurstof voor doelcellabeling
Cytek Aurora spectral flow cytometer (of equivalent)	Cytek Biosciences	N7-00003	Gebruikt voor flowcytometrieacquisitie en -analyse
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole)	BioLegend	422801	Kernkleuring voor live/dead discriminatie
Diep-well 96-well plaat	USA Scientific	1896-2110	Gebruikt voor antilichaamvoorbereiding
Dimethyl sulfaat (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Cryopreserveringsreagens
Foetaal bovien serum (FBS)	Avantor	76419-584	Supplementatie van basaal medium; gebruikt in FACS-buffer (2% FBS)
Algemeen doelwaterbad, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	Voor celontdooien
GlutaMAX (L-alanyl-L-glutamine supplement)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Stabile glutaminebron
Humain AB serum	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Supplement voor primaire humane NK-celcultuurmedia
IncuCyte SX5 live-cell beeldvormingssysteem	Sartorius	4816	Real-time live-cell beeldvorming en Cel-per-Cel analyse
LUNA-FL dual fluoresceine celteller (of equivalent)	Logos Biosystems	L20001	Geautomatiseerd celtelling
Parafilm M (4 in × 250 ft rol)	Genesee	16-101	Plaatsealing en opslag
Fosfaat-gebufferde saline (PBS), steriele (pH 7,2–7,4)	Corning	21-020-CV	Gebruikt voor wassen en FACS-bufferbereiding
Poly-D-lysine (0,1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Plaatcoatingsreagens
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Antibioticum
Recombinant humaan interleukine-2 (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	Cytokine
RosetteSep Human NK-celverrijkingskit	STEMCELL Technologies	15065	Humaan NK-celverrijkingscocktail
SYTOX Orange dode celkleuring	Thermo Fisher Scientific	S34861	Viabiliteitskleuring voor live-cell beeldvorming
Trypan Blauw 0,4%	Gibco	15250-061	Viabiliteitskleuring voor celtelling
TrypLE Express Enzym (1X), geen fenolrood	Thermo Fisher Scientific	12604039	Voor hechtingsceldetachment
UltraPure EDTA (0,5 M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	Gebruikt voor FACS-bufferbereiding
15-mL conische bodem centrifugeerbuizen	Corning	352097	Steriele
24-well weefselcultuurplaat (weefselcultuur–behandeld)	Corning	3524	Gebruikt voor NK-celrecuperatie
96-well heldere ronde bodem plaat (weefselcultuur–behandeld)	Corning	3799	Gebruikt voor co-cultuur en flowcytometrie assays
96-well platte heldere bodem zwarte polystyreen plaat (weefselcultuur–behandeld)	Corning	3603	Compatibel met live-cell beeldvormingssystemen