Methodenartikel

Optogenetische analyse van het gedrag bij de mug Aedes aegypti

268 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71394

⸱

21 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Yale University, 2Kavli Institute for Neuroscience, Yale University, 3Howard Hughes Medical Institute, 4Wu Tsai Institute, Yale University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het gebruik van optogenetica om het gedrag van de mug Aedes aegypti te begrijpen. Er worden methoden voor kweek, preparatie, assays en analyse gepresenteerd om de neuronale functie tijdens de aantrekking tot gastdieren en het bloedvoeden te beoordelen. Deze fundamentele technieken zullen neurale circuit- en gedragsstudies mogelijk maken van deze belangrijke vector voor menselijke ziekten.

Samenvatting

De mug Aedes aegypti is een belangrijke vector voor virale pathogenen en dient als model voor andere vectorsoorten. Pathogenen worden overgebracht wanneer een mug een gastheer dier bijt, maar de neurale circuits die het zoek- en bijtgedrag aansturen blijven onbekend. Dit artikel beschrijft methoden voor het manipuleren van de neurale activiteit in de mug met behulp van optogenetica, een cruciale techniek om de causale relatie tussen neurale circuits en gedrag te bepalen. Deze methoden omvatten het opkweken van muggen voor optogenetica en drie assays die zijn ontworpen om verschillende stappen in de sequentie van opwinding, attractie, het tasten met de proboscis en het volzuigen met gastheerbloed te meten. Deze gedragingen treden op verschillende ruimtelijke schalen op en als reactie op verschillende sensorische stimuli. Elke gedragsassay is uitgerust met rode (~625 nm) LED's voor optogenetische activatie. Om opwinding als reactie op olfactorische stimuli te detecteren, worden vliegen en lopen gekwantificeerd. Om attractie of landing te testen, worden de muggen in een grote arena blootgesteld aan een verwarmde bloedmaaltijd. Het tasten met de proboscis en het volzuigen worden getest met video's met een hogere resolutie, waardoor meting van de aanhangsels en de abdominale grootte mogelijk is. Het protocol beschrijft machine vision-modellen om een temporele kwantificering van het gedrag met een hoge resolutie en eindpuntmetingen van de voeding mogelijk te maken. Deze methoden kunnen worden gebruikt om de rol van elke genetisch toegankelijke populatie neuronen in het bijtgedrag van de mug te testen en kunnen worden uitgebreid naar aanvullende gedragingen.

Inleiding

De mug is een van de gevaarlijkste dieren ter wereld, niet vanwege haar felheid of kracht, maar vanwege haar efficiëntie als vector voor ziekten. Malariaverwekkende parasieten die worden verspreid door Anopheles-muggen zijn jaarlijks verantwoordelijk voor honderdduizenden sterfgevallen, terwijl Aedes aegypti en Aedes albopictus verantwoordelijk zijn voor de verspreiding van gele koorts, dengue, chikungunya, zika-virus en vele andere levensbedreigende ziekten1. Muggen komen voor op elk continent behalve Antarctica en vormen een groot risico voor de volksgezondheid2. Bloedzuigend gedrag brengt pathogenen direct over, maar het is ook een essentiële stap in de levenscyclus van de mug , aangezien een bloedmaaltijd van een gewerveld dier nodig is om eieren te leggen. Het indammen van de verspreiding van door muggen overdraagbare ziekten vereist daarom inzicht in hun mechanismen voor het zoeken naar gastheren.

Het is algemeen bekend dat vrouwelijke muggen gebruikmaken van signalen over lange en korte afstand om gastheren te lokaliseren3,4. Koolstofdioxide (CO2) is een zeer vluchtig gas dat aanwezig is in de menselijke uitademing en is vaak het eerste signaal dat een mug waarneemt. In de olfactorische sensorische neuronen van Aedes aegypti wordt dit gedetecteerd door Gr1-, Gr2- en Gr3-eiwitten, die samen de CO2 receptor vormen5. Blootstelling aan CO2 veroorzaakt opstijg- en vlieggedrag, ook wel activatie genoemd6,7, wat tot 10–15 min kan aanhouden, zelfs bij afwezigheid van verdere stimuli8. CO2 werkt synergetisch samen met huidgeur om activatie en aantrekking te versterken5,9. Na detectie van CO2 en huidgeur is de mug geprimed om aanvullende, meer proximale signalen van de gastheer waar te nemen, zoals warmte, visueel contrast en vochtigheid, die de mug leiden om te landen op een geschikte gastheer voor een bloedmaaltijd5,10,11,12,13. De integratie van meerdere sensorische signalen stelt muggen in staat om hun gastheer effectief op te sporen en te lokaliseren.

Wanneer een vrouwelijke mug op een potentiële gastheer landt, steekt de mug haar snuit in het oppervlak totdat een stuk huid is gelokaliseerd, een proces dat bekend staat als probing14,15. Na het probing doorboort de stylet de huid, lokaliseert een bloedvat en neemt gelijktijdig bloed op terwijl speeksel wordt geïnjecteerd, waardoor de mug in enkele minuten haar lichaamsgewicht kan verdubbelen16. Het bloed wordt naar de middendarm geleid, waar eiwitten worden verteerd voor de productie van eieren. Interessant is dat verzadiging op een gastheer niet noodzakelijk is voor de verspreiding van pathogenen, aangezien probing alleen al ziekten kan overdragen16,17. Daarom zou het begrijpen van elke stap in het bijtgedrag de ontwikkeling van strategieën kunnen mogelijk maken om het zoeken naar een gastheer en het bijten door vrouwelijke muggen te verstoren, en uiteindelijk de verspreiding van door muggen overgedragen ziekten te beheersen.

Er zijn talrijke instrumenten ontwikkeld in modelorganismen om de neuronale activiteit te manipuleren. Vroege instrumenten werkten constitutief of via thermische activatie18,19,20,21. Hoewel nuttig, hebben deze genetische reagentia bepaalde nadelen. Constitutieve instrumenten kunnen de ontwikkeling beïnvloeden, wat leidt tot fenotypen die niet uitsluitend te wijten zijn aan de circuitfunctie van de neuronen. Muggen gebruiken lichaamswarmte om gastheerwerveldieren te identificeren, waardoor thermisch geactiveerde kanalen uniek ongeschikt zijn voor studies naar hun gedrag22,23. Bij gedragsstudies verwijst optogenetica naar het gebruik van genetische instrumenten die reageren op specifieke golflengten van licht om de activatie van neuronen  van belang te controleren. Deze techniek is al in meerdere systemen gebruikt, van het onderzoeken van de valentie van dorst bij muizen tot het bestuderen van paringsgedrag bij Drosophila, tot het herstellen van visusverlies door retinitis pigmentosa in menselijke trials24,25,26. Optogenetische kanalen werken door fotonen te absorberen en specifieke typen ionen door het plasmamembraan te laten passeren, waardoor het neuron wordt geactiveerd of geremd. Door transgene, lichtgevoelige eiwitcoderende genen in een organisme te introduceren, kan deze techniek worden gebruikt om specifieke neuronen te activeren of te remmen die anders onmogelijk te manipuleren zouden zijn. Optogenetica biedt voordelen in temporele en spatiale controle, en een reeks controles die experimentele inferentie mogelijk maken.

De auteurs hebben onlangs het eerste gebruik van optogenetische instrumenten om het gedrag van muggen te bestuderen beschreven8. Deze instrumenten maken gebruik van het door rood licht geactiveerde kationkanaal CsChrimson, een roodverschoven channelrhodopsine27. Microbiële opsines, waaronder CsChrimson, vereisen een chemische cofactor, all-trans-retinaal, om fotonen te kunnen absorberen28. CsChrimson is gefuseerd aan de tdTomato-fluorescente reporter en staat onder controle van het QF2/QUAS-binaire expressiesysteem, waardoor het flexibel gecombineerd kan worden met verschillende driverlijnen29. Om CO2 -sensorische neuronen te targeten, werd een driverlijn gebruikt die de QF2-transcriptiefactor tot expressie brengt in neuronen die de Gr3-subeenheid van de CO2 -receptor tot expressie brengen30. Muggen vertoonden een minimale gedragsrespons na blootstelling aan alleen rood licht8; bovendien is rood licht het meest effectief bij het penetreren van biologisch weefsel, wat een door rood licht geactiveerde opsine ideaal maakt voor optogenetica25.

Dit artikel beschrijft protocollen voor drie assays die verschillende aspecten van gastheerzoekend en bloedvoedend gedrag meten in combinatie met optogenetische stimulatie (Figuur 1A). Ten eerste wordt een protocol gegeven voor het opkweken van optogenetische muggenlijnen. De tweede sectie beschrijft de opto-thermocycler, een gemodificeerde PCR-thermocycler die kan worden gebruikt om opwinding en tastgedrag te volgen wanneer muggen worden blootgesteld aan temperatuur- en lichtstimuli. De opto-thermocycler-assay is ontworpen om dit zoekgedrag over langere tijdsperioden te meten, waarbij driverstrains worden gebruikt om neuronale activiteit via optogenetica te regelen. De derde sectie beschrijft de blood blanket-assay, waarbij muggen constante toegang hebben tot een dunne kunstmatige bloedmaaltijd op de bodem van een gemodificeerde thermocycler, wat het volgen van vlucht, tastgedrag en verzadiging onder variërende licht- en temperatuuromstandigheden mogelijk maakt. De blood blanket-assay, gebaseerd op de opto-thermocycler, biedt een methode om de verzadiging bij een kunstmatige bloedmaaltijd te kwantificeren, waardoor het voedingsgedrag van muggen bestudeerd kan worden met nauwkeurig getimede optogenetische en hittestimuli. De laatste sectie beschrijft de opto-membraanvoeder, waarbij muggen een warme bloedmaaltijd in een canister worden aangeboden, wat het volgen van zowel de aantrekking tot een bloedbron als de verzadiging tijdens blootstelling aan lichtstimuli mogelijk maakt. De opto-membraanvoeder-assay wordt gebruikt om de volledige gedragsreeks van gastheerzoeken en bloedvoeding in een vrij-vliegend systeem te onderzoeken. Naast de verwachte resultaten voor elke assay worden machine vision-modellen beschreven om muggenlichaamsdelen te volgen en gedragingen tijdens de assays te identificeren. De opto-thermocycler-, blood blanket- en opto-membraanvoeder-assays maken de meting van verschillende stadia van het bloedvoedende gedrag van muggen mogelijk, terwijl de neuronale activiteit met licht wordt gemanipuleerd. Deze innovatieve technieken maken het mogelijk om te bestuderen hoe neuronale circuits van muggen gedragingen aansturen die een bedreiging vormen voor de volksgezondheid.

Protocol

De muggen die in dit protocol worden gebruikt, bevatten transgenen en moeten volgens de voorschriften van het United States Department of Agriculture worden gekweekt in faciliteiten met Arthropod Containment Level II32. De muggen worden ingesloten om ontsnapping te voorkomen en worden afgevoerd als biologisch gevaarlijk afval. De protocollen voor biosafety en arthropoden-insluiting zijn gecontroleerd en goedgekeurd door Yale Environmental Health & Safety. Voor dit werk zijn geen menselijke of dierlijke proefpersonen gebruikt. Het genotype van de mug kan worden bevestigd aan de hand van fluorescerende markers (3xP3-dsRed voor Gr3-QF2 en 3xP3-CFP voor QUAS-CsChrimson) of via PCR voor het ingevoegde construct8. Alle materialen die in deze studie zijn gebruikt, staan vermeld in de Tabel met Materialen.

1. Optogenetische opkweek

  1. Kweek muggen volgens het standaardprotocol31 met de volgende uitzonderingen om de respons van optogenetische lijnen tijdens experimenten te maximaliseren.
  2. Voer kruisingen uit met homozygote Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson en wild-type Liverpool-stammen om de heterozygote experimentele lijnen Gr3-QF2/+, QUAS-CsChrimson/+ en Gr3>CsChrimson te genereren.
  3. Kweek de muggen in een lichtdichte incubator ingesteld op 28 °C en 80% luchtvochtigheid, met een cyclus van 14 u blauw licht (450 nm) en 10 u donker (Figuur 1B).
    OPMERKING: Het gebruik van blauw licht minimaliseert de activatie van door rood licht geactiveerde kanalen, zoals CsChrimson. Alle kweekstappen die buiten de incubator worden uitgevoerd, moeten onder omstandigheden met weinig licht plaatsvinden.
  4. Begin de experimenten met volwassen muggen uiterlijk 1 week na het uitkomen.
    OPMERKING: Hoewel de ideale leeftijd voor gedragsexperimenten 2–3 weken is, kunnen muggen tot 4 weken na het uitkomen worden gebruikt. Controle- en experimentele genotypes moeten dezelfde leeftijd hebben, vastgelegd als het aantal dagen na het uitkomen. Om de leeftijd van de dieren te standaardiseren, moeten alle eieren op dezelfde dag uitkomen.
  5. Twee dagen voor het experiment worden gepaarde, niet-bloedgevoede vrouwelijke muggen voorzichtig uit de kooien geaspireerd en geanestheseerd bij 4 °C. Verplaats ze vervolgens voorzichtig met een veer of aspirator naar de experimentele containers, afhankelijk van de gebruikte assay.
  6. Bereid een 0,2 M aliquot van all-trans-retinaal (ATR) in dimethylsulfoxide (DMSO) voor, bewaard bij -20 °C. Bied 10% sucrose en 400 µM ATR aan via gedrenkte katoenen lontjes op het gaas van de container. De dieren kunnen 1–3 dagen in het donker van dit voedsel eten.
    OPMERKING: Voeden in het donker, in plaats van onder blauw licht, voorkomt het bleken van het ATR (Figuur 1B). Daarnaast werden de muggen in alle stappen van het protocol geanestheseerd door blootstelling aan 4 °C gedurende 5–10 min, totdat ze niet meer bewogen. Aan het einde van elk experiment werden de muggen geëuthanaseerd door blootstelling aan -20 °C gedurende 24 u.
    WAARSCHUWING: All-trans-retinaal kan ernstige irritatie veroorzaken bij contact met de huid en ogen. Draag geschikte PBM, zoals een laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming bij het hanteren. Dimethylsulfoxide is een brandbare vloeistof die bij contact via de huid kan worden geabsorbeerd en moet in een droge omgeving met geschikte PBM en oogbescherming worden gehanteerd. DMSO moet tevens worden bewaard in brandveilige chemische opslagcontainers.
  7. Eén dag (20–24 u) voor het experiment worden de sucrose-voeders vervangen door nieuwe voeders met gedestilleerd water en 400 µM ATR. De dieren blijven in het donker tot aan het experiment (Figuur 1B). Ga door naar sectie 2, 3 of 4.
    OPMERKING: De experimenten moeten worden uitgevoerd tijdens de dagfotoperiode van de muggen om de responsgraad te maximaliseren.

2. Opto-thermocycler

  1. Assembleren van de componenten van de assay
    1. Maak de acrylplaten om de muggen in te plaatsen (Figuur 2). Raadpleeg Figuur 2A  voor een diagram, Figuur 2B  voor de elektronische componenten, en Figuur 2C  voor een afbeelding van de acrylplaat. Zie de bestanden in (https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0) voor de sjablonen.
      1. Om de wanden te maken, snijdt u met een laser een acrylplaat van 3 mm in vier rechthoeken van 10 cm bij 1 cm en zes rechthoeken van 7 cm bij 1 cm. Bevestig de rechthoeken met acryllijm in een matrix van vijf bij drie, waarbij elke eenheid een kamer van 17 mm bij 17 mm bij 10 mm is. Het sjabloon voor deze onderdelen staat in het bestand “14_animal_thick_v3.ai”.
        ​WAARSCHUWING: Acryllijm is brandbaar en kan irritatie aan de luchtwegen en ogen veroorzaken. Bij het hanteren van acryllijm moeten geschikte PBM's worden gebruikt, zoals handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril, en dit oplosmiddel moet worden gebruikt in een goed geventileerde ruimte, uit de buurt van open vuur.
      2. Voor de bodem van de kamer snijdt u een acrylplaat van 1,5 mm dik op een afmeting van 6,985 cm bij 10,16 cm, waarbij de rechteronderhoek is verwijderd. Snijd een acrylplaat van 1,5 mm dik in een rechthoek van 6,985 cm bij 10,16 cm voor het deksel. Het sjabloon voor deze onderdelen is “14_animal_thin_v3.ai”.
    2. Snijd een UV-bestendig zwart gaasdoek op dezelfde afmeting als het onderste acrylstuk (Figuur 2C). Plaats het gaas tussen de wanden van de plaat en het bodemstuk, en lijm deze vervolgens op hun plaats met acryllijm. Verwijder het gaas uit de rechteronderhoek zodat het gat onbelemmerd is.
  2. Construeer een frame waarin de camera en LED's worden geplaatst (Figuur 2A).
    1. Bouw een frame met vier pilaren op elke hoek van de thermocycler met behulp van optische constructierails van 60,96 cm en 25 mm vierkant. Gebruik twee constructierails van 22,86 cm en 25 mm om de rechtervoorste pilaar met de rechterachterste pilaar te verbinden en de linkervoorste pilaar met de linkerachterste pilaar, op 30 cm van de werkbank.
    2. Verbind de rechter- en linkerpilaren aan de voorzijde met een constructierail van 30,48 cm en 25 mm, 24 cm boven de werkbank verhoogd, en aan de achterzijde met een constructierail van 30,48 cm en 25 mm, 42 cm boven de werkbank verhoogd.
    3. Bevestig optische stangen van 1 voet lang aan de constructierail aan de linker- en rechterzijde van het frame. Bevestig aan elke stang zes in serie geschakelde 627 nm (rode) LED's op 24 cm boven het PCR-blok van de thermocycler.
      OPMERKING: Hoewel de golflengte van het licht die resulteert in de piekactiviteit van CsChrimson ~590 nm is, balanceren golflengten nabij ~625 nm de noodzaak om CsChrimson te activeren en gedragsreacties op licht bij genetische controles te vermijden27. Plak een koellichaam en een lens op elke LED om het licht op het blok van de thermocycler te focussen.
    4. Bevestig een optische stang van 30,48 cm aan de bovenkant van de twee voorste constructierail-pilaren. Gebruik een haakse klem in het midden van de optische stang om een optische stang van 15,24 cm naar binnen gericht over het thermocycler-blok te bevestigen. Bevestig een camera met een infrarood long-pass filter aan het uiteinde, naar beneden gericht, 40 cm boven het blok.
    5. Maak met behulp van optische stangen een frame dat vanuit de constructierail in een rechthoek rond het PCR-blok loopt, net boven het oppervlak verhoogd. Bevestig een strip infrarode LED's, gericht op het PCR-blok, om de muggen in een rechte hoek ten opzichte van de camera te verlichten.
      OPMERKING: De infrarode verlichting die wordt gebruikt voor videobeelden verwarmt de arena niet meetbaar, aangezien het oppervlak van de thermocycler gedurende het hele experiment op 24 °C wordt gehouden.
    6. Hang een verduisteringsgordijn over de constructie om storing door omgevingslicht te voorkomen.
    7. Bedek het oppervlak en de zijkanten van het PCR-blok met een enkele laag verduisteringstape om een vlak, gelijkmatig oppervlak met een donkere achtergrond te creëren.
    8. Plaats de thermokoppel-sensor op het PCR-blok in de rechteronderhoek en bevestig deze met verduisteringstape. Bevestig een gelijkmatige lichtverdeling over het PCR-blok met behulp van een power meter. Pas de spanning of stroom van de voeding aan om licht te leveren bij 12 µW/mm2.
    9. Plaats aan de rand van het PCR-blok een infrarode LED om de video te synchroniseren met de stimulus-leveringsoutput (Figuur 2C). Bedek het oppervlak met zwarte tape zodat het licht gedetecteerd kan worden zonder schittering in de camera te veroorzaken.
    10. Bedraad het thermokoppel, de synchronisatie-LED en de rode licht-LED's volgens het diagram in Figuur 2B. Download de vereiste software (SpinView (versie 1.27.0.48), CoolTerm (versie 2.0.1), Arduino IDE (versie 1.8.12)). Download de Arduino-code en het thermocycler-programma uit de GitHub-repository.
      ​OPMERKING: De Arduino-code is geprogrammeerd om rood licht, lichaamstemperatuur-warmte en de combinatie van beide stimuli te leveren. Er zijn zeven stimulusprogramma's voorzien als bronnen, waarbij de volgorde van de stimuli onderling is gerandomiseerd. Deze kunnen worden aangepast om verschillende stimuli te leveren. Er zijn negen stimuli per experiment: drie van alleen warmte, drie van alleen licht en drie van gelijktijdige warmte en licht. De stimuluslevering werkt doordat de Arduino via het thermokoppel veranderingen in de oppervlaktetemperatuur van het PCR-blok detecteert en vervolgens lichtstimuli op de gespecificeerde tijden levert. Aanvullende details zijn te vinden in de opmerkingen binnen de stimulusprogramma's.
  3. Voorbereiding van de proef
    1. Kweek muggen volgens het optogenetische kweekprotocol; zie sectie 1 en Figuur 1B.
    2. Twee dagen voor het experiment brengt u 14 vrouwelijke muggen met een aspirator over naar een aparte container. Voorzie de muggen van ATR volgens stap 1.6. Als meerdere genotypen worden vergeleken, worden deze geblindeerd voor de experimentator.
      ​OPMERKING: Zodra muggen ATR hebben ontvangen, moeten ze bij gedimd licht worden gehanteerd.
    3. Eén dag voor het experiment (20–24 u) aspireert u 14 vrouwelijke muggen per acrylplaat en anestheseert u deze bij 4 °C. Plaats voorzichtig één voor één een mug in elk van de putjes met een veertje of aspirator.
    4. Plak de zijkant van de acrylplaat met plakband om het deksel op zijn plaats te houden. Vouw het plakband niet over de boven- of onderkant van de acrylplaat, omdat dit het zicht van de camera zou belemmeren.
    5. Plaats de acrylplaat bovenop drie katoenen lonten gedrenkt in 400 µM ATR in gedestilleerd water (zie stap 1.6), parallel geplaatst. Lijn elk van de drie rijen uit met een lont, zodat alle muggen toegang hebben tot de water-ATR-oplossing. Plaats de acrylplaat overnacht in een donkere incubator.
  4. Uitvoeren van de proef
    1. Verbind de camera, LED's en Arduino met de computer. Zet de voeding aan. Veeg het oppervlak van de opto-thermocycler af met 70% ethanol en laat het drogen.
      ​WAARSCHUWING: Ethanol is brandbaar en kan ernstige irritatie aan de ogen veroorzaken. Bij het hanteren van ethanol moeten geschikte PBM's worden gedragen. Vermijd daarnaast elk open vuur.
    2. Breng de acrylplaat met muggen met behulp van een donkere container over naar het midden van het PCR-blok. Bedek de opto-thermocycler met een verduisteringsgordijn.
    3. Open SpinView op de computer. Klik op de cameranaam om het camerabeeld te openen. Sluit de infrarode lampen aan en zorg ervoor dat het PCR-blok en de acrylplaat zichtbaar zijn in het camerabeeld.
    4. Pas indien nodig de acrylplaat aan zodat deze is uitgelijnd, gecentreerd en het thermokoppel zichtbaar is in de rechteronderhoek van de acrylplaat. Zorg dat het synchronisatielicht in beeld is (Figuur 2C).
    5. Pas de instellingen op de camera en in SpinView aan om een scherpe, bijgesneden video te verkrijgen waarop de acrylplaat te zien is. Pas in het tabblad Image Format de opties Width, Height, Offset X en Offset Y aan om ervoor te zorgen dat de acrylplaat en het synchronisatielicht zichtbaar zijn. Zet in het tabblad Settings de optie Acquisition Frame Rate Enable op true en Acquisition Frame Rate op 30 fps.
    6. Zet Exposure Auto en Gain Auto uit. Pas de waarden voor Exposure Time en Gain aan om een helder contrast te creëren tussen de zwarte achtergrond en de muggen. Klik op de rode opnameknop in de rechterbovenhoek om een apart venster te openen om het videobestand op te slaan.
    7. Stel in het pop-upvenster het bestandspad bovenaan in: Klik op Browse, navigeer naar de experimentele map, klik op New folder en benoem deze met de naam van de proef. Stel het aantal frames dat moet worden opgenomen in op het juiste aantal voor het experiment (bijv. 43.500) of op 0 om de opname handmatig te stoppen.
    8. Stel in het tabblad Videos de volgende velden in: Video Recording Type: MJPG, Video File Split Size: 1000 MB, JPEG Compression Quality: 65. Open het programma ‘optothermo_lightheat_random1’ op de thermocycler en start het. De thermocycler moet beginnen in een hold-stap bij 25 °C.
    9. Open het bijbehorende programma, ‘TC_optothermo_lightheat_random1.ino’, in de Arduino IDE en upload het naar de board. Open de seriële monitor en controleer of de temperatuur ongeveer 25 °C is.
    10. Sluit de seriële monitor in de Arduino IDE. Open CoolTerm om de output van de Arduino-seriële monitor te gaan verzamelen. Zorg ervoor dat de seriële poort en het kanaal overeenkomen met die in de Arduino IDE. De output verschijnt in het CoolTerm-venster.
    11. Begin met het opnemen van de Arduino-output in een tekst-/binair bestand. Start de video-opname in Spinview. Klik op Resume om de hold-stap van de thermocycler te beëindigen. Volg de Arduino-output in CoolTerm om te controleren of de temperatuur daalt naar 18 °C en de stimulusteller toeneemt naar 1, waarmee de proef start. Laat de assay lopen tot de proef is voltooid.
  5. Schoonmaak
    1. Stop de video-opname en de acquisitie van de CoolTerm-output. Sluit beide programma's af. Beëindig het thermocycler-programma. Verwijder de acrylplaat met muggen uit de thermocycler en plaats deze overnacht in een vriezer op -20 °C om de muggen te euthanaseren.
      ​WAARSCHUWING: Bij het euthanaseren van transgene muggen moet u ervoor zorgen dat ze ten minste 24 u in een omgeving van -20 °C blijven voordat u ze in een container voor biologisch gevaar afvoert om de dood te garanderen.
    2. Indien u een nieuwe proef start, herhaalt u sectie 2.3. Koppel de camera- en Arduino-kabels los. Zet de voeding uit. Koppel de infrarode LED's los. Maak de acrylplaten schoon door het plakband te verwijderen en de dode muggen weg te gooien.
    3. Spray het deksel en de acrylplaat met 70% ethanol en veeg alle zijkanten van de putjes en het gaas voorzichtig af met een vinger met handschoen. Spoel grondig na met gedeïoniseerd water en stapel de acrylplaten vervolgens op voor opslag, waarbij de deksels met een papieren handdoek worden gescheiden om krassen te voorkomen.

3. Bloeddeken-assay

  1. Assembleren van de componenten van de assay (Figuur 3)
    1. Construeer de opto-thermocycler assay zoals beschreven in sectie 2.1. Raadpleeg de figuren voor de assay (Figuur 3A), de thermische stimulus (Figuur 3B) en de aluminium plaat (Figuur 3C).
    2. Construeer een aluminium voedingsplaat voor bloedmaaltijden zoals te zien in Figuur 3C.
      1. Construeer de boven- en onderzijde van de plaat met een lasersnijder of waterstraalsnijder. Maak de onderzijde van de plaat door een aluminium plaat van 0,8 mm dik te snijden tot 90 mm bij 134 mm. Maak de bovenzijde door een aluminium plaat van 1,6 mm dik te snijden tot 90 mm bij 134 mm. Snijd 15 rechthoekige gaten (17,2 mm bij 18,6 mm) in de bovenplaat. De sjablonbestanden zijn te vinden in de blood blanket GitHub-repository (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket) onder "Aluminum plate templates".
      2. Plaats een dunne siliconen pakking (0,5 mm dik) tussen de aluminium delen om lekkage te voorkomen. Snijd deze met een lasersnijder zodat deze overeenkomt met de vorm van de aluminium bovenkant.
      3. Bevestig de lagen aan elkaar met acht 0,47625 cm, dome-topped hex 4–40 standaardbouten. Gebruik een vormtap om schroefdraad voor de bouten in de metalen delen te maken. Verbind deze via ronde en “W”-ringen aan de onderkant van de plaat voor extra stevigheid wanneer deze op het thermocycler-blok wordt geplaatst.
    3. Download de Arduino-code en het thermocycler-programma voor de blood blanket assay uit de GitHub-repository (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket).
    4. Bereid aliquoten voor van 20 mM ATP in 25 mM NaHCO3 en bewaar deze bij -20 ˚C tot gebruik.
      ​OPMERKING: Bereid elke zes maanden een verse ATP-oplossing. Vermijd herhaalde vries-dooi-cycli. Bereid 1 M NaHCO3 en 5 M NaCl voor (bewaar beide bij kamertemperatuur). NaHCO3 is slechts 7 dagen stabiel in oplossing.
  2. Voorbereiding van het experiment
    1. Kweek muggen op en breng ze over naar acrylplaten zoals beschreven in secties 1 en 2.2. Als er vergelijkingen worden gemaakt tussen verschillende genotypen, moeten deze voor de experimentator geblindeerd worden.
    2. Bereid op de dag van het experiment een minimale kunstmatige bloedmaaltijd van 10 mL voor (110 mM NaCl, 20 mM NaHCO3 en 1,5 mM ATP) door 750 µL van 20 mM ATP, 220 µL van 5 M NaCl en 200 µL van 1 M NaHCO3 stamoplossingen toe te voegen aan 8,83 mL gedeïoniseerd water. Meng grondig door te inverteren.
      OPMERKING: Maak de kunstmatige bloedmaaltijd vers voordat elk experiment begint.
    3. Stel de SpinView-opname in volgens stappen 2.3.4 tot 2.3.8.
    4. Open het Arduino-bestand “Red-light-Only__BB_.ino” (of het gewenste stimulusbestand) voor het experiment.
  3. Uitvoeren van trials
    1. Pipetteer 650 µL van de minimale kunstmatige bloedmaaltijd in elke well van de plaat, waarbij wordt gewaarschuwd dat de maaltijd elke well volledig vult zonder over te lopen.
    2. Span een vierkant van 10,2 cm bij 10,2 cm parafilm over een ring met een diameter van 20,3 cm. Plaats de parafilm over de plaat en druk de randen aan tot deze hecht. Trim met een scalpel een rand van 1,3 cm breed rond de plaat en vouw de overtollige parafilm eronder om de maaltijd af te sluiten.
    3. Plaats de plaat direct bovenop het PCR-blok om maximale warmteoverdracht mogelijk te maken (Figuur 3A).
      OPMERKING: Blackout-tape wordt gebruikt op het oppervlak van het PCR-blok voor de opto-thermocycler, maar niet voor de blood blanket.
    4. Plaats het thermokoppel op het oppervlak van de parafilm in de rechterbenedenhoek van de aluminium plaat. Sluit de camera, LED's en Arduino aan op de computer. Zet de voeding aan. Start het programma “BB_thermocycler_program.x50prog” op de thermocycler.
      OPMERKING: De snelheid van de temperatuurwijzigingen is de maximale ramp-snelheid voor de thermocycler, gekozen om de landing van een mug op een gastheer voor voeding zo goed mogelijk na te bootsen.
    5. Breng de acrylplaat met muggen over naar de aluminium plaat met behulp van een donkere container en gedimd kamerlicht om blootstelling aan licht te minimaliseren, waarbij wordt gewaarborgd dat elke well is uitgelijnd met de muggen. Zorg ervoor dat het thermokoppel zich in de rechterbenedenhoek van de plaat bevindt en in contact staat met de parafilm om de temperatuur van de kunstmatige bloedmaaltijd te meten.
    6. Start het programma door het programma “Red-light-Only__BB_.ino” opnieuw te uploaden in de Arduino IDE. Sluit de seriële monitor. Druk in CoolTerm op Connect om de huidige temperatuur te zien. Pas op basis van deze starttemperatuur de triggertemperatuur in het Arduino-script aan naar ongeveer 0,6 °C daaronder.
    7. Selecteer in het CoolTerm-venster Capture to Text/Binary File en start de gegevensverzameling. Start de video-opname in het opnamevenster in SpinView. Klik op Resume om de hold van de thermocycler te beëindigen. Controleer de Arduino-output in CoolTerm om er zeker van te zijn dat de temperatuurdaling is gedetecteerd en de trial is gestart.
    8. Klik na de duur van de trial op Stop Recording. Selecteer in CoolTerm in het tabblad Capture to Text/Binary File de optie Stop om het schrijven van de seriële output te stoppen.
    9. Verwijder de plaat met muggen van de blood blanket-plaat en breng ze naar de koude kamer om ze te anesthetiseren. Tel het aantal muggen met een vergroot abdomen dat de kunstmatige bloedmaaltijd bevat als verzadigd, inclusief diegenen die gedeeltelijk hebben gevoed.
    10. Reinig tussen de trials het oppervlak van het PCR-blok door af te vegen met een Kimwipe bevochtigd met 70% ethanol. Verwijder de parafilm en spoel de aluminium plaat af met gedeïoniseerd water. Herhaal sectie 3.3 voor verdere trials. Roteer de volgorde van de trials tussen de dagen om het effect van circadiane activiteitscycli te minimaliseren.
  4. Opruimen
    1. Stop alle programma-opnames en sluit ze af. Koppel de USB-kabels van de camera, Arduino en infraroodlampen los. Zet de computer uit. Stop het programma “thermocycler_program.x50prog” dat op de thermocycler draait.
    2. Plaats de muggenplaten overnacht in een vriezer van -20 °C om de muggen te doden. Was de aluminium plaat met gedeïoniseerd water. Besproei de acrylplaat met 70% ethanol, spoel vervolgens af met gedeïoniseerd water en laat deze overnacht drogen voordat er meer muggen worden geplaatst.
      OPMERKING: Platen moeten na het wassen overnacht drogen om er zeker van te zijn dat er geen vocht achterblijft. Als er vocht aanwezig is, zal dit condensatie op het deksel veroorzaken en de video hinderen.

4. Opto-membrane feeder assay

  1. Assembleren van de componenten van de assay (Figuur 4)
    1. Assembleer een frame met opto-mechanische componenten en een zwart acrylplatform van 30,48 cm bij 30,48 cm en 0,635 cm dik. Maak met een lasersnijder een gat met een diameter van 11,43 cm in het midden van het acryl. Snijd gaten op 2,54 cm van elke hoek zodat het acryl kan rusten op de framesteunen, ongeveer 23,495 cm boven de basis.
    2. Bevestig in het midden een zwarte acrylring met een binnendiameter van 19,05 cm en een buitendiameter van 20,32 cm (Figuur 4A). Sjablonen voor alle acrylcomponenten staan in de opto-membrane feeder GitHub-repository (https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0) samen met de Arduino-programma's. Zie de figuur voor de algehele opstelling (Figuur 4A), de stimulus (Figuur 4B), het schakelschema (Figuur 4C) en een videostilstaand beeld (Figuur 4D).
      ​OPMERKING: De specifieke materialen die voor het assembleren van dit platform zijn gebruikt zijn niet kritisch, waardoor er mogelijk kostenefficiëntere opties beschikbaar zijn.
    3. Bevestig een camera met een infrarood long-pass filter onder het centrale gat, gericht omhoog naar de muskietenbus. Stel het diafragma zo in dat het volledig openstaat, zodat er selectief kan worden gefocust op de gaasbovenkant van de bus (Figuur 4A).
    4. Om bussen te maken, snijdt u een transparante polycarbonaatbuis met een diameter van 11,43 cm in cilindrische segmenten van 12,7 cm.
      1. Maak bodems voor de bussen door cirkels met een diameter van 11,43 cm uit 0,3175 cm dik acryl te lasersnijden. De randen van de cirkels zijn lasergeëtst zodat ze in de buis kunnen worden ingepast. Bevestig deze aan de buizen met plastic epoxy.
      2. Maak een inzetdeksel met zwart 0,635 cm en 0,3175 cm acryl en UV-bestendig zwart gaas. De binnenring heeft een diameter van 10,795 cm, terwijl de buitenring een diameter van 12,065 cm heeft, waarbij het zwarte gaas over de kleinere ring is gespannen. Het gaas moet met gewaxte draad door lasersnijgaten worden vastgenaaid.
        ​OPMERKING: Bussen moeten altijd op papieren handdoekjes worden geplaatst om krassen op de acrylbodems te voorkomen, waarover de video wordt opgenomen.
    5. Constructeer acrylcontainers voor de toediening van de bloedmaaltijd (Figuur 4A).
      1. Snijd een ring met een binnendiameter van 5,08 cm en een buitendiameter van 6,6 cm uit 0,15875 cm transparant acryl. Bevestig deze met acryllijm aan een andere transparante ring met een binnendiameter van 5,842 cm en een buitendiameter van 6,604 cm.
      2. Plaats een metalen gaascilinder met een hoogte van 13,97 cm en een diameter van 19,05 cm binnen de zwarte acrylring in het midden van het platform.
      3. Bevestig binnen het metalen gaas een spoel RGB LED-lampen op 3,81 cm afstand van de buitenkant van de bus, die wordt aangestuurd door een Arduino Uno-board dat op het zwarte acrylplatform rust (Figuur 4C).
      4. Meet met een lichtmeter de lichtintensiteit in de gehele binnenzijde van de cilinder en pas de positie van de lampen aan zodat de arena wordt verlicht tussen 3,5–6 µW/mm2. Bevestig buiten het metalen gaas een ring van 850 nm infrarood-LED's met tiewraps aan het frame, naar binnen gericht.
    6. Sluit een USB-kabel aan op het Arduino Uno-board en verbind dit met de computer. Verbind een USB-kabel van de camera met de computer. Schakel de internetverbinding uit.
    7. Plaats de opto-membraanstructuur in een donkere incubator of milieukamer bij 26 °C en 80% relatieve vochtigheid voor de duur van de experimenten.
  2. Voorbereiden van de muskietenbussen
    1. Was de muskietenbussen vóór het experiment door er 70% ethanol op te spuiten en ze voorzichtig af te nemen met een zachte spons. Spoel de bussen met gedeïoniseerd water en laat ze 's nachts aan de lucht drogen.
    2. Sorteer twee dagen vóór het experiment mannelijke en vrouwelijke muskieten onder koude anesthesie en plaats 20 vrouwtjes in elke bus. Zorg voor toegang tot ATR volgens stap 1.6.
    3. Op dit moment moeten de genotypes blind zijn voor de experimentator. De volgorde van de trials moet per dag worden gewisseld om verschillen in gedragsuitkomsten door de timing van het experiment te minimaliseren.
  3. Uitvoeren van trials
    1. Plaats voor de bereiding van de bloedmaaltijd flesjes water van 119 mL in een warmtebad van 45 °C, één voor elke trial. Dit volume en deze temperatuur houden de bloedmaaltijd gedurende het experiment dicht bij de lichaamstemperatuur.
    2. Bereid aliquots van 5 mL gedefibrineerd schapenbloed voor. Bewaar bij 4 °C en keer de buisjes vóór gebruik om om scheiding te voorkomen. Maak de bloedmaaltijd vers vóór elk experiment.
      WAARSCHUWING: Ga om met gedefibrineerd schapenbloed terwijl u de juiste PBM draagt om blootstelling aan pathogenen te minimaliseren. Herbruikbare materialen die in contact komen met bloed moeten worden geweekt in 10% bleekmiddel en worden gespoeld met DI-water. Omdat bleekmiddel ernstige huid- en oogirritatie kan veroorzaken, moeten tijdens de behandeling passende PBM worden gedragen.
    3. Plaats de eerste bloedaliquot ten minste 20 min vóór de trial in een warmtebad van 45 °C. Ontdooi de ATP op ijs. Span een vierkant van 5,08 cm bij 5,08 cm parafilm over het acryldeksel aan de zijde met de grotere, platte cirkel, waardoor een reservoir voor de bloedmaaltijd ontstaat (Figuur 4A).
    4. Neem de computer af met 70% ethanol om menselijke geuren te verwijderen. Verbind de computer met een externe harde schijf. Verbind de camera en de Arduino. Sluit de RGB- en infraroodlampen aan op een stroombron.
    5. Open de SpinView-software en het Arduino-bestand voor de betreffende stimulus. Maak een map aan op de externe harde schijf voor de experimentele gegevens. Upload het Arduino-bestand “blue_only.io” om een zwak blauw 471 nm licht van de RGB-LED's in de arena te brengen (volgens Figuur 4B).
    6. Inspecteer de bus voor de trial en noteer eventuele sterfgevallen vóór het experiment, zonder de muskieten bloot te stellen aan overmatig CO2 uit de ademhaling. Plaats de bus in het midden en laat deze 10 tot 20 min acclimatiseren onder zwak blauw licht vóór blootstelling aan de stimulus.
      ​OPMERKING: De acclimatisatiestap en het experiment worden uitgevoerd onder zwak blauw licht omdat volledige duisternis het vliegen van de muskiet remt.
    7. Activeer videocapture
      1. Selecteer in het SpinView-programma de camera. Pas in het tabblad Settings de belichting en gain aan naar behoefte om een hoog contrast te behouden tussen de lichtgekleurde insecten en de donkere achtergrond (Figuur 4D).
      2. Klik op de rode opnameknop in de bovenbalk om de instellingen voor videocapture aan te passen. Stel het bestandspad in door op Browse te klikken en navigeer vervolgens naar de externe harde schijf. Maak voor elke trial een nieuwe map aan met een beschrijvende naam. Gebruik geen spaties in de mapnaam.
      3. Selecteer in het tabblad Save Options de optie Capture 0 frames, waardoor de video kan worden opgenomen tot deze handmatig wordt gestopt. Selecteer onder Recording Mode de optie Buffered. Stel in het tabblad Videos de volgende velden in: Video Recording Type: MJPG, Video File Split Size: 1000 MB, en JPEG Compression Quality: 65.
    8. Pipetteer onmiddellijk vóór blootstelling aan de stimulus 500 µL van 20 mM ATP in de voorbereide 5 mL bloedaliquot, voor een eindconcentratie van 2 mM ATP. Keer de buis meerdere keren om om te mengen.
    9. Giet de ATP-bloedoplossing in de container voor de bloedmaaltijd. Plaats bovenop de bloedmaaltijd een omgekeerde fles van 119 mL gevuld met water van 45 °C om de temperatuur van het bloed gedurende het experiment dicht bij de menselijke lichaamstemperatuur te houden.
    10. Selecteer in de SpinView-software Start Recording. Plaats de bloedmaaltijd zonder de muskieten te stimuleren met de ademhaling bovenop het gaasdeksel van de bus, zodat de muskieten door het gaas door het parafilm-membraan kunnen steken.
    11. Upload het Arduino programma voor “1sON_10sOFF.io” (Figuur 4B), of de gewenste stimulus. Dit zal elke 10 s gedurende 1 s 624 nm rood licht leveren, totdat het bestand “blue_only.io” handmatig wordt geüpload. De golflengte van 624 nm is voldoende om CsChrimson optogenetisch te activeren.
    12. Plaats de bloedaliquot voor de volgende trial in het warmtebad. Selecteer Stop Recording nadat de trial 15 min heeft gelopen. Upload het bestand “blue_only.io” om de roodlichtstimulus te stoppen.
    13. Verwijder de houder voor de bloedmaaltijd en de waterfles. Verwijder de bus en anestheseer de muskieten bij 4 °C. Keer terug naar sectie 4.3 om aanvullende trials uit te voeren. Inspecteer de geanestheseerde muskieten visueel om het aantal te bepalen en te noteren dat zich heeft gevoed met bloed door te zoeken naar een bloedgevuld abdomen.
  4. Schoonmaken
    1. Sluit alle programma's. Werp de externe harde schijf uit en koppel deze los van de computer. Zet de computer uit.
    2. Reinig de muskietenbussen zoals eerder beschreven in stap 4.2.1. Reinig de acrylhouders voor de bloedmaaltijd. Vul een polycarbonaatpan van half formaat voor 2/3 met water en voeg vervolgens 100 mL bleekmiddel toe.
    3. Voeg de acrylhouders voor de bloedmaaltijd en de plastic flesjes toe aan de pan. Dek af met een deksel en laat 10 min weken. Spoel het bleekmiddel af en verwijder de parafilm. Schrob voorzichtig en spoel na om eventuele bloedresten te verwijderen.

5. Analyse van het gedrag

  1. Bereid de video's voor voor analyse door ze te comprimeren naar .mp4-bestanden met behulp van ffmpeg (versie 8.0.1). Indien de videobestanden zijn opgesplitst, voeg deze dan samen tot één video met behulp van een willekeurige videobewerkingssoftware. Open de trainingsvideo's in SLEAP (versie 1.4.1) in grijstinten.
    ​OPMERKING: Indien de instellingen voor de video-opname correct zijn, zou alles binnen het kader moeten vallen en mogen bewegende muggen niet wazig zijn. Andere software voor het tracken van lichaamsdelen kan worden gebruikt. De SLEAP-versie die in dit artikel is gebruikt, is 1.4.1. Raadpleeg de SLEAP-documentatie voor actuele protocollen.
  2. Maak een skelet waarop de relevante lichaamsdelen van de dieren zijn gelabeld op basis van de gedragingen die worden beoordeeld (Figuur 2D, Figuur 3D, en Figuur 4E).
  3. Gebruik de “Willekeurig frame” optie onder de Voorgesteld frame selecteer willekeurig 10 frames en label elke mug als een instantie. Als bepaalde delen van de mug belemmerd zijn (bijv. wanneer de punt van de snuit tijdens het prikken in het gaas is gestoken), label dan de geschatte locatie van het lichaamsdeel. Train een model op de gelabelde frames met deze instellingen
    1. Voor een top-down multi-diermodel (gebruikt voor het opto-thermocycler- en bloeddekenmodel): In de Trainingspijplijn tab, set Maximaal aantal instanties naar 14Stel in het tabblad Centroid Model Configuration in: Uitsnedemaat naar Auto, en stel in Plateau Min. Delta naar 1e-04, set Plateau Patience naar 10, set Paslengte naar 8, en de Ankergedeelte als thorax.
    2. Voor een bottom-up multi-diermodel (gebruikt voor de opto-membraanvoeder): In de Trainingspijplijn tab, set Maximaal aantal instanties naar geen maxIn het tabblad Bottom-Up Model Configuration stelt u in Uitsnedeformaat naar Autoen stel in Plateau Min. Delta naar 1e-04, set Plateau Patience naar 10, en stel in Paslengte naar 16.
  4. Voer voorspellingen uit op een vastgesteld aantal frames met deze instellingen: stel in het tabblad Inference Pipeline voor de opto-thermocycler en het bloeddekten in Maximale instanties naar 14, Tracker naar Eenvoudig, Maximaal aantal sporen naar 14, en Verbind enkelstrengsbreuken naar Waar.
  5. Stel voor de opto-membraanvoeder in Geen max voor Maximaal aantal instanties en Maximaal aantal sporen, Tracker naar Eenvoudig, en Enkelstrengsbreuken verbinden naar WaarCorrigeer de voorspelde frames en train opnieuw. Herhaal cycli van voorspelling, labeling en training op de trainingsdataset.
    OPMERKING: De validatie werd uitgevoerd door willekeurige steekproeven van gelabelde frames te controleren en consistente fouten te identificeren (bijv. foutieve detecties van muggen, dubbele voorspellingen, onjuiste oriëntatie of onjuiste toewijzingen van lichaamsdelen), waarbij de focus lag op frames die deze uitzonderingsgevallen bevatten. Afhankelijk van de foutfrequentie kunnen tot 150 gelabelde frames nodig zijn. SLEAP biedt daarnaast GUI-gebaseerde evaluatiemetrieken voor aanvullende modelvalidatie. Zodra visuele inspectie een voldoende nauwkeurigheid en precisie bevestigt, kan het model worden toegepast op experimentele video's, waarna de resultaten als .csv- of .h5-bestanden kunnen worden geëxporteerd voor gedragsanalyse. Gedragsclassificatoren kunnen vervolgens worden getraind met behulp van de output van de pose-estimatie, zoals eerder beschreven.8Gedragingen worden als volgt gedefinieerd: lopen, translationele lichaamsbeweging met beweging van de poten; vliegen, snelle translationele beweging met uitgestrekte vleugels; poetsen, repetitieve bewegingen van de poten over lichaamsdelen (antennae, proboscis, vleugels of poten); en sonderen, het insteken van de proboscis door het gaas aan de onderkant van de container. Gedragclassificatoren moeten het volgende bereiken: >90% nauwkeurigheid vergeleken met menselijke annotaties.
  6. Voer de statistische analyse uit door non-parametrische toetsen te kiezen, aangezien de gegevens gewoonlijk niet normaal verdeeld zijn. Voer de passende post-hoc toetsen uit met correctie voor meervoudige vergelijkingen. Voor de gegevens over verzadiging zijn de experimentele replica's groepen muggen, terwijl voor de gedragsgegevens de replica's individuele muggen zijn.

Resultaten

Drie gedragstesten werden gebruikt om het gastheerzoekend en bloedzuigend gedrag bij muggen te observeren, zoals weergegeven in Figuur 1A. Muggen werden gekweekt onder een blauw-licht-donkercyclus (14:10 LD; Figuur 1B) om de circadiane ritmes te synchroniseren, zodat experimenten tijdens de waakperioden konden worden uitgevoerd. Twee dagen voor de experimenten werden de muggen overgebracht naar volledige duisternis en voorzien van de opsine-cofactor ATR. Indien muggen asynchroon zijn of geen ATR hebben gekregen, vertonen zij een lage activiteit in gedragstesten. De genotypen die voor elke test werden gebruikt, waren Gr3>CsChrimson en twee genetische controles: de driverlijn Gr3-QF2 en de effectorlijn QUAS-CsChrimson.

De opto-thermocycler-assay (Sectie 2) maakt het mogelijk om de arousal en het sondeergedrag van muggen over langere perioden te beoordelen als reactie op warmte- en lichtstimuli. De toediening van warmte bootst de benadering van een warmbloedige gastheer door de mug na, terwijl de lichtpuls van 5 seconden een lange uitademing bootst33. Het gebruik van een thermocycler maakt snelle oppervlakteverwarming en -koeling mogelijk die via een thermokoppel en microcontroller wordt gesynchroniseerd met optogenetische activatie (Figuur 2A, B). De drie muggen-genotypes werden geplaatst in acrylplaten met geïsoleerde putjes met bodems van gaas, waarin zij loop-, vlieg- en sondeergedrag vertonen (Figuur 2C). De positie van de lichaamsdelen van de mug werd gedetecteerd met pose-tracking-algoritmen, zoals SLEAP34  en DeepLabCUT35 (Figuur 2D, E). Algoritmen voor gedragsclassificatie kunnen worden gebruikt op basis van pose-tracking (bijv. SimBA36 , A-SOiD37) of video-input (bijv. FERAL38). Figuur 2E toont de SLEAP-labels tijdens het vliegen, lopen en sonderen, essentiële gedragingen bij het zoeken naar een gastheer en bij het voeden. Deze gedragingen kunnen worden geclassificeerd op basis van de snelheid van het thorax en de afstand tussen de basis en de punt van de proboscis. Hier wordt de output van gedragstracking met behulp van APT en JAABA getoond39. Muggen werden blootgesteld aan respectievelijk een temperatuurstijging, een lichtstimulus, of gelijktijdige warmte- en lichtstimuli, gevolgd door een rustperiode van 20 min vóór de volgende stimulus8 (Figuur 2F). Bij blootstelling aan warmte vertonen alle drie de genotypes een korte periode van sonderen (Figuur 2G). Belangrijk is dat de Gr3>CsChrimson-muggen bij blootstelling aan een lichtstimulus van 5 seconden in een staat van arousal raken of "geactiveerd" worden, waarbij zij een toegenomen loop- en vlieggedrag vertonen dat tot 10–15 min aanhoudt. Muggen vertonen ook sondeergedrag, wat wordt gedefinieerd als het herhaaldelijk insteken van de proboscis in de gaasbodem van de platen. Gegevens werden uitgezet als het gedrag van individuele muggen (Figuur 2G) en de proportie van alle muggen die elk gedrag in de loop van de tijd vertoonden (Figuur 2H). De opto-thermocycler maakt herhaalde, precieze optogenetische en thermische stimulatie van meerdere individuen mogelijk, waardoor het een nuttig instrument is voor het bestuderen van arousal en sondeergedrag.

De blood blanket assay (Sectie 3) is gebaseerd op de opto-thermocycler assay, maar biedt een smakelijke kunstmatige minimale bloedmaaltijd zodat de verzadiging van de muggen gekwantificeerd kan worden (Figuur 3A). Een puls van 5 seconden rood licht (~627 nm) werd toegediend om de CO2-sensory neuronen optogenetisch te activeren, en de dunne laag kunstmatige bloedmaaltijd werd verwarmd van 25 °C naar ~35 °C (gemeten aan het oppervlak met een thermokoppel; Figuur 3B). De drie genotypen kregen elk een kunstmatige bloedmaaltijd gepresenteerd in een aluminium voedingsplaat (Figuur 3C). Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson en Gr3>CsChrimson muggen (n = 10 trials per genetische groep, 14 muggen per trial) kregen elk een kunstmatige bloedmaaltijd gepresenteerd in een aluminium voedingsplaat (Figuur 3C). Om de verzadiging van de muggen gedurende het experiment in de tijd te meten, werd SLEAP gebruikt om punten op het lichaam van de mug te tracken. Dit werd gedaan door een skelet te maken met 5 knooppunten op het abdomen van de mug (Figuur 3D). Aan het einde van elke trial werd het aantal verzadigde muggen handmatig geteld. De controlelijnen van de muggen, Gr3-QF2 en QUAS-CsChrimson, vertoonden een vergelijkbare gemiddelde verzadiging (Figuur 3E, p = 0,401). In contrast vertoonde de Gr3>CsChrimson lijn significant hogere voedingspercentages, met een gemiddelde verzadigingsgraad van 53% (Figuur 3E, p = 0,00078 versus Gr3-QF2 en p = 0,00097 versus QUAS-CsChrimson). Data werden weergegeven als violin plots en boxplots (mediaan, interkwartielafstand en bereik) en geanalyseerd met de Kruskal-Wallis test en een Dunn Test met Holm-correctie bij een significantiedrempel van p < 0,05. De verzadiging van individuele dieren in de tijd werd geïdentificeerd als de verandering in het abdominale oppervlak omsloten door 5 knooppunten (Figuur 3F). Deze resultaten tonen aan dat de blood blanket assay kan worden gebruikt om de effecten van optogenetische activatie van CO2-responsieve neuronale populaties op het verzadigingsgedrag van muggen bij een kunstmatige bloedmaaltijd te beoordelen.

De opto-membraanvoeder-assay (Sectie 4), waarbij muggen toegang krijgen tot een warme bloedmaaltijd in een cilindrische arena, maakt het mogelijk om de attractie van muggen naar een bloedbron en de verzadiging (engorgement) te bestuderen. Om te bepalen of optogenetische activatie van CO2 sensory neuronen voldoende is om attractie naar en voeding uit een bloedbron te veroorzaken, kregen Gr3>CsChrimson en controlemuggen (n = 10 voor elk genotype, waarbij n verwijst naar het aantal uitgevoerde trials, met 20 muggen per canister per trial) toegang tot een warme bloedmaaltijd in de opto-membraanvoeder onder blootstelling aan een herhaalde puls van 1 seconde helder rood licht om de 10 s gedurende een periode van 15 min (Figuur 4B). Om de attractie naar de membraanvoeder te meten, werd een SLEAP-model met drie punten gebruikt om de kop, thorax en abdomen van gelande muggen te volgen, waarbij de muggen binnen het interessegebied werden geteld (Figuur 4D, Figuur 4E). Gr3>CsChrimson muggen vertoonden in de loop van de tijd een verhoogde attractie naar het gebied van de bloedmaaltijd vergeleken met de Gr3-QF2 controle (Figuur 4F, p = 0,027). De Gr3>CsChrimson muggen vertoonden geen statistisch hogere attractie dan de QUAS-CsChrimson (Figuur 4F, p = 0,310). Significantiegroepen werden bepaald met de Kruskal-Wallis-test, gevolgd door de Dunn-test met Holm-correctie. De significantiedrempel werd vastgesteld op p < 0,05. Gegevens werden uitgezet als het gemiddelde percentage muggen dat werd aangetrokken door de bloedmaaltijd, waarbij het gearceerde gebied de standaardfout weergeeft. De controlegenotypes Gr3-QF2 en QUAS-CsChrimson vertoonden een vergelijkbare verzadiging van respectievelijk 26% en 29%, handmatig gescoord zoals beschreven (Figuur 4G, p = 0,351). In contrast hiermee vertoonden Gr3>CsChrimson muggen een significant hogere verzadigingsgraad dan beide controles, gemiddeld 61% (Figuur 4G, p < 0,001 versus Gr3-QF2 en p = 0,002 versus QUAS-CsChrimson). Gegevens werden uitgezet als violin plots en boxplots (mediaan, interkwartielafstand en bereik) en geanalyseerd met de Kruskal-Wallis-test en een Dunn-test met Holm-correctie bij een significantiedrempel van p < 0,05. Deze resultaten geven aan dat de opto-membraanvoeder-assay een levensvatbare methode is om de effecten van optogenetische activatie van CO2 neuronen op de attractie van muggen en de verzadiging bij een bloedmaaltijd te beoordelen.

Diagram van mosquito-gedragsassay; methoden: opto-thermocycler, bloeddeken; stimuli: hitte, CO2.
Figuur 1: Assays en opkweek voor optogenetica bij muggen. (A) Schema van het gastheerzoekend gedrag van muggen met de kenmerken van de gepresenteerde gedragsassays. De stappen van het gastheerzoeken die door elke gedragsassay worden gemeten, zijn aangegeven met grijze balken. (B) Tijdlijn van de opkweek van muggen voor optogenetica-experimenten. Figuur 1 is door de auteurs voor deze publicatie gemaakt met Adobe Illustrator, en er is geen licentie vereist voor het gebruik ervan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Muggengedrag, infrarood thermocycler, LED-rood licht opstelling, grafiekanalyse, stimulusrespons.
Figuur 2: De opto-thermocycler kwantificeert opwinding en zoekgedrag tijdens optogenetische activatie. (A) Schema van de opto-thermocycler-assay, bestaande uit een plaat met muggen op het blok van een PCR-thermocycler met overhead-LED's en een camera. (B) Schakelschema voor de microcontroller die de temperatuur van de thermocycler detecteert en de LED's aanstuurt. Schakelschema gemaakt met Fritzing onder CC-BY-SA 3.0-licentie (https://github.com/fritzing/fritzing-app/blob/develop/README.md). Deze licentie staat ook volledig hergebruik van de afbeelding toe, mits de juiste bronvermelding wordt gegeven. (C) Stilstaand beeld van de assay waarop de acrylplaat te zien is die tot 14 muggen kan bevatten. Het thermokoppel bevindt zich in het kuiltje rechtsonder. (D) Het muggen-skelet dat wordt gebruikt in het SLEAP-model om poses te schatten. Gemarkeerde punten op het lichaam zijn: de punt en de basis van de proboscis, gebruikt om probeergedrag te detecteren (in rood weergegeven); de voorpoten, waar ze verbonden zijn met de thorax, waar het femur aansluit op de tibia, en waar de tibia aansluit op de tarsus (in blauw weergegeven); en de punt van het abdomen (in geel weergegeven). Er werd gebruikgemaakt van een top-down multi-animal model. Pose-estimators en gedragsclassificatoren werden gebruikt om de opwinding en het probeergedrag van de muggen te kwantificeren. (E) Voorbeelden van lopen, vliegen en proberen van de mug, met daarop de SLEAP-voorspellingen geprojecteerd. Lopen en vliegen worden gebruikt als gedragsmaten voor opwinding. (F) Output van de stimulusafgifte. Gele golvende lijnen geven lichaamstemperatuur-warmtestimuli aan, en rode LED's geven rood lichtstimuli aan. (G) Ethogrammen van loop-, vlieg- en probeergedrag van Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson en Gr3>CsChrimson muggen (n = 22–23 individuele muggen per genotype) na stimulusafgifte. (H) Langdurig gedrag na optogenetische activatie bij Gr3>CsChrimson muggen (n = 68–70 individuele muggen). Figuurpanelen A–E zijn door de auteurs voor deze publicatie gemaakt met Adobe Illustrator, en er is geen auteursrechtlicentie vereist voor het gebruik. Gegevens in (F–H) zijn gereproduceerd uit Sorrells et al, 2022, met CC BY 4.0-licentie8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Opstelling van het muggenvoedingsexperiment, data-analysegrafieken, diagram van een kunstmatige bloedmaaltijd, temperatuurgrafiek.
Figuur 3: De blood blanket assay kwantificeert de verzadiging na optogenetische activatie. (A) Schema van de blood blanket assay. De mug bevindt zich in een acrylkooi waarin toegankelijk kunstmatig bloed wordt aangeboden onder een gaasscherm. (B) Uitlezing van temperatuur en rood lichtstimulus van de assay. (C) Schema van de aluminium blood blanket voedingsplaatassemblage. (D) Het SLEAP-skelet dat werd gebruikt voor pose-estimatie omvatte de punten beschreven in Figuur 2D, aangevuld met vier punten langs de zijkanten van het abdomen waar deze aansluiten op de thorax, en de randen van het dikste deel van het abdomen. Verzadiging werd gemeten als het oppervlak binnen de vijf punten langs de omtrek van het abdomen met behulp van voorspellingen van een top-down multi-animal model. (E) Violin plot die het gemiddelde percentage verzadiging van de kunstmatige bloedmaaltijd per genotype weergeeft (n = 10 trials van 14 muggen per trial per genotype). Significantie werd bepaald met de Kruskal-Wallis test, gevolgd door een Dunn Test met Holm-correctie. Verschillende letters geven een significantie van p < 0,05 tussen groepen aan, waarbij groepen met dezelfde letter niet significant van elkaar verschillen. (F) Verzadiging in de loop van de tijd bij een Gr3>CsChrimson dier, gemeten aan de hand van het abdominale oppervlak. De rode trendlijn toont een sliding window van 30 seconden over acht minuten van de trial, waarbij x = 0 het tijdstip markeert waarop de verzadiging begint. Alle schema's in Figuur 3 zijn door de auteurs voor deze publicatie gemaakt met Adobe Illustrator, en een auteursrechtenlicentie was niet vereist voor hun gebruik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Opstelling voor mug-optogenetica; RGB-lichtregeling; Arduino; bloedmaaltijd; grafiek van attractiepercentage; resultaten.
Figuur 4: De opto-membraanvoeder-assay meet attractie en bloedvoeding. (A) Schema van de opto-membraanvoeder met individuele componenten. (B) Tijdlijn van de experimentele proeven. De blauwe lijn vertegenwoordigt zwak blauw licht gedurende de hele acclimatisatieperiode en het experiment. Er wordt een segment van de experimentele stimulus getoond, bestaande uit pulsen van 1 s rood licht met een tussenpoos van 10 s. (C) Diagram met de bedrading voor de opto-membraanvoeder. Schakelschema gemaakt met Fritzing onder CC-BY licentie door de auteurs. (D) Voorbeeldframe uit de video van de opto-membraanvoeder. Muggen in de rode cirkel worden geteld om het attractiepercentage te bepalen. (E) Voorbeelden van een ongevoede mug en een verzadigde mug, waarbij de kop, thorax en abdomen zijn gelabeld door het SLEAP-trackingmodel voor de opto-membraanvoeder. Een bottom-up multi-animal SLEAP-model werd gebruikt om de attractie naar het interessegebied te meten waar de bloedmaaltijd is geplaatst. (F) Lijngrafiek die het gemiddelde bezettingspercentage op het gebied van de bloedmaaltijd weergeeft (wat wordt gebruikt als gedragsmatige metriek voor landing) over de tijd, per genotype (n = 10 proeven van 20 muggen per genotype). Het gemiddelde is elke 30 s uitgezet. Gearceerde gebieden geven de standaardfout aan. Significantie werd bepaald met de Kruskal-Wallis test, gevolgd door de Dunn Test met Holm-correctie. Verschillende letters vertegenwoordigen significante groepen; de drempelwaarde werd gedefinieerd als p < 0,05. (G) Violinplot die het gemiddelde percentage verzadigde muggen op een bloedmaaltijd weergeeft per genotype. In (F, G) werd significantie bepaald met de Kruskal-Wallis test, gevolgd door de Dunn Test met Holm-correctie. Genotypes die met dezelfde letter zijn vermeld, verschillen niet significant van elkaar. De significantiedrempel is gedefinieerd als p < 0,05. Figuur 4 is gemaakt met Adobe Illustrator, de gegevens hiervan zijn door de auteurs verzameld voor deze publicatie en er was geen auteursrechtlicentie vereist voor het gebruik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft gedetailleerde protocollen voor het testen van de adequaatheid van neuronale celtypen om stappen in de aantrekking van de gastheer en het bijten aan te sturen. Bijtgedrag bestaat uit een reeks gedragsstappen, van detectie op lange afstand tot aantrekking op korte afstand, het doorboren van de huid en het volzuigen. In principe zouden neuronale typen specifieke acties of stappen kunnen controleren, het gedrag kunnen sturen richting specifieke sequenties, de duur van het gehele gedrag kunnen verlengen of vele andere rollen kunnen spelen. Daarom zijn de verschillende gepresenteerde tests noodzakelijk om de neuronale functie in dit proces te ontleden.

Verschillende veelvoorkomende fouten kunnen leiden tot geringe respons van muggen in deze assays. Lage activiteit en beperkt voeden kunnen worden voorkomen door experimenten uit te voeren tijdens de piekactiviteit van de muggen, nabij de overgangstijden tussen de licht- en donkercycli in hun incubatiekamers. Lage voedingspercentages in het bloeddeken en de opto-membraanvoeder kunnen worden veroorzaakt door een kunstmatige bloedmaaltijd van slechte kwaliteit of een onjuiste temperatuur. Controleer of alle reagentia (NaHCO3, ATP, gedefibrineerd schapenbloed) niet zijn verlopen en correct bewaard zijn. Het wordt aanbevolen om alle oplossingen op de dag van het experiment te bereiden om maximale versheid te garanderen. Zorg ervoor dat de bloeddekenplaat direct contact maakt met het oppervlak van het PCR-thermocyclerblok. De platen van de opto-thermocycler en het bloeddeken kunnen condensvorming vertonen als er restvocht aanwezig is. Plaats de platen voor de experimenten op papieren handdoeken om eventueel vocht te absorberen. Bij een geringe optogenetische respons moet worden gecontroleerd of de muggen ten minste één week oud zijn en voldoende tijd hebben gekregen om ATR op te nemen, aangezien dit een noodzakelijke chemische cofactor is voor de CsChrimson-kanalen.

Er zijn optogenetische instrumenten ontwikkeld die gevoelig zijn voor golflengten van blauw (~450 nm) tot rood (~650 nm), waardoor het zichtbare spectrum wordt beslagen. Rood licht is bijzonder nuttig bij insecten, omdat zij doorgaans een lage gevoeligheid en/of minimale gedragsreacties vertonen bij deze golflengten40. Interessant genoeg vertonen muggen tijdens de vlucht een attractie naar gebieden met visuele stimuli met lange golflengten die aanwezig zijn in menselijke huidtinten41. Het gebruik van rood licht zou dus een beperking kunnen vormen die de interpretatie van optogenetische activatie in assays voor gastheerattractie bij muggen beïnvloedt. Genetische controle muggen vertoonden echter minimale reacties op breed toegepast rood licht, zelfs bij sterke intensiteiten (Figuren 2–4). Genetische controles waarin ofwel de driver- of de effector-constructen ontbreken en controles zonder licht worden aanbevolen om te waarborgen dat gedragseffecten nauwkeurig worden geïnterpreteerd. Een controle waarin de rhodopsine-cofactor ATR ontbreekt, wordt vaak gebruikt voor optogenetische experimenten in andere soorten; het visvoer dat wordt gebruikt om muggenlarven te voeden bevat echter vitamine A, de precursor van ATR, waardoor dit een minder effectieve controle is in dit systeem.

De optogenetische stimuli die hier worden gepresenteerd, zijn beperkt tot continue stimuli met een instelbare lichtintensiteit. Optogenetische stimuli die natuurlijke neuronale activiteitspatronen nauwkeurig nabootsen, hebben de grootste kans om het gewenste gedrag op te wekken. Daarom kan de stimulus, indien neurale opnames beschikbaar zijn, worden ontworpen om overeen te komen met de waargenomen intensiteit en temporele dynamiek. Wanneer dit niet bekend is, kan de functie van neuronen worden gescreend met behulp van verschillende stimuli en gedragscontexten, met de kanttekening dat de resultaten mogelijk de functie van neuronen bij natuurlijk gedrag niet weerspiegelen. Desalniettemin kan het stimuleren van neuronale activiteit buiten het natuurlijke bereik worden gebruikt om circuits of gedragseigenschappen op unieke manieren te onderzoeken, net zoals elektrofysiologie kan worden gebruikt om cellulaire eigenschappen te onderzoeken. Momenteel zijn optogenetische instrumenten alleen gebruikt in sensorische neuronen van de mug, een toepassing die enkele voordelen biedt ten opzichte van het toedienen van natuurlijke stimuli. Traditionele strategieën voor het meten van het gastheerzoekgedrag van muggen vertrouwen op de toediening van echt CO2-gas. Het gebruik van echt CO2 vereist een luchtstroom die is gefilterd en bevochtigd, wat complexe experimentele opstellingen vereist om dit nauwkeurig te kunnen toedienen en verwijderen in korte tijdsintervallen9,10,42,43. Luchtstroom en vochtigheid zijn beide signalen voor de aantrekking en navigatie van muggen, waardoor optogenetische toediening een aantrekkelijke methode is om de effecten van olfactorische stimuli afzonderlijk van deze andere stimuli te bestuderen. Optogenetische instrumenten zijn eerder ook gebruikt om het effect van geslacht en fysiologische toestand op het gedrag te bestuderen8, wat inzicht verschaft in deze belangrijke vragen binnen de biologie van de mug.

Naast optogenetica maken deze protocollen gebruik van standaardassays die zijn ingezet om het gedrag van muggen te beoordelen en die gepaard gaan met enkele beperkingen. Voor een eenvoudige reiniging maakt de blood blanket gebruik van een kunstmatige maaltijd die alleen de smaakstoffen bevat die nodig zijn voor muggen om zich te volzuigen. Deze beperking zou kunnen worden overwonnen door het gebruik van bloed (zoals in de opto-membrane feeder) of biomimetische materialen die aspecten van gastheerweefsel nabootsen. De warmte in de opto-thermocycler en de blood blanket wordt geleverd aan lopende of staande muggen in plaats van vliegende muggen en wordt beperkt door de opwarmingssnelheid van de PCR-thermocycler. Daarom kunnen deze assays sonderings- en volzuigingsgedrag detecteren, maar geen aantrekking. Een andere beperking van lab-gebaseerde assays is dat om het gedragseffect van specifieke signalen te begrijpen, andere signalen die muggen gebruiken worden uitgesloten. Er zouden steeds complexere lab-assays en semi-veldassays kunnen worden ontwikkeld om aanvullende aspecten van de naturalistische omgevingen te bestuderen waarin muggen zich voeden met hun gastheren.

Een andere beperking van optogenetica bij de mug is dat er weinig driver-lijnen zijn ontwikkeld buiten die voor sensorische neuronen. Het volledige potentieel zal daarom pas worden gerealiseerd wanneer het wordt gecombineerd met drivers die tot expressie komen in interneuronen die niet direct gestimuleerd kunnen worden door andere methoden. Nieuw opkomende bronnen, zoals de Aedes aegypti Mosquito Cell Atlas, openen de deur naar vooruitgang in de neurogenetica van muggen44. Toekomstig werk zal nodig zijn om dergelijke drivers te ontwikkelen voor het onderzoeken van neurale circuits bij muggen. Evenzo zijn extra optogenetische instrumenten voor inhibitie nodig om vast te stellen of een specifiek neurontype noodzakelijk is voor een bepaald gedrag. Hoewel de in dit artikel gepresenteerde assays zijn ontworpen om de aantrekking van gastheren en bloedvoeding te meten, zouden deze benaderingen kunnen worden uitgebreid om aanvullende stappen van het zoeken naar een gastheer en gedragingen zoals paring, ovipositie en nectarvoeding te bestuderen. Optogenetische studies zullen nieuw inzicht verschaffen in hoe het gedrag van muggen op het niveau van het neurale circuit wordt aangestuurd en kunnen leiden tot nieuwe benaderingen om de verspreiding van door muggen overgedragen ziekten te voorkomen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te melden.

Dankbetuigingen

Wij danken Kim Lezon-Geyda, Fernanda Medeiros Contini en Yaoyu Jiao voor hun commentaren op het manuscript. Dit onderzoek werd gefinancierd door NIH-beurs DP2AI177891. Wij danken de Neurotechnology Core, gefinancierd door het Yale Kavli Institute for Neuroscience, voor het technisch advies. T.S. is een HHMI Freeman Hrabowski Scholar.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1⁄8 Inch Zwart AcrylMcMaster-Carr8650K32Structuur van opto-membraanvoeder
1⁄8 Inch Helder AcrylMcMaster-Carr8536K134Canister van opto-membraanvoeder
¼ Inch Zwart AcrylMcMaster-Carr8560K259Structuur van opto-membraanvoeder
AC-adapterJameco ReliaPro2197581Structuur van opto-membraanvoeder
AcryllijmUnited States Plastic Corp 97562Canister van opto-membraanvoeder, kooi voor bloeddeken
Adenosine 5′-trifosfaat dinatriumzout hydraatSigma AldrichA6419-1GKunstmatige bloedmaaltijd
All-Trans-RetinaalSpectrum ChemicalR3041-1GMOptogenetische kweek
Aluminium breadboardThorlabsMB12Structuur van opto-membraanvoeder
Aluminium plaat 0.03125 inMcMaster-Carr89015K11Voedingsplaat voor bloeddeken
Aluminium plaat 0.0625 inMcMaster-Carr89015K37Voedingsplaat voor bloeddeken
Animal Part Tracker (APT)Branson lab at HHMI Janelia FarmN/AVersie 3.0, gereproduceerde data opto-thermocycler (Figuur 2), gedownload op 9 juli 2020
Arduino IDEArduinoN/AVersie 1.8.12, gebruikt voor stimuluscontrole voor opto-thermocycler, bloeddeken & opto-membraanvoeder
Arduino Uno Rev3 microcontrollerboardArduinoA000066 Programmering opto-membraanvoeder
Zwart glasvezel raamgaasBreakthrough Premium Products IHLRS3684BLKooi voor bloeddeken
Zwarte tapeThorlabsT137-2.0Opto-thermocycler
Zwarte kabelbinders Cable Ties And Morect242Structuur van opto-membraanvoeder
VerduisteringsgordijnSet Shop6520SFOpto-thermocycler en bloeddeken
Blauwe LED-lampen21LEDUSARB5730BLWPKweek van muggen
FlesSKS Bottle & Packaging0604-07Bloedverwarmer voor opto-membraanvoeder
Bodemvoer-pelletsAPI5352983Voeden van larven
CameraBlackflyU3-13S2M-CS, FLIVideo-opname voor assays
KliktellerULineH-7350Uitdunnen van larven
ComputerAsus X1407QUitvoeren van assays
Geconcentreerde bleek (8.25% natriumhypochloriet)VWR89501-620Reiniging opto-membraanvoeder
CoolTermRoger Meier's FreewareN/AVersie 2.0.1, gebruikt voor seriële poortregistratie voor opto-thermocycler, bloeddeken & opto-membraanvoeder
Gedefibrineerd schapenbloed Hemostat Laboratories DSB100Bloedmaaltijd voor opto-membraanvoeder
Koepelvormige zeskantbout 4-40McMaster-Carr92949A105Voedingsplaat voor bloeddeken
EpoxyLoctite1363118Acrylplaat opto-thermocycler, structuur van opto-membraanvoeder
EthanolDecon Labs2716Sanitatie
Externe harde schijfLaCieLAC9000298Videopslag
ffmpegFFmpegN/AVersie 8.0.1, video-voorverwerking
Katoenen lont van vier inchRichmond Dental201226Voeden van volwassen muggen
GitHubGitHub, IncN/ARepositories voor code, onderdeelbestanden en SLEAP-modellen voor opto-thermocycler (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0), bloeddeken (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/bloodblanket/releases/tag/v1.0.0), en opto-membraanvoeder (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0)
Gr3>CsChrimsonN/AN/AGemaakt voor deze studie, beschreven in stap 1.2
Gr3-QF2 muggenN/AN/AGenetisch reagens, DOI: 10.1016/j.cell.2013.12.044
Incubator met ondoorzichtige deurCaron7340-25Kweek van muggen
Infrarood LED-lampAdafruit387Opto-thermocycler en bloeddeken
Infrarood LED-stripWaveform Lighting7031.85Opto-thermocycler, bloeddeken en opto-membraanstructuur
Infrarood-doorlaatfilterEdmund Optics65-796Video-opname voor assays 
InsectenkooiBugdormDP1000Behuizing voor volwassen muggen
Janelia Automatic Animal Behavior Annotator (JAABA)Branson lab at HHMI Janelia FarmN/AGereproduceerde data opto-thermocycler (Figuur 2); Versie 0.5.0
Grote soepbekerWebstaurantStore50016SOUPPLAKweek van muggen
LED-koelblokLuxeon StarN25-15BOpto-thermocycler en bloeddeken
LED-lensLuxeon Star10209Opto-thermocycler en bloeddeken
LED-lenshouderLuxeon Star10235Opto-thermocycler en bloeddeken
LED-lenstapeLuxeon StarLT-01Opto-thermocycler en bloeddeken
LED-lampLuxeon StarSP-01-D9Rode lichtstimulus voor opto-thermocycler en bloeddeken
LED-thermische tapeLuxeon StarLXT-S-12Opto-thermocycler en bloeddeken
Optische constructierailsThorlabsXE25L12, XE25L24, XE25L09, XE25T4, RA90, TRA6, TR12Structuur van opto-thermocycler en bloeddeken
Optische post ThorlabsTR12Structuur van opto-membraanvoeder
Papieren handdoekenPacific Blue27385Reiniging van de canister
ParafilmAmcorPM-996Membraan voor bloeddeken, maaltijdcontainer voor opto-membraan
PCR-thermocyclerEppendorf2231001196Opto-thermocycler en bloeddeken
Plastic portiebekerChoice999P2CVoeden van volwassen muggen
Deksel voor plastic portiebekerChoice999PL2Voeden van volwassen muggen
PolycarbonaatpanCambro21410CWCHCLKweek van larven 
Polycarbonaatpan (half formaat)Cambro24CW135 Reiniging van opto-membraanmaaltijd
Deksel voor polycarbonaatpan (half formaat)Cambro20CWCH135 Reiniging van opto-membraanmaaltijd
PolycarbonaatpandekselCambro10CWCH135Kweek van larven
PolycarbonaatbuisMcMaster-Carr8585K56Canister van opto-membraanvoeder 
Power meterCoherent1299161Alle assays
QUAS-CsChrimson muggenN/AN/AGenetisch reagens, DOI: 10.7554/eLife.76663
RGB-lampenDigikey 289-1189-NDStimulusafgifte opto-membraanvoeder
Rechthoekige klemThorlabsRA90Structuur van opto-membraanvoeder
Scotch Magic tape3M104Acryldeksel van opto-thermocycler en bloeddeken
Siliconen pakking, 0.5 mmMcMaster-Carr1460N22Voedingsplaat voor bloeddeken
SLEAPTalmo LabN/AVersie 1.4.1a2, pose-tracking van muggen in elke assay
Natriumbicarbonaat, 1M buffersol., pH 8.0Thermo scientificJ62495.APKunstmatige bloedmaaltijd
NatriumchlorideoplossingSigma-AldrichS5150-1L 100 3532552Kunstmatige bloedmaaltijd
SpinViewTeledyne Vision SolutionsN/AVersie 1.27.0.48, videorecordingssoftware voor alle drie de assays
SpuitflesUlineS-11686Sanitatie
SucroseSigma AldrichS0389-500GVoeden van volwassen muggen
Thermoelement (type T)Harold G Schaevitz Industries LLCCPTC-120-X-NOpto-thermocycler en bloeddeken
ThermoelementversterkerAdafruitMAX31856Opto-thermocycler en bloeddeken
TimerEnduraLightRAC-MTRegeling lichtcyclus voor kweek van muggen
Overbrengpipet Thermo ScientificSAM-225Uitdunnen van larven
VuilniszakUlineS-23040Transport van insecten
UV-bestendig gaasMcMaster-Carr 87655K13Canister van opto-membraanvoeder
WaterSigma AldrichW4502-1LKunstmatige bloedmaaltijd voor bloeddeken
Gevaxte draadMcMaster-Carr6356K91Deksel van opto-membraancanister
DraadgaasMcMaster-Carr9322T65Structuur van opto-membraanvoeder

Referenties

  1. UNICEF, UNDP, World Bank, WHO Special Program for Research and Training in Tropical Diseases. Global vector control response 2017-2030. Geneva: World Health Organization; 2017.
  2. Knight KL, Stone A. A catalog of the mosquitoes of the world (Diptera: Culicidae). Lanham (MD): Entomological Society of America; 1959.
  3. Raji JI, DeGennaro M. Genetic analysis of mosquito detection of humans. Curr Opin Insect Sci. 2017;20:34-38.
  4. Coutinho-Abreu IV, Riffell JA, Akbari OS. Human attractive cues and mosquito host-seeking behavior. Trends Parasitol. 2022;38(3):246-264.
  5. McMeniman CJ, Corfas RA, Matthews BJ, Ritchie SA, Vosshall LB. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 2014;156(5):1060-1071.
  6. Gillies MT. The role of carbon dioxide in host-finding by mosquitoes (Diptera: Culicidae): a review. Bull Entomol Res. 1980;70(4):525-532.
  7. Geier M, Bosch O, Boeckh J. Influence of odor plume structure on upwind flight of mosquitoes towards hosts. J Exp Biol. 1999;202(Pt 12):1639-1648.
  8. Sorrells TR, Pandey A, Rosas-Villegas A, Vosshall LB. A persistent behavioral state enables sustained predation of humans by mosquitoes. eLife. 2022;11:e76663.
  9. Dekker T, Geier M, Cardé RT. Carbon dioxide instantly sensitizes female yellow fever mosquitoes to human skin odors. J Exp Biol. 2005;208(15):2963-2972.
  10. van Breugel F, Riffell J, Fairhall A, Dickinson MH. Mosquitoes use vision to associate odor plumes with thermal targets. Curr Biol. 2015;25(16):2123-2129.
  11. Liu MZ, Vosshall LB. General visual and contingent thermal cues interact to elicit attraction in female Aedes aegypti. mosquitoes. Curr Biol. 2019;29(13):2250-2257.e4.
  12. Chandel A, DeBeaubien NA, Ganguly A, et al. Thermal infrared directs host-seeking behavior in Aedes aegypti. mosquitoes. Nature. 2024;633(8030):615-623.
  13. Tang R, Busby R, Laursen WJ, Keane GT, Garrity PA. Functional dissection of mosquito humidity sensing reveals distinct Dry and Moist Cell contributions to blood feeding and oviposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(35):e2407394121.
  14. Burgess L. Probing behavior of Aedes aegypti. (L.) in response to heat and moisture. Nature. 1959;184(4703):1968-1969.
  15. Hol FJ, Lambrechts L, Prakash M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 2020;9:e56829.
  16. Martin-Martin I, Williams AE, Calvo E. Determination of mosquito probing and feeding time to evaluate mosquito blood feeding. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(6):pdb.top107659.
  17. Boyd MF, Stratman-Thomas WK. Studies on benign tertian malaria. VII. Some observations on inoculation and onset. Am J Epidemiol. 1934;20(2):488-495.
  18. Swanson MM, Poodry CA. The shibire(ts) mutant of Drosophila: a probe for the study of embryonic development. Dev Biol. 1981;84(2):465-470.
  19. Sweeney ST, Broadie K, Keane J, Niemann H, O'Kane CJ. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 1995;14(2):341-351.
  20. Baines RA, Uhler JP, Thompson A, Sweeney ST, Bate M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J Neurosci. 2001;21(5):1523-1531.
  21. Hamada FN, Rosenzweig M, Kang K, et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 2008;454(7201):217-220.
  22. Corfas RA, Vosshall LB. The cation channel TRPA1 tunes mosquito thermotaxis to host temperatures. eLife. 2015;4:e11750.
  23. Greppi C, Laursen WJ, Budelli G, et al. Mosquito heat-seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 2020;367(6478):681-684.
  24. Allen WE, DeNardo LA, Chen MZ, et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 2017;357(6356):1149-1155.
  25. Inagaki HK, Jung Y, Hoopfer ED, et al. Optogenetic control of Drosophila courtship using a red-shifted channelrhodopsin reveals experience-dependent influences. Nat Methods. 2014;11(3):325-332.
  26. Sahel JA, Boulanger-Scemama E, Pagot C, et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nat Med. 2021;27(7):1223-1229.
  27. Klapoetke NC, Murata Y, Kim SS, et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 2014;11(3):338-346.
  28. Deisseroth K. Optogenetics. Nat Methods. 2011;8(1):26-29.
  29. Potter CJ, Tasic B, Russler EV, Liang L, Luo L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 2010;141(3):536-548.
  30. Herre M, Goldman OV, Lu TC, et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 2022;185(17):3104-3123.e28.
  31. Wohl MP, McMeniman CJ. Batch rearing Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(3):pdb.prot108017.
  32. American Committee of Medical Entomology, American Society of Tropical Medicine and Hygiene. Arthropod containment guidelines, version 3.2. Vector Borne Zoonotic Dis. 2019;19(3):152-173.
  33. Pleil JD, Wallace MAG, Davis MD, Matty CM. The physics of human breathing: flow, timing, volume, and pressure parameters for normal, on-demand, and ventilator respiration. J Breath Res. 2021;15(4):042002.
  34. Pereira TD, Tabris N, Matsliah A, et al. SLEAP: a deep learning system for multi-animal pose tracking. Nat Methods. 2022;19(4):486-495.
  35. Mathis A, Mamidanna P, Cury KM, et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 2018;21(9):1281-1289.
  36. Goodwin NL, Choong JJ, Hwang S, et al. Simple Behavioral Analysis (SimBA) as a platform for explainable machine learning in behavioral neuroscience. Nat Neurosci. 2024;27(7):1411-1424.
  37. Tillmann JF, Hsu AI, Schwarz MK, Yttri EA. A-SOiD, an active-learning platform for expert-guided, data-efficient discovery of behavior. Nat Methods. 2024;21(4):703-711.
  38. Skovorodnikov P, Zhao J, Buck F, et al. FERAL: a video-understanding system for direct video-to-behavior mapping. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.11.16.688666.
  39. Kabra M, Robie AA, Rivera-Alba M, Branson S, Branson K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nat Methods. 2013;10(1):64-67.
  40. Autrum H, Bennett MF, Diehn B, et al. Comparative physiology and evolution of vision in invertebrates. A: Invertebrate photoreceptors. Berlin: Springer; 1979.
  41. Alberto DAS, Rusch C, Zhan Y, Straw AD, Montell C, Riffell JA. The olfactory gating of visual preferences to human skin and visible spectra in mosquitoes. Nat Commun. 2022;13(1):555.
  42. Dekker T, Cardé RT. Moment-to-moment flight maneuvers of the female yellow fever mosquito (Aedes aegypti. L.) in response to plumes of carbon dioxide and human skin odor. J Exp Biol. 2011;214(Pt 20):3480-3494.
  43. Demir M, Kadakia N, Anderson HD, Clark DA, Emonet T. Walking Drosophila navigate complex plumes using stochastic decisions biased by the timing of odor encounters. eLife. 2020;9:e57524.
  44. Goldman OV, DeFoe AE, Qi Y, et al. A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult Aedes aegypti. mosquito. Cell. 2025;188(25):7267-7290.e26.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Muskietgedragneurale circuitsoptogenetische activatiegedragsassaysgastheerzoekgedragbloedvoedingmachine visionsensorische stimuli
Optogenetische analyse van het gedrag bij de mug Aedes aegypti
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.