Een netwerkfarmacologie en moleculaire dockingstudie van de TongBi-formule voor artrose

Samenvatting

Dit protocol voorspelt potentiële therapeutische doelwitten en moleculaire mechanismen van de TongBi-formule tegen artrose met behulp van netwerkfarmacologie en moleculaire koppeling.

Samenvatting

Deze studie paste netwerkfarmacologie toe in combinatie met moleculaire docking om de potentiële therapeutische doelwitten en moleculaire mechanismen van TongBi-formule (TBF) bij artrose (OA) te voorspellen. Actieve componenten en bijbehorende doelen van TBF werden opgehaald uit de traditionele Chinese geneeskunde Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, terwijl OA-gerelateerde doelen werden verzameld uit Online Mendelian Inheritance in Man, GeneCards, DrugBank en Therapeutic Target Database. Er werd een netwerkvisualisatie- en analysesoftware gebruikt om verbindings-doelwit- en eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerken te construeren. Functionele annotatie van genontologie en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes routeverrijkingsanalyses werden uitgevoerd met behulp van het platform Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery. Moleculaire dockinganalyse werd uitgevoerd met behulp van moleculaire dockingsoftware om de voorspelde bindingsaffiniteit tussen belangrijke actieve verbindingen en kerndoeleiwitten te evalueren. In totaal werden 47 overlappende doelen tussen TBF en OA geïdentificeerd. PPI-netwerkanalyse benadrukte JUN, RELA, IL6, MAPK1 en IL10 als potentiële hubdoelen. Verrijkingsanalyse suggereerde dat TBF ontsteking, lipidmetabolisme en meerdere intracellulaire signaalroutes die samenhangen met OA-progressie kan reguleren. Moleculaire koppelingsresultaten toonden gunstige voorspelde bindingsaffiniteiten aan tussen kernactieve verbindingen en belangrijke OA-gerelateerde eiwitdoelen. Deze bevindingen bieden een computationeel kader om de potentiële mechanismen van TBF tegen OA te begrijpen en ondersteunen verdere experimentele validatie.

Inleiding

Artrose (OA) is een degeneratieve ontstekingsziekte van het gewrichtskraakbeen¹. Momenteel zijn ongeveer 58 miljoen volwassenen getroffen door OA, en dit aantal zal naar verwachting stijgen tot 78,4 miljoen in 2040. OA is wereldwijd een veelvoorkomende oorzaak van gewrichtspijn en functionele beperkingen³. Door de hevige pijn die gepaard gaat met artrose, ervaren patiënten vaak aanzienlijke beperkingen in hun dagelijks leven⁴. Leeftijd, vrouwelijk geslacht, obesitas en gewrichtsschade zijn de belangrijkste risicofactoren voor OA⁵. Hoewel de prevalentie van OA extreem hoog is en een aanzienlijke impact heeft op zorgsystemen, blijven de beschikbare behandelopties beperkt⁶. De moderne geneeskunde hanteert vaak symptomatische behandelingen zoals niet-steroïde ontstekingsremmers en kraakbeenbeschermers. Langdurig toedienen veroorzaakt echter vaak bijwerkingen, waaronder gastro-intestinale schade en abnormale lever- en nierfunctie⁷. Daarom is er dringend behoefte aan het ontwikkelen van nieuwe behandelmethoden of alternatieve therapieën voor artrose.

Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) heeft uitgebreide ervaring opgedaan in de behandeling van OA, met nadruk op syndroomdifferentiatie en holistische regulatie. TongBi Formula (TBF) is een klassiek recept dat voornamelijk bestaat uit Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian en Xiangfu. Vanuit het perspectief van TCM komt de pathologische aard van OA voornamelijk voort uit de invasie van wind, koude, vochtige energie en stagnatie van qi en bloed⁸. De kruidencompatibiliteit van TBF is ontworpen om aan te sluiten bij dit kernpathologische mechanisme, waarbij alle medicinale componenten synergetisch werken om wind en vocht te verdrijven, meridianen te baggeren en de bloedcirculatie te bevorderen, waarmee ze overeenkomen met de typische TCM-syndroomkenmerken van OA. Groeiende klinische onderzoeken suggereren dat gemodificeerde TBF gewrichtspijn kan verlichten en de motorische functie van ledematen kan verbeteren bij patiënten met OA⁹. Verdere klinische observaties hebben ook aangetoond dat het potentieel is om ontstekingsreacties te reguleren in OA-gevallen¹⁰, terwijl een recente meta-analyse de klinische toepasbaarheid voor OA-interventie¹¹ verder ondersteunde.

TBF wordt traditioneel gebruikt om wind te verjagen, kanalen te ontstoppen, kou te verspreiden, vocht te elimineren en bloedcirculatie en voeding te bevorderen. De specifieke mechanismen waarmee TBF potentiële therapeutische effecten op OA uitoefent, blijven echter onduidelijk, en de actieve componenten en belangrijkste doelwitten zijn nog niet vastgesteld. Om deze mechanismen op een meer systematische en uitgebreide manier te onderzoeken, gebruikten we een netwerkfarmacologiebenadering om een netwerkkaart te construeren die de relaties tussen geneesmiddelen, doelwitten en ziekten illustreert¹². Daarnaast werden Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses uitgevoerd om de potentiële moleculaire mechanismen en signaalroutes te onderzoeken die betrokken zijn bij de farmacologische werking van TBF¹³. Om systematisch de farmacologische mechanismen van TCM-recepten te onderzoeken, stelde deze studie een volledige analytische workflow op die actieve ingrediëntenscreening, doelvoorspelling, netwerkconstructie, functionele verrijkingsanalyse en moleculaire docking omvatte. Zo'n onderzoekskader is erkend als een gestandaardiseerd en reproduceerbaar paradigma om de moleculaire mechanismen van TCM-formules te onderzoeken tegen OA¹⁴. Bestaande methodologische studies hebben de wetenschappelijke rationaliteit en praktische toepasbaarheid van deze^{onderzoeksstrategie verder} ondersteund. Naast methodologische standaardisatie helpt deze studie de materiële basis en kernregelgevende doelstellingen van TBF in OA te definiëren. Daarnaast biedt het theoretische referenties voor de klinische toepassing en toekomstige experimentele validatie van TBF, terwijl het ook een haalbaar methodologisch kader biedt voor mechanistische verkenning van andere TCM-voorschriften.

In deze studie gebruikten we een netwerkfarmacologische benadering om actieve componenten te screenen en een compound–target netwerk te construeren gecombineerd met OA-gerelateerde doelgenen. Functionele verrijkingsanalyse en moleculair koppelen werden vervolgens uitgevoerd voor mechanistische verkenning. Netwerkfarmacologie integreert biologische en farmacologische informatie om de relaties tussen geneesmiddel en doelwit te onderzoeken vanuit een allesomvattend en veelzijdig perspectief¹⁶. Wij geloven dat deze benadering kan helpen om de mogelijke farmacologische mechanismen van TBF te verduidelijken en een theoretische basis te bieden voor latere experimentele onderzoeken. De workflow van de studie wordt weergegeven in Figuur 1.

Figuur 1. Workflow van het netwerk farmacologie en het ontwerp van moleculaire dockingstudies. Schematisch overzicht van de analytische workflow die wordt gebruikt om de mogelijke mechanismen van TongBi-formule (TBF) tegen artrose (OA) te onderzoeken. De workflow omvatte actieve verbindingen screening, doelvoorspelling, OA-gerelateerde doelverzameling, intersectieanalyse, netwerkconstructie, eiwit-eiwitinteractie (PPI) analyse, Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses en validatie van moleculaire docking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Er waren geen menselijke deelnemers, gewervelde dieren of weefselmonsters betrokken bij deze studie. Alle analyses werden uitgevoerd met behulp van publiek toegankelijke bio-informatica-databases en moleculaire docking-methoden; daarom was ethische goedkeuring niet vereist.

Screening van componenten en bijbehorende doelen van TBF
Alle kruideningrediënten van TBF, waaronder Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian en Xiangfu, zijn doorzocht in de TCM Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) (geraadpleegd januari 2026). De exacte zoektermen kwamen overeen met de gestandaardiseerde Latijnse namen van elk kruidenmedicijn: Angelicae Sinensis Radix (Danggui), Radix Salviae (Danshen), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng), Caulis Piperis Kadsurae (Haifengteng), Impatiens balsamina (Tougucao), Radix Angelicae Biseratae (Duhuo), Radix Clematidis (Weilingxian) en Cyperi rhizoma (Xiangfu). Chemische componenten werden gescreend volgens de vaste drempels van orale biobeschikbaarheid (OB) ≥ 30% en geneesmiddelgelijkheid (DL) ≥ 0,18. Deze cutoffwaarden worden veel gebruikt in farmacologische studies van het TCM-netwerk om bio-beschikbare en geneesmiddelachtige actieve verbindingen met potentiële in vivo-activiteit te identificeren. Verbindingen zonder expliciete OB- of DL-waarden in de database werden uitgesloten om de betrouwbaarheid en consistentie van actieve verbindingscreening te waarborgen.

De bijbehorende eiwitdoelen van de gescreende actieve verbindingen werden vervolgens opgehaald uit de TCM-farmacologiedatabase. Standaardisatie van doelgenen werd uitgevoerd met behulp van de Universal Protein Resource (UniProt) eiwitannotatiedatabase, waarbij de soort beperkt bleef tot Homo sapiens (geraadpleegd januari 2026). Oorspronkelijke eiwitnamen werden omgezet in officiële menselijke gensymbolen, terwijl redundante en niet-menselijke doelvermeldingen handmatig werden uitgesloten. Dubbele doelen werden verwijderd door handmatige vergelijking en samenstelling om de definitieve TBF-doeldataset te genereren.

Identificatie van artrose-gerelateerde doelwitten en potentiële therapeutische doelen van TBF voor artrose
OA-gerelateerde doelen werden opgehaald met de exacte zoekterm "Artrose" in de Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCards, DrugBank en Therapeutic Target Database (TTD) databases (geraadpleegd januari 2026). Dubbele doelen verkregen uit verschillende databases werden handmatig verwijderd door gegevensverzameling en vergelijking om de OA-gerelateerde doeldataset te genereren. Voor GeneCards werden alleen doelen met een relevantiescore ≥ 3 behouden. Doelwitten die werden opgehaald van OMIM, DrugBank en TTD met het trefwoord "Artrose" werden niet onderworpen aan aanvullende filtercriteria. De overlappende doelen tussen actieve verbinding-gerelateerde doelen en OA-gerelateerde doelen werden geïdentificeerd met behulp van de Venny 2.1.0 online Venn-analysetool. De intersectieanalyse werd uitgevoerd om de potentiële therapeutische doelen van TBF tegen OA te bepalen.

Constructie van het TBF–Component–Doelnetwerk
Component–doelwitinteractiegegevens werden geïmporteerd in de Cytoscape 3.10.2 netwerkvisualisatie- en analysesoftware om het TBF–Component–Doelwit-netwerk te construeren (geraadpleegd januari 2026). In het geconstrueerde netwerk vertegenwoordigden knooppunten kruidenverbindingen en doelgenen, terwijl randen de interacties tussen actieve verbindingen en overeenkomstige doelwitten vertegenwoordigden. Om redundante analyse te voorkomen, werden dubbele verbindingen die tussen meerdere kruiden werden gedeeld samengevoegd tot één unieke knoop. Vervolgens werd een netwerktopologische analyse uitgevoerd met graadwaarde als primaire evaluatieparameter. Kernactieve verbindingen werden geïdentificeerd op basis van graadrangschikking en geselecteerd als ligandkandidaten voor de daaropvolgende moleculaire dockinganalyse.

PPI-netwerkconstructie
Potentiële therapeutische doelen werden geïmporteerd in de STRING PPI-database voor PPI-analyse (geraadpleegd januari 2026). De soortparameter was beperkt tot Homo sapiens, en de minimaal vereiste interactiebetrouwbaarheidsscore werd ingesteld op 0,9, terwijl alle overige parameters op standaardinstellingen werden gehandhaafd. De gegenereerde interactiegegevens werden geëxporteerd en verder gevisualiseerd met behulp van de netwerkvisualisatie- en analysesoftware. Topologische analyse van het PPI-netwerk werd uitgevoerd met behulp van de CytoHubba-netwerktopologieanalyse-plugin. Grad, tussenheidscentraliteit en nabijheidscentraliteit werden berekend om het belang van knooppunten binnen het interactienetwerk te evalueren. Kerndoeleiwitten werden geïdentificeerd op basis van geïntegreerde topologische eigenschappen en geselecteerd voor latere moleculaire koppelingsanalyse. Het Maximal Clique Centrality-algoritme werd ingevoerd om hubdoelen te screenen. Knooppunten zonder interactieve partners werden uitgesloten, wat resulteerde in een lager aantal knooppunten in het uiteindelijke netwerk dan in de oorspronkelijke geïmporteerde doeldataset.

GO en KEGG
GO functionele verrijkingsanalyse en KEGG padverrijkingsanalyse werden uitgevoerd om de potentiële biologische functies en signaalroutes te onderzoeken die geassocieerd zijn met de geïdentificeerde therapeutische doelen van TBF tegen OA. GO-analyse omvatte de drie standaard ontologiecategorieën: biologisch proces (BP), cellulaire component (CC) en moleculaire functie (MF), waarbij biologisch proces als primaire focus van interpretatie werd aangewezen.

Functionele verrijkingsanalyse werd uitgevoerd met behulp van de Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) in combinatie met R statistische analysesoftware (versie 4.3.1; geraadpleegd januari 2026). Verrijkingsresultaten werden verwerkt en gevisualiseerd met het clusterProfiler-pakket , waarbij de dotplot- en barplotfuncties werden gebruikt om verrijkingsdiagrammen te genereren. Alle doelgenen werden geannoteerd tegen de achtergrond van Homo sapiens . De Benjamini–Hochberg-methode werd toegepast voor meervoudige testcorrectie, en een aangepaste P-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Visualisatie van GO- en KEGG-verrijkingsresultaten werd uitgevoerd met behulp van het MicrobiomeAnalyst/MicrobiomeNet online analyseplatform (geraadpleegd januari 2026). Staafdiagrammen en bubbelgrafieken werden gegenereerd om de meest significant verrijkte GO-termen en KEGG-paden weer te geven.

Moleculaire koppeling
De officiële gennamen en bijbehorende Protein Data Bank (PDB)-identificaties van de topkerndoelen zijn opgehaald uit de eiwitannotatiedatabase17, en hun driedimensionale kristalstructuren zijn gedownload van de RCSB PDB (geraadpleegd februari 2026). Voor elk doeleiwit bleef Chain A als receptorstructuur behouden, terwijl redundante eiwitketens, heteroatomen en niet-gerelateerde structurele fragmenten werden verwijderd tijdens de receptorvoorbereiding. De driedimensionale structuren van kernactieve verbindingen zijn opgehaald uit de PubChem-database (geraadpleegd februari 2026). In deze studie werd quercetine geselecteerd als de representatieve koppelingsligand omdat het de hoogste topologische centraliteit vertoonde in het component–doel-netwerk en een goed gekarakteriseerde flavonoïde is met gerapporteerde beschermende effecten tegen OA-pathogenese.

Receptor- en ligandvoorverwerking werd uitgevoerd met moleculaire dockingvoorbereidingssoftware, waaronder verwijdering van watermoleculen, toevoeging van waterstofatomen, protonatiebehandeling en Gasteiger-ladingstoewijzing. Moleculaire dockinganalyse werd vervolgens uitgevoerd met behulp van de moleculaire dockingsoftware versie 1.5.7. De afmetingen van de rasterdoosjes werden aangepast om de voorspelde bindingsgebieden van elk doeleiwit te omvatten. De grid box was gecentreerd rond de native ligandbindende pocket van elk doeleiwit met een uniforme grootte van 40 Å × 40 Å × 40 Å en een rasterafstand van 0,375 Å. Koppelingsberekeningen werden uitgevoerd met een exhaustiviteitsparameter van 8, en negen kandidaatbindingsconformaties werden gegenereerd voor elk ligand-doelpaar. De koppelingsconformatie met de laagst voorspelde bindingsenergie werd geselecteerd als de representatieve bindingshouding voor latere structurele interpretatie. Redockingvalidatie en vergelijking van positieve controle-liganden werden in deze studie niet uitgevoerd. Alle dockingprocedures en parameterinstellingen volgden standaardprotocollen die vaak worden toegepast in netwerkfarmacologieonderzoek om de betrouwbaarheid van de voorspelde bindingsmodi te ondersteunen. Dockingconformaties werden visualiseerd met behulp van moleculaire visualisatiesoftware versie 2.5.4. Een bindingsenergie van ≤−5,0 kcal/mol werd beschouwd als indicatief voor stabiele ligand-receptorbinding.

Resultaten

Chemische samenstelling en doelwitscreening van TBF
In totaal werden na screening 2 actieve componenten uit Danggui, 65 uit Danshen, 24 uit Jixueteng, 21 uit Haifengteng, 6 uit Tougucao, 9 uit Duhuo, 7 uit Weilingxian en 18 uit Xiangfu geïdentificeerd. Gedetailleerde informatie over de gescreende actieve stoffen is te vinden in Aanvullende Tabel 1. In totaal werden aanvankelijk 2672 potentiële doelen teruggevonden, waaronder 266 doelen voor Danggui, 689 voor Danshen, 236 voor Duhuo, 188 voor Haifengteng, 545 voor Jixueteng, 192 voor Tougucao, 102 voor Weilingxian en 454 voor Xiangfu. Gedetailleerde doelinformatie wordt gepresenteerd in Aanvullende Tabel 2. Na het verwijderen van dubbele vermeldingen werden 258 niet-redundante doelen die met TBF zijn geassocieerd, verkregen.

Het TBF–Component–Doelnetwerk
Het TBF–Component–Target netwerk is opgebouwd met gegevens die zijn opgehaald uit de TCM-farmacologiedatabase, waaronder 152 actieve verbindingen, 258 niet-redundante doelen en 8 kruidengeneeskunde-knooppunten. Deze gegevens werden georganiseerd in twee bestanden, aangeduid als "netwerk" en "Type" (Aanvullende Tabel 3). Na het importeren van de bestanden in de netwerkvisualisatie- en analysesoftware werd een uitgebreid netwerk met 578 knooppunten en 3022 randen opgezet (Figuur 2). In het geconstrueerde netwerk vertegenwoordigden knooppunten kruidengeneesmiddelen, bioactieve verbindingen en bijbehorende doeleiwitten, terwijl randen de voorspelde interacties tussen verbindingen en doelwitten vertegenwoordigden. Grotere nodegrootte en donkerdere kleurintensiteit duidden op hogere gradenwaarden en een verhoogde netwerkconnectiviteit. Op basis van de graadrangschikking verkregen uit netwerktopologische analyse, werden de vijf belangrijkste actieve verbindingen geïdentificeerd als quercetine (A7-MOL000098), bèta-sitosterol (B8-MOL000358), luteoline (A1-MOL000006), kaempferol (C1-MOL000422) en stigmasterol (C2-MOL000449).

Figuur 2. TBF–Component–Target interactienetwerk. Netwerkvisualisatie van de interacties tussen TBF, actieve verbindingen en voorspelde doelgenen. Knooppunten vertegenwoordigen kruidengeneesmiddelen, actieve verbindingen of doeleiwitten, terwijl randen voorspelde interacties tussen verbindingen en doelwitten vertegenwoordigen. Grotere knooppuntgrootte en donkerdere kleurintensiteit duiden op hogere gradenwaarden en verhoogde netwerkconnectiviteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Doelinformatie gerelateerd aan OA en potentiële therapeutische doelen van TBF
Het trefwoord "Artrose" werd gezocht in vier databases, wat 428 potentiële ziektegerelateerde doelen opleverde, waaronder 9 van OMIM, 349 van GeneCards, 32 van DrugBank en 38 van TTD. Een Venn-diagram dat de doelverdeling tussen de vier databases illustreert, wordt weergegeven in Figuur 3. Na het samenvoegen en verwijderen van dubbele vermeldingen werden 398 unieke OA-gerelateerde doelen verkregen. Kruisingsanalyse tussen OA-gerelateerde doelwitten en TBF-actieve verbindingen-gerelateerde doelen identificeerde 47 overlappende doelen, die werden beschouwd als potentiële therapeutische doelen van TBF tegen OA. Het bijbehorende Venn-diagram dat is gegenereerd met de online Venn-analysetool is weergegeven in Figuur 4.

Figuur 3. Venn-diagram van OA-gerelateerde doelen opgehaald uit meerdere databases. Venn-diagram toont de overlap tussen OA-gerelateerde doelen die zijn geïdentificeerd uit de databases OMIM, GeneCards, DrugBank en Therapeutic Target Database (TTD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Identificatie van overlappende doelen tussen TBF en OA. Venn-diagram dat de kruising toont tussen actieve compound-gerelateerde doelen van TBF en OA-gerelateerde doelen. De overlappende doelwitten werden beschouwd als potentiële therapeutische doelwitten van TBF tegen OA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Constructie en analyse van het PPI-netwerk
PPI-netwerkanalyse van de 47 overlappende doelen werd uitgevoerd met behulp van de PPI-database (Figuur 5) en vervolgens gevisualiseerd met netwerkvisualisatie- en analysesoftware. Tijdens de netwerkconstructie werden losgekoppelde knopen die geïsoleerde doelen zonder eiwit-eiwitinteracties (PPI's) vertegenwoordigen verwijderd volgens standaard netwerktopologieprocedures, wat resulteerde in een verfijnd netwerk met 39 knopen en 108 randen (Figuur 6). Knooppuntgrootte en kleurintensiteit weerspiegelden graadwaarden, wat het relatieve belang van doelen binnen het netwerk aangaf.

Figuur 5. STRING PPI-netwerk van overlappende doelen. PPI-netwerk dat wordt gegenereerd met behulp van de STRING-database voor de overlappende doelen tussen TBF en OA. Knooppunten vertegenwoordigen doeleiwitten en randen voorspelde PPI's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Analyse van het kernnetwerk van PPI. Verfijnd PPI-netwerk na verwijdering van losgekoppelde nodes. Knooppuntgrootte en kleurintensiteit geven gradatiewaarden weer en geven het relatieve belang van doelen binnen het netwerk aan. Kerndoelen zoals JUN, RELA, IL6, MAPK1 en IL10 toonden een hoge netwerkconnectiviteit aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Topologische analyse van het PPI-netwerk werd uitgevoerd met behulp van de netwerktopologieanalyse-plugin met het Degree-algoritme om topologische kenmerken van knooppunten te berekenen. De top 10 doelen, gerangschikt op graadwaarde, worden weergegeven in Tabel 1. De vijf hoogst gerangschikte doelen, waaronder JUN, RELA, IL6, MAPK1 en IL10, werden geselecteerd als kerndoelen voor daaropvolgende moleculaire koppelingsanalyse op basis van graadwaarde, nabijheidscentraliteit en betweenness-centraliteit.

GO biologische functie en KEGG Pathway analyse van TBF bij OA
GO-verrijkingsanalyse identificeerde verschillende OA-gerelateerde biologische functies, waaronder cytokineactiviteit, transcriptiefactorbinding en groeifactoractiviteit, wat wijst op de mogelijke betrokkenheid van TBF bij de regulatie van ontsteking, transcriptieactiviteit en kraakbeenhomeostase. De top 20 verrijkte GO-termen werden gerangschikt op telwaarden en gevisualiseerd met behulp van een staafdiagram (Figuur 7). KEGG-routeverrijkingsanalyse richtte zich op OA-gerelateerde signaalroutes, waaronder de geavanceerde glycatie-eindproducten – receptor voor geavanceerde glycatie-eindproducten, interleukine-17 (IL-17) signaalroute, tumornecrose factor (TNF) signaalweg en T-cel receptor signaalroute, die geassocieerd zijn met inflammatoire regulatie, chondrocytkatabolisme en immuunresponsen bij OA. Infectieziekte-gerelateerde routes die tijdens de verrijkingsanalyse werden geïdentificeerd, werden in de huidige studie niet geïnterpreteerd als directe OA-mechanismen. KEGG-padanalyse werd uitgevoerd met behulp van de statistische analysesoftware om een bubbelgrafiek te genereren (Figuur 8). In totaal werden 20 significant verrijkte signaalroutes geïdentificeerd. Deze resultaten suggereerden dat TBF OA-gerelateerde biologische processen en signaalroutes kan reguleren via een multitarget farmacologisch mechanisme.

Figuur 7. GO-verrijkingsanalyse van potentiële therapeutische doelen. Bargrafiek toont de top 20 verrijkte GO-termen die geassocieerd zijn met de potentiële therapeutische doelen van TBF tegen OA. De verrijkte termen omvatten biologische processen, moleculaire functies en cellulaire componenten die verband houden met ontsteking, transcriptieregulatie en kraakbeenhomeostase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8. KEGG-routeverrijkingsanalyse van potentiële therapeutische doelwitten. Bubble plot visualisatie van de top verrijkte KEGG signaalroutes die geassocieerd zijn met de potentiële therapeutische doelen van TBF tegen OA. De bubbelgrootte geeft het aantal verrijkte genen aan, terwijl de kleurintensiteit het verrijkingssignificantieniveau weerspiegelt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Moleculaire koppelverificatie
Om de potentiële bindingsinteracties tussen de belangrijkste actieve verbinding van TBF en kerndoelen uit het PPI-netwerk verder te onderzoeken, werd moleculaire koppelingsanalyse uitgevoerd tussen quercetine, de hoogst gerangschikte actieve verbinding in het component–doel-netwerk, en de vijf kerndoelen JUN, RELA, IL6, MAPK1 en IL10 (Tabel 2). Quercetine toonde het hoogste topologische belang in het component–doelwitnetwerk en is breed gerapporteerd als een representatieve bioactieve verbinding die geassocieerd is met ontstekingsremmende activiteit en regulering van kraakbeenmetabolisme^18,19. De voorspelde bindingsenergieën waren −8,4 kcal/mol voor JUN, −7,6 kcal/mol voor RELA, −6,9 kcal/mol voor IL6, en −6,7 kcal/mol voor zowel MAPK1 als IL10, wat wijst op gunstige voorspelde bindingsaffiniteiten tussen quercetine en de geselecteerde kerndoelen. Visualisatie van ligand-receptorbindingsconformaties vergemakkelijkte de interpretatie van potentiële moleculaire interacties. Moleculaire visualisatiesoftware versie 2.5.4 werd gebruikt om de optimale koppelingsconformaties tussen quercetine en de vijf kerndoelen te visualiseren (Figuur 9–13).

Figuur 9. Moleculair koppelingsmodel van quercetine met JUN (PDB ID: 1JNM). Driedimensionale moleculaire koppelingsconformatie van quercetine gebonden aan JUN. Quercetine werd voorspeld te binden binnen het bZIP-domein van JUN en te passen in de hydrofobe bindingsholte met structurele complementariteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10. Moleculair koppelingsmodel van quercetine met RELA (PDB ID: 7LEU). Driedimensionale moleculaire koppelingsconformatie van quercetine gebonden aan RELA. Van het werd voorspeld dat quercetine zou interageren met het actieve gebied van het RELA Rel-homologiedomein via niet-covalente interacties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11. Moleculair koppelingsmodel van quercetine met IL6 (PDB ID: 1ALU). Driedimensionale moleculaire koppelingsconformatie van quercetine gebonden aan IL6. Van men voorspelde dat quercetine de geconserveerde receptorbindende groef van IL6 zou bezetten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 12. Moleculair koppelingsmodel van quercetine met MAPK1 (PDB ID: 6D5Y). Driedimensionale moleculaire koppelingsconformatie van quercetine gebonden aan MAPK1. Quercetine werd voorspeld in de ATP-bindende pocket van MAPK1 te bezetten, wat wijst op mogelijke kinase-gerelateerde interacties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 13. Moleculair koppelingsmodel van quercetine met IL10 (PDB ID: 1ILK). Driedimensionale moleculaire koppelingsconformatie van quercetine gebonden aan IL10. Van Quercetine werd voorspeld dat het zou interageren nabij het dimeerinterfacegebied van IL10 en mogelijk zou bijdragen aan de stabilisatie van het eiwitcomplex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Beschikbaarheid van gegevens:
Alle gegevens die de bevindingen van deze studie ondersteunen, zijn opgenomen in het manuscript, tabellen, figuren en aanvullende materialen. Aanvullende Tabel 1 bevat de gescreende actieve verbindingen van de TongBi-formule (TBF), Aanvullende Tabel 2 geeft de bijbehorende voorspelde doelinformatie, en Aanvullende Tabel 3 bevat de netwerkcodering en interactiegegevens die worden gebruikt voor netwerkconstructie en topologische analyse.

Gene	Eiwitnaam	Diploma	Nabijheidscentraliteit	Centraliteit van de tussenliggende positie
JUN	Transcriptiefactor AP-1	18	0.58	0.22
RELA	Transcriptiefactor p65	15	0.56	0.15
IL6	Interleukine 6	14	0.59	0.33
MAPK1	Mitogeen-geactiveerde eiwitkinase 1	13	0.54	0.16
IL10	Interleukine 10	10	0.47	0.12
ESR1	Oestrogeenreceptor	10	0.44	0.03
IL2	Interleukine 2	9	0.53	0.05
AKT1	RAC-alfa serine/threonine-eiwitkinase	9	0.44	0.04
MMP1	Matrix metallopeptidase 1	8	0.44	0.03
MMP2	Matrix metallopeptidase 2	8	0.44	0.03

Tabel 1: Topologische parameters van kerndoelen in het PPI-netwerk. Topologische parameters van de belangrijkste doelen die in de PPI-netwerkanalyse zijn geïdentificeerd. Gradatie, nabijheidscentraliteit en betweenness-centraliteit werden berekend om het belang van de knooppunten te evalueren en kerntherapeutische doelen te identificeren die geassocieerd zijn met TBF tegen OA. Doelen met hogere graad- en centraliteitswaarden werden als belangrijker beschouwd binnen het interactienetwerk.

Doel	PDB ID	Actieve locatiecoördinaten (X, Y, Z)	Ligand	Bindingsaffiniteit (kcal/mol)
JUN	1JNM	X = 10,201; Y = 0,493; Z = 19,492	Quercetine	−8,4
RELA	7LEU	X = 1,717; Y = 23,889; Z = −0,778		−7,6
IL6	1ALU	X = 2,599; Y = −20,016; Z = 8,749		−6,9
MAPK1	6D5Y	X = 7,052; Y = 12,800; Z = 20,749		−6,7
IL10	1ILK	X = 17,836; Y = 46,443; Z = 38,685		−6,7

Tabel 2: Moleculaire koppelparameters en bindingsaffiniteiten tussen quercetine en kerndoeleiwitten. Moleculaire koppeling tussen quercetine en de geselecteerde kerndoeleiwitten JUN, RELA, IL6, MAPK1 en IL10. De tabel toont Protein Data Bank (PDB)-identificaties, coördinaten van actieve locaties voor het rastercentrum gebruikt voor dockingberekeningen, en voorspelde binding affiniteitswaarden verkregen uit moleculaire dockinganalyse. Lagere bindingsenergiewaarden duiden op een sterkere voorspelde ligand-receptorbindingsaffiniteit.

Aanvullende tabel 1: Actieve stoffen geïdentificeerd uit TBF. Gedetailleerde informatie over de actieve verbindingen gescreend vanuit TBF, inclusief verbindingnamen, moleculaire identificaties, OB-waarden, DL-waarden en bijbehorende kruidenbronnen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Voorspelde doelwitten die overeenkomen met actieve verbindingen van TBF. Uitgebreide lijst van voorspelde eiwitdoelen die overeenkomen met de gescreende actieve verbindingen van TBF, inclusief gestandaardiseerde menselijke gensymbolen verkregen na doelnormalisatie en deduplicatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 3: Netwerkcoderingsinformatie voor het TBF–Component–Doel-netwerk. Gedetailleerde coderingsinformatie gebruikt voor de constructie van het TBF-component–doelinteractienetwerk, inclusief moleculaire identificaties, doelinformatie, netwerkrelaties en knooppuntclassificatiegegevens die worden gebruikt voor netwerktopologieanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Deze studie maakte gebruik van netwerkfarmacologie en moleculaire dockingbenaderingen om de mogelijke mechanismen van TBF tegen OA te onderzoeken. De kernkruidengeneesmiddelen die werden geanalyseerd waren onder andere Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian en Xiangfu. Eerdere studies hebben aangetoond dat Danggui (Angelica sinensis Radix) pathologische veranderingen gerelateerd aan OA kan verlichten, waaronder kraakbeendegeneratie, subchondrale botsclerose, abnormale gang en kniezwelling bij destabilisatie van de mediale meniscus^{modellen 20}. In IL-1β-geïnduceerde OA-celmodellen verminderde Danggui de ophoping van reactieve zuurstofsoorten en verhoogde de activiteit van antioxidante enzymen, waaronder superoxidedismutase en glutathion²¹. Danshenindion IIA, een actief bestanddeel van Salvia miltiorrhiza, is gerapporteerd als verlichter van kraakbeendegeneratie, herstelt de homeostase van subchondrale botremodellering en onderdrukt abnormale angiogenese in OA-muismodellen²². Daarnaast kunnen componenten afkomstig van S. miltiorrhiza oxidatieve stress en botmetabolisme^reguleren. Spatholobus suberectus Dunn reguleert de PI3K/Akt/mTOR- en Ras/Raf/MAPK-signaalroutes²⁵, die geassocieerd zijn met kraakbeenmetabolisme en OA-progressie. Extracten van S. suberectus Dunn remmen ook de productie van pro-inflammatoire chemokines²⁶. Bovendien kunnen ontstekingsremmende en antioxidante activiteiten die voor Impatiens balsamina zijn gerapporteerd, relevant zijn voor de pathogenese van OA, omdat chronische ontsteking en oxidatieve stress bijdragen aan kraakbeendegeneratie²⁷. Radix Angelicae Biseratae is ook in verband gebracht met een verbeterde bloedcirculatie en verlichting van artritisgerelateerde symptomen ^28,29. Beperkte studies hebben de potentiële therapeutische effecten van Jixueteng (Spatholobus suberectus Dunn), Haifengteng (Caulis Piperis Kadsurae) en Xiangfu (Cyperi rhizoma) bij OA onderzocht.

Computationele voorspellingen op basis van het PPI-netwerk suggereerden dat TBF therapeutische effecten kan uitoefenen tegen OA door regulatie van ontstekingsreacties en bescherming van gewrichtskraakbeen, hoewel deze voorspellingen verdere experimentele validatie vereisen. De kerndoelen met relatief hoge graadwaarden in het PPI-netwerk waren onder andere JUN, RELA, IL6, MAPK1 en IL10. Eerdere studies hebben aangetoond dat JUN geassocieerd is met veroudering van chondrozyten en progressie van OA. JunB/Jun dubbelmutante muizen vertonen ontstekingsinfiltratie in gewrichtsweefsels, gepaard met botdestructie en periostitis³⁰. Transcriptomische analyses van osteoartritisch kraakbeen en synovium hebben ook een verminderde JUN-expressie³¹ aangetoond. Daarnaast is verminderde JUN-eiwitexpressie waargenomen in de door de transsectie geïnduceerde OA-rattenmodellen en senescente chondrocyten³². Eerdere studies suggereerden verder dat JUN-gerelateerde signalering kraakbeendegeneratie, apoptose, autofagie en extracellulair matrixmetabolisme in OA-chondrocyten kan reguleren³³. Eerdere studies hebben ook aangetoond dat overdrachtsfragmenten van RNA de proliferatie en overleving van gewrichtschondrocyten reguleren via RELA-geassocieerde signaalroutes³⁴. Daarnaast verbeterde upregulatie van het Sox9-gen, gecombineerd met remming van RELA-expressie in mesenchymale stromale cellen, de chondrogene en immunomodulerende capaciteiten en vertraagde de progressie van OA in experimentele modellen³⁵. Deze bevindingen ondersteunen de potentiële relevantie van JUN- en RELA-gerelateerde signaalroutes die in de huidige computationele analyse zijn geïdentificeerd.

IL6 is een belangrijke ontstekingsmediator bij OA en speelt een belangrijke rol in het kraakbeenmetabolisme door zowel afbraak- als herstelprocessen te beïnvloeden. Bij chronische, laaggradige ontstekingsaandoeningen dragen verhoogde IL6-niveaus bij aan de chondrocytsenescentie, verminderde kraakbeenmatrixsynthese en verstoring van de kraakbeenhomeostase³⁶. Eerdere studies hebben aangetoond dat IL6-receptor/JAK2-signalering deelneemt aan de regulatie van senescentiecelapoptose, en gerichte verwijdering van senescente cellen kan de progressie van OA^verminderen. Daarnaast rapporteerden Li Q en collega's dat upregulatie van miR-186-5p ontstekingsreacties in door IL-1β gestimuleerde chondrocyten reguleerde, terwijl remming van miR-186-5p de progressie van OA verlichtte door versterking van MAPK1-expressie³⁸. Deze bevindingen ondersteunen de mogelijke betrokkenheid van IL6- en MAPK1-gerelateerde signaalroutes die in de huidige computationele analyse zijn geïdentificeerd.

IL10 speelt een beschermende rol in de homeostase van kraakbeen en kan bijdragen aan het behoud van het kraakbeenmicro-milieu. Eerdere studies hebben aangetoond dat IL10 chondrocytapoptose remt door regulatie van mitochondriale apoptotische routes, vermindering van caspaseactiviteit en modulatie van de Bax/Bcl-2-verhouding³⁹. Daarnaast is IL10 in verband gebracht met verminderde extracellulaire matrixdegradatie en verminderde expressie van matrixdegradatie-gerelateerde factoren, waaronder MMP3, MMP13, ADAMTS4 en induceerbare stikstofoxidesynthase, in samengeperste gewrichtskraakbeen^{modellen 40}. De KEGG-routeverrijkingsanalyse in deze studie suggereerde dat de IL-17, TNF en hypoxie-induceerbare factor-1 (HIF-1) signaalroutes mogelijk geassocieerd zijn met de voorspelde therapeutische effecten van TBF tegen OA, hoewel deze computationele voorspellingen experimentele bevestiging vereisen. Eerdere studies hebben aangetoond dat IL-17 bijdraagt aan de progressie van OA door regulatie van ontstekingsreacties en activiteit van^{synoviale cellen 41,42}. Verhoogde expressie van IL-17 is ook positief gecorreleerd met de ernst van de ziekte bij knie-OA⁴³. TNF-α is een andere belangrijke ontstekingsmediator die geassocieerd wordt met artrose-gerelateerde ontstekingen, pijn en kraakbeendegeneratie, en remming van TNF-α signalering kan de ziekteprogressie verlichten⁴⁴. Daarnaast speelt HIF-1α een belangrijke rol in het hypoxische metabolisme van chondrocyten, de regulatie van de extracellulaire matrix, synoviale ontsteking en subchondrale botremodellering bij OA⁴⁵. Eerdere studies suggereren ook dat remming van HIF-1α-gerelateerde signalering de chondrocytfunctie kan beschermen en kraakbeendegeneratie⁴⁶ kan verminderen. Deze bevindingen zijn consistent met de signaleringsroutes die zijn geïdentificeerd in de huidige computationele verrijkingsanalyse.

Deze in silico-studie kent verschillende belangrijke beperkingen. Ten eerste baseerde de analyse zich op openbaar beschikbare databases, die mogelijk onvolledige of bevooroordeelde informatie bevatten over kruidenverbindingen en doelannotaties. Daarnaast bevatten computationele doelvoorspellingsmethoden inherente onzekerheid, en de voorspelde interacties die in deze studie worden geïdentificeerd, vereisen experimentele verificatie. Moleculaire dockinganalyse weerspiegelt het theoretische bindingspotentieel in plaats van directe fysiologische of farmacologische activiteit. Bovendien werden er geen in vitro - of in vivo-experimenten uitgevoerd om de computationele voorspellingen te valideren. Factoren zoals kruidendosering, farmacokinetiek en de algehele biobeschikbaarheid van de gecombineerde formule werden ook niet geëvalueerd. Daarom moeten alle conclusies die uit deze studie worden afgeleid als voorspellend worden beschouwd en verdere experimentele bevestiging vereisen.

De huidige studie, gebaseerd op netwerkfarmacologie en moleculaire dockinganalyses, biedt een voorspellend kader voor het onderzoeken van de mogelijke mechanismen van TBF tegen OA. De resultaten suggereerden dat TBF meerdere OA-gerelateerde doelwitten kan reguleren via interacties tussen actieve stoffen afkomstig van de acht bestanddelen. De geïdentificeerde doelwitten waren verrijkt met biologische processen en signaalroutes die geassocieerd zijn met ontstekingsregulatie, lipidmetabolisme en hypoxie-gerelateerde signalering, waaronder de IL-17, TNF en HIF-1 routes. Moleculaire dockinganalyse toonde verder gunstige voorspelde bindingsaffiniteiten aan tussen quercetine en de kerndoelen JUN, RELA, IL6, MAPK1 en IL10. Gezamenlijk suggereren deze bevindingen dat TBF multicomponent- en multi-target regulatorische effecten kan uitoefenen tegen OA. Deze studie biedt ook een theoretische strategie en methodologisch kader voor toekomstige mechanistische studies en experimentele validatie van TCM-formules in OA-onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AutoDockTools	Software	Versie 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
AutoDock Vina	Software	Versie 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
barplot functie	R visualisatiefunctie	clusterProfiler pakket	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
clusterProfiler	R pakket	Bioconductor pakket voor verrijkingsanalyse	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
CytoHubba	Plugin	Compatibel met Cytoscape 3.10.2	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba
Cytoscape	Software	Versie 3.10.2; Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/
DAVID	Databank	Database voor annotatie, visualisatie en geïntegreerde ontdekking	https://david.ncifcrf.gov/
dotplot functie	R visualisatiefunctie	clusterProfiler pakket	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
DrugBank	Databank	University of Alberta	https://go.drugbank.com/
GeneCards	Databank	GeneCards Suite	https://www.genecards.org/
MicrobiomeAnalyst / MicrobiomeNet	Online Platform	Online verrijkingsvisualisatie platform	https://microbiomenet.com/
OMIM	Databank	Online Mendeliaanse Overerving bij de Mens	https://www.omim.org/
PDB	Databank	RCSB Protein Data Bank	https://www.rcsb.org/
PubChem	Databank	National Center for Biotechnology Information	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PyMOL	Software	Versie 2.5.4	https://pymol.org/
R	Software	Versie 4.3.1; R Foundation for Statistical Computing	https://www.r-project.org/
STRING	Databank	Search Tool voor het ophalen van Interacterende Genen/Eiwitten	https://cn.string-db.org/
TCMSP	Databank	Traditionele Chinese Geneeskunde Systemen Farmacologie Databank en Analyse Platform	http://tcmspw.com/tcmsp.php
TTD	Databank	Therapeutische Doelwit Databank	https://db.idrblab.net/ttd/
UniProt	Databank	Universal Protein Resource	https://www.uniprot.org/
Venny	Software	Versie 2.1.0	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html