Mechanismen van Qu's Formule 3 voor het verbeteren van endometriumreceptiviteit bij PCOS: een combinatie van netwerkfarmacologie en moleculaire dynamica-simulatie

Samenvatting

Dit protocol heeft als doel het mechanisme te onderzoeken waarmee QUF3 de endometriumreceptiviteit in PCOS verbetert, met behulp van netwerkfarmacologie, docking en MD-simulatie.

Samenvatting

Verminderde endometriumontvankelijkheid is een belangrijke oorzaak van onvruchtbaarheid bij het polycysteus ovariumsyndroom (PCOS). Qu's Formula 3 (QUF3) is een Chinese kruidenmedicijnformule die klinisch wordt gebruikt om de endometriumreceptiviteit bij patiënten met PCOS te verbeteren. Deze studie maakte gebruik van netwerkfarmacologie, moleculaire docking en moleculaire dynamica (MD) simulaties om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. Actieve bestanddelen van QUF3 werden geïdentificeerd met behulp van de TCMSP-database, en potentiële doelwitten gerelateerd aan endometriumreceptiviteit en PCOS werden opgehaald bij DrugBank en andere bronnen. Een interactienetwerk tussen verbindingen en doelwitten en een eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk werden via Cytoscape opgebouwd om belangrijke doelwitten te identificeren. Kerndoelen werden onderworpen aan GO- en KEGG-verrijkingsanalyses. Moleculaire koppeling, MD-simulaties, principal component analysis (PCA), free energy landscape (FEL) en dynamische cross-correlatiematrix (DCCM) werden gebruikt om bindingsinteracties te evalueren. Uit 91 actieve ingrediënten en 294 potentiële geneesmiddeldoelwitten werden 60 ziektegerelateerde doelwitten geïdentificeerd. Luteoline en sesamine behoorden tot de belangrijkste farmacodynamische componenten. Tien kerndoelen werden geïdentificeerd: AKT1, EGFR, TNF, TP53, IL6, BCL2, ESR1, IL1B, STAT3 en MMP9. KEGG-verrijking onthulde 132 signaalpaden, en GO-analyse identificeerde 678 ingangen. MD-simulaties gaven aan dat de binding tussen de vijf belangrijkste actieve bestanddelen en hun respectievelijke doelwitten stabiel was. PCA, FEL en DCCM toonden verder de hoge thermodynamische stabiliteit en structurele stijfheid van deze complexen aan. Samenvattend verbetert QUF3 de endometriumreceptiviteit bij PCOS door interacties tussen multicomponenten, multitarget en multipathway. Deze studie biedt een theoretische basis, vanuit een computationeel simulatieperspectief, voor de ontwikkeling van gerichte Chinese kruidengeneeskundetherapieën voor PCOS-gerelateerde onvruchtbaarheid, en kan positieve gevolgen hebben voor het verbeteren van zwangerschapsuitkomsten bij vrouwen met PCOS in de toekomst.

Inleiding

Polycysteus ovariumsyndroom (PCOS) is een van de meest voorkomende endocriene aandoeningen bij vrouwen¹. De belangrijkste kenmerken zijn chronische aanhoudende ovulatiestoornissen, klinische of biochemische hyperandrogenemie en polycysteuze eierstokmorfologie, met klinische manifestaties zoals amenorroe, onvruchtbaarheid, hirsutisme, acne en obesitas. In de afgelopen jaren hebben vooruitgangen in ovulatie-inductie en geassisteerde voortplantingstechnologie (ART) de zwangerschapspercentages bij PCOS-patiënten aanzienlijk verbeterd; echter, de uitkomsten tijdens de zwangerschap blijven slechter dan bij gezonde vrouwen ^2,3. Endometriumreceptiviteit is een belangrijke factor die ART-uitkomsten^{benvloedt 4}. Endometriumreceptiviteit verwijst naar het vermogen van het endometrium om een embryo op een specifiek fysiologisch stadium te accepteren, wat een beslissende rol speelt bij de implantatie en de daaropvolgende ontwikkeling van het embryo ^5,6. Pathologische aandoeningen die vaak worden waargenomen bij PCOS, zoals obesitas, insulineresistentie en chronische ontsteking, kunnen de endometriumontvankelijkheid belemmeren, de innesteling van bevruchte eicellen en de ontwikkeling van embryo's belemmeren, en uiteindelijk leiden tot onvruchtbaarheid en miskraam ^7,8. Desalniettemin blijven de regulerende mechanismen die ten grondslag liggen aan endometriumreceptiviteit bij PCOS grotendeels onduidelijk, en het interactienetwerk tussen verschillende beïnvloedende factoren is nog niet opgehelderd. Qu's Formula 3 (QUF3), een Chinese kruidengeneeskundeformule die klinisch wordt gebruikt om de endometriumreceptiviteit bij patiënten met PCOS te verbeteren, wordt ondersteund door solide klassieke theorieën van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) in de gynaecologie. De formule bestaat uit Paeoniae Radix Alba (Baishao), Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang), Cuscutae Semen (Tusizi), Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi), Herba Taxilli (Sangjisheng), Radix Salviae (Danshen) en Cornus Officinalis Sieb. et Zucc. (Shanzhuyu) in een verhouding van 2:4:3:4:3:3:2:2, bereid door ethanolrefluxextractie. QUF3 oefent synergetische effecten uit van meerdere kruiden, versterkt de nier, verrijkt de essentie, voedt het bloed en bevordert de bloedcirculatie⁹. De klinische effectiviteit in het verbeteren van de endometriumreceptiviteit bij PCOS-patiënten is goed gevalideerd, maar de kernfarmacologische mechanismen moeten nog verder worden onderzocht.

Netwerkfarmacologie is een op systemen gebaseerde analytische benadering die multi-niveau "kruidencomponent-doelziekte" netwerken construeert om, vanuit een holistisch perspectief, de interventie-effecten van geneesmiddelen op ziektenetwerken te onthullen. In tegenstelling tot het traditionele "single drug-single target"-model kan netwerkfarmacologie de synergetische kenmerken van "multi-component, multi-target en multi-pathway" acties van TCM-formules volledig vastleggen, waardoor het bijzonder geschikt is voor het onderzoeken van de complexe mechanismen van TCM. Moleculaire dynamica (MD) simulatie daarentegen is een computationele techniek gebaseerd op de Newtoniaanse mechanica die op atomair niveau de conformationele veranderingen en het dynamische gedrag van eiwit-ligandencomplexen in de loop van de tijd simuleert. In vergelijking met statische moleculaire koppeling kan MD-simulatie dynamische parameters beoordelen, zoals bindingsstabiliteit, vrije energielandschappen en structurele stijfheid, waardoor een realistischere evaluatie van interacties tussen geneesmiddelmoleculen en doeleiwitten mogelijk wordt. Netwerkfarmacologie is geschikt voor het wereldwijd screenen van potentiële doelen en routes van TCM-formules, terwijl MD-simulatie dynamisch de bindingsstabiliteit tussen sleutelcomponenten en doeleiwitten kan evalueren. Door deze twee benaderingen te combineren, kan een betrouwbaardere analyse mogelijk worden van de multicomponent, multi-target synergetische mechanismen van TCM-formules. Op basis van deze redenering gebruikte deze studie een gecombineerde netwerkfarmacologie- en MD-simulatiebenadering om systematisch de mogelijke farmacologische mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de verbetering van endometriumreceptiviteit door QUF3 bij PCOS-patiënten.

Deze gecombineerde computationele workflow is het meest geschikt voor de initiële verkenning van de multicomponenten, multi-doelmechanismen van Chinese kruidenformules of natuurlijke producten, met name voor complexe systemen waarbij de actieve ingrediënten en doelwitten grotendeels onbekend zijn. Gebruikers moeten basiskennis van bio-informatica hebben, waaronder databasezoeken en netwerkanalyse, evenals de mogelijkheid om fundamentele computationele biologische analyses uit te voeren, zoals moleculaire docking en moleculaire dynamica-simulaties met gebruikelijke softwarepakketten. Een Linux-gebaseerde computeromgeving met minstens 16 GB RAM wordt aanbevolen, samen met toegang tot relevante openbare databases zoals de Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), PubChem en UniProt. Alle software die in deze workflow wordt gebruikt (bijv. Cytoscape, AutoDockTools, GROMACS) is open source of gratis voor academisch gebruik, en lezers kunnen deze verkrijgen via de informatie in de Table of Materials.

Protocol

Screening van actieve bestanddelen en potentiële doelwitten van QUF3
De actieve chemische componenten van Baishao, Shudihuang, Tusizi, Nvzhenzi, Sangjisheng, Danshen en Shanzhuyu in het medicijn QUF3 werden op 1 april 2025 geïdentificeerd met behulp van de TCMSP^. De actieve ingrediënten werden voorlopig gescreend op basis van de omstandigheden van orale biobeschikbaarheid (OB) ≥30% en geneesmiddelgelijkheid (DL) ≥ 0,18¹¹. Deze drempels werden gekozen als standaard empirische criteria om voldoende absorptie en geneesmiddelachtige eigenschappen te waarborgen. De canonieke SMILES-sequentie van elke verbinding werd doorzocht in de PubChem-database, en de resulterende sequentie werd gebruikt om de verbindingsdoelen te voorspellen in de Swiss Target Prediction online database, gevolgd door het verzamelen van doeleiwitgennamen en UniProt-ID's uit de UniProt-database 12,13,14. Als tussentijdse controlepost werd het aantal unieke doelen dat na deduplicatie werd verkregen geregistreerd.

Identificatie van actiedoelen voor endometriumreceptiviteit bij PCOS
De trefwoorden "polycysteus ovarium syndroom" en "endometriale receptiviteit" werden gebruikt als zoektermen in de Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), DrugBank, Therapeutic Target Database (TTD) en GeneCards om potentiële doelwitten te identificeren 15,16,17,18. Voor GeneCards werden alleen doelen met een relevantiescore >5 behouden; Voor de andere databases werden alle opgehaalde doelen opgenomen. Na het samenvoegen en verwijderen van dubbele vermeldingen werd het aantal unieke ziektegerelateerde doelen geregistreerd als een tussentijdse output.

Netwerkconstructie van componenten en doelen
De intersectiedoelen werden gegenereerd door de mogelijke doelen voor QUF3, PCOS en endometriumreceptiviteit in een online Venn-diagramtool in te voeren. Deze snijdoelen werden beschouwd als de belangrijkste doelen waarmee QUF3 zijn effectiviteit uitoefent bij het verbeteren van endometriumreceptiviteit bij PCOS. Vervolgens werd een "herb-constituent-target" (H-C-T) netwerk gecreëerd door deze snijpuntendoelen te matchen met de actieve component-doelgegevens van QUF3 met behulp van Cytoscape¹⁹. Het netwerk werd gevisualiseerd met behulp van de "Network Analyzer"-tool.

Constructie van eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkconstructie
Potentiële doelgenen van QUF3 voor het verbeteren van endometriumreceptiviteit bij PCOS werden als input ingediend bij het STRING dataplatform²⁰. De soort werd ingesteld op "Homo sapiens" en de betrouwbaarheidsdrempel op "medium confidence (0,4)", wat resulteerde in een TSV-bestand met eiwit-eiwitinteractiegegevens. Dit bestand werd vervolgens geïmporteerd in netwerkanalysesoftware om het PPI-netwerk²¹ te construeren en te analyseren. De knooppuntbelang in het netwerk wordt aangegeven door de "Degree"-waarde: een hogere Degree-waarde duidt op een belangrijkere node. Vervolgens werden de primaire actieve ingrediënten gesorteerd op Degree, en werden de top 10 kerndoelen geselecteerd op basis van Degree-ranglijst.

Genontologie (GO) en Kyoto-encyclopedie van genen en genomen verrijking van de routes (KEGG) analyse
GO- en KEGG-routeverrijkingsanalyses werden uitgevoerd met behulp van de DAVID-database om de biologische routes en mechanismen te onderzoeken waarmee QUF3 de endometriumreceptiviteit in PCOS²² verbetert. De soort werd ingesteld op "Homo sapiens" en de significantiedrempel werd vastgesteld op P < 0,05. De GO-analyse omvatte het biologische proces (BP), cellulaire component (CC) en moleculaire functie (MF)²³. De resultaten werden gesorteerd op het aantal verrijkte doelen. Routes gerelateerd aan menselijke stofwisseling en ziekten werden vervolgens uitgesloten, en de top 20 KEGG-routes werden geselecteerd voor visualisatie. Vervolgens werd een multidimensionaal netwerk van "component-ziekte-KEGG-route" opgebouwd met behulp van netwerkanalysesoftware.

Moleculaire koppelingsanalyse
De top 10 belangrijkste actieve bestanddelen en de top 10 kerndoelen werden geselecteerd voor moleculaire dockinganalyse met behulp van AutoDockTools en PyMOL software^24,25. PDB-bestanden van de belangrijkste doelen werden gedownload uit een eiwitstructuurdatabase²⁶, en SDF-bestanden van de belangrijkste actieve componenten werden verkregen uit een chemische database²⁷. De eiwitmoleculen werden vervolgens voorbewerkt met moleculaire koppelingssoftware, waaronder ontzouting, hydrogenering en ladingsberekening. Semi-flexibele koppeling werd uitgevoerd met behulp van een rasterbox die de gehele eiwitbindingsplaats bedekte. Het koppelingsproces werd als succesvol beschouwd wanneer de bindingsenergie negatief was, en de wortel-gemiddelde-kwadraatdeviatie (RMSD) van de toppose ≤ 2,0 Å was. Na het koppelen werden de resultaten voor de belangrijkste actieve componenten van QUF3 met de kerndoelen gevisualiseerd met behulp van moleculaire visualisatiesoftware.

Moleculaire dynamica (MD) simulaties
MD-simulaties van het eiwit-ligandencomplex werden uitgevoerd met behulp van GROMACS-software om de interactie tussen receptoren en liganden te onderzoeken^28,29. Het amber99sb-ildn krachtveld en het algemene amberkrachtveld (GAFF) werden gebruikt om respectievelijk de parameters en topologieën van eiwitten en liganden te genereren. De grootte van de simulatiebox werd zo ingesteld dat de afstand tussen elk eiwitatoom en de rand van de box groter was dan 1,0 nm. De doos werd gevuld met een expliciet oplosmiddel met behulp van het eenvoudige puntladingsmodel (SPC216 watermoleculen), en watermoleculen werden vervangen door Na⁺- en Cl⁻-tegenbewegingen om het simulatiesysteem elektrisch neutraal te maken. Het hele systeem werd geoptimaliseerd met de steilste daalmethode om onredelijke contacten of atoomoverlap te verminderen. Voldoende pre-equilibratie van het simulatiesysteem werd bereikt door NVT- en NPT-ensembles uit te voeren voor elk 100 ps bij respectievelijk 300 K en 1 bar. Vervolgens werd een 100 ns MD-simulatie uitgevoerd onder periodieke randvoorwaarden, waarbij temperatuur (300 K) en druk (1 bar) werden geregeld met respectievelijk de V-rescale en Parrinello-Rahman methoden,³⁰. De Newtoniaanse bewegingsvergelijkingen werden opgelost met behulp van de leapfrog-integrator met een tijdstap van 2 fs. Langeafstands-elektrostatische interacties werden berekend met de Particle Mesh Ewald (PME)-methode met een Fourierafstand van 0,16 nm, en alle bindingslengtes werden beperkt met de LINCS-methode. De VMD-software werd gebruikt om trajecten³¹ weer te geven, analyseren en animeren. De bindingsvrije energie van elke verbinding werd berekend met behulp van een bindingsvrije-energie berekeningsscript.

Principal component analyse (PCA), vrije energielandschap (FEL) en dynamische kruiscorrelatiematrix (DCCM) analyse
PCA werd uitgevoerd met MD-simulatiesoftware om de dominante conformationele bewegingen van apo- en ligandgebonden complexen te analyseren. Covariantiematrices van Cα-atomaire fluctuaties werden gegenereerd, waaruit eigenvectoren (collectieve bewegingen) en eigenwaarden (bewegingsgrootte)³² werden verkregen. Belangrijke dynamische regio's en structurele flexibiliteit die samenhangen met ligandbinding werden door deze analyse geïdentificeerd. Moleculaire trajecten werden geprojecteerd op de eerste twee hoofdcomponenten (PC1 en PC2) met behulp van het gmx-anaeig-instrument, waarmee essentiële bewegingen³³ werden vastgelegd. Alleen de geëlicilibreerde eindfase van 100 ns (RMSD-stabiele fase) werd gebruikt voor PCA- en FEL-berekeningen. FEL is afgeleid uit de PCA-gegevens met behulp van gmx sham om de Gibbs vrije energie³⁴ te berekenen, waarmee stabiele conformaties en energieminima aan het licht komen die conformationele diversiteit en toestandsovergangen weerspiegelen. Dynamische kruiscorrelatiematrix (DCCM) analyse van Cα-atomen werd uitgevoerd om structurele dynamica en interresiduele bewegingskoppeling³⁵ te evalueren. Deze analyse verduidelijkte de stabiliteit, intermoleculaire interacties en collectieve bewegingen van de eiwit-ligandencomplexen. De kruiscorrelatiecoëfficiënt Cij tussen residuen i en j werd berekend als:

In de formule vertegenwoordigen de letters i en j de Cα-atomen van twee residuen. Wanneer de waarde van Cij positief is en groter dan nul; De twee atomen die in dezelfde richting bewegen, worden beschouwd als gecorreleerd in beweging. Wanneer de waarde van Cij negatief is en kleiner dan nul, worden de twee atomen die in tegengestelde richtingen bewegen beschouwd als in anti-gecorreleerde beweging. Een Cij-waarde van nul duidt op geen relatie tussen de bewegingen van de twee atomen. Bovendien werden Cij-waarden groter dan 0,7 geïnterpreteerd als sterk gecorreleerde (positieve) of sterk anti-gecorreleerde (negatieve) bewegingen. Om convergentie te verifiëren werden de RMSD- en Rg-profielen onderzocht. De stabiele profielen bevestigden dat de uiteindelijke 100 ns voldoende was voor DCCM-analyse. Deze bewegingspatronen toonden aan hoe ligandbinding intramoleculaire communicatie en domeinherschikkingen moduleert. Om dynamische stabiliteit en convergentie te waarborgen, werden alleen de laatste 100 ns van evenwichtige trajecten geanalyseerd, en werden correlatiekaarten gevisualiseerd om gebieden met significante dynamische wisselwerking te markeren.

Om de interactie-energie tussen eiwitten en liganden beter te verklaren, werd een bindingsvrije-energie-berekeningsscript gebruikt om de bindingsenergie van alle eiwit-ligandencomplexen in evenwicht te berekenen. Bij de toepassing van de bindingsvrije-energie berekeningsmethode³⁶ werd de totale bindingsenergie opgesplitst in vier onafhankelijke delen: elektrostatische interactie, van der Waals-interactie, polaire solvatie en niet-polaire solvatie-interactie. De term voor niet-polaire solvatie wordt meestal SASA genoemd.

Afsluiting van procedureel eindpunt voor doel- en padselectie
Aan het einde van de workflow werden de definitieve gevalideerde doelen en paden geselecteerd op basis van de volgende criteria: kerndoelen met de top 10 Degree-waarden in het PPI-netwerk, en belangrijke actieve componenten met de top 10 Degree-waarden in het H-C-T-netwerk. Voor KEGG-routes, na uitsluiting van die gerelateerd aan menselijke stofwisseling en ziekten, werden de top 20 routes gerangschikt en geselecteerd op basis van het aantal verrijkte doelen. MD-simulatieresultaten werden gebruikt om stabiele binding tussen topbestanddelen en kerndoelen te bevestigen. Deze stappen bepaalden gezamenlijk de uiteindelijke output van het protocol.

Resultaten

Screening van actieve bestanddelen en potentiële doelwitten van QUF3
Met OB ≥ 30% en DL ≥ 0,18 als screeningscriteria, werd QUF3 na het zoeken in de TCMSP-database 126 chemische componenten geïdentificeerd. Hiervan bevatte Paeoniae Radix Alba (Baishao) 13 actieve bestanddelen, Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang) bevatte 2, Cuscutae Semen (Tusizi) 13, Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi) 13, Herba Taxilli (Sangjisheng) 2, Radix Salviae (Danshen) 65, Cornus Officinalis Sieb. Et Zucc. (Shanzhuyu) beva...

Discussie

Er is groeiend bewijs dat het endometrium van patiënten met PCOS een verminderde functie vertoont, wat mogelijk samenhangt met hogere percentages innestelingsfalen en nadelige zwangerschapsuitkomsten⁴⁰. Endometriumverschillen bij vrouwen met PCOS worden voornamelijk gekenmerkt door verminderde expressie van pinopoden, nucleolaire kanaalsystemen, oestrogeenreceptoren en progesteronreceptoren tijdens het innestelingsvenster (WOI)⁴¹. Bovendien...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (Version 2.3)	Lab of Systems Pharmacology	https://www.tcmsp-e.com/load_intro.php?id=43	Database voor het screenen van actieve componenten
Swiss Target Prediction online database (2019 versie)	Molecular Modelling Group, University of Lausanne & SIB Swiss Institute of Bioinformatics	http://www.swisstargetprediction.ch/	Online doelwitvoorspellingsdatabase
PubChem database	National Library of Medicine, NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	Chemische database voor het ophalen van SMILES/SDF van verbindingen
UniProt database	NIH	https://www.uniprot.org/uniprotkb	Eiwitdatabase voor UniProt-ID's en gennamen
Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)	Johns Hopkins University	https://www.omim.org/	Ziektedoelwitdatabase
DrugBank	University of Alberta	https://www.drugbank.ca/	Ziektedoelwitdatabase
Therapeutic Target Database (TTD)	Zhejiang University	https://ttd.idrblab.cn/	Ziektedoelwitdatabase
GeneCards (Versie 5.26)	Weizmann Institute of Science, LifeMap Sciences	https://www.genecards.org/	Ziektedoelwitdatabase (relevantiescore >5)
Venny visualisatieplatform (Versie 2.1.0)	Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC)	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/	Online Venn-diagramtool voor het visualiseren van doelwitintersecties
Cytoscape (Versie 3.10.3)	National Resource for Network Biology, NHGRI	https://cytoscape.org/	Netwerkanalyse- en visualisatiesoftware voor H-C-T, PPI en pathwaynetwerken
STRING database (Versie 12.0)	STRING Consortium	https://string-db.org/	Eiwit-eiwitinteractiedatabase voor de constructie van PPI-netwerken
DAVID database (Versie v2025-2)	U.S. Department of Health & Human Services, NIH	https://davidbioinformatics.nih.gov/	Genverrijkingsanalysedatabase voor GO en KEGG
AutoDockTools (Versie 1.5.7)	The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/	Moleculair dockingsoftware voor voorverwerking en berekening
PyMOL software (Versie 3.0.3)	Schrödinger	https://pymol.org/	Moleculair visualisatiesoftware voor dockingvisualisatie
Protein Data Bank (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	Eiwitstructuurdatabase voor het downloaden van doelwit-PDB-bestanden
GROMACS (Versie 2023.2)	GROMACS development team	https://www.gromacs.org/	Software voor moleculaire dynamica-simulaties
VMD (Versie 1.9.3)	University of Illinois	https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/	Software voor moleculaire visualisatie en trajectanalyse
gmx_MMPBSA	Open-source (GitHub)	https://github.com/Valdes-Tresanco-MS/gmx_MMPBSA	Bindingvrije energieberekeningstool uit MD-trajecten
Science Data Bank	Chinese Academy of Sciences, Computer Network Information Center	https://www.scidb.cn/	Wetenschappelijk datarepository voor gegevensbeschikbaarheid en -deposities