Colony-Forming Unit assay aangepast voor door patiënten afgeleide beenmerg- en perifere bloedmononucleaire cellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een procedure voor het induceren van differentiatie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen afkomstig van het beenmerg en perifere bloed mononucleaire cellen. De assay gebruikt een halfvaste kweekmedium ter ondersteuning van erythroïde en myeloïde lijnbinding en bevat gestandaardiseerde metrics voor reproduceerbare kolonieclassificatie voor preklinische geneesmiddelkarakterisering.

Samenvatting

De colony-forming unit (CFU) assay is een fundamentele techniek voor het bestuderen van hematologische ziekten, waaronder myelodysplastische syndromen (MDS) en acute myeloïde leukemie (AML). Deze test maakt gebruik van halfvaste media aangevuld met gedefinieerde cytokinecombinaties om driedimensionale groei en lijnspecifieke differentiatie van erytroide en myeloïde voorlopercellen te ondersteunen. Echter, perifere bloed- en beenmergmonsters afkomstig van patiënten brengen technische uitdagingen met zich mee vanwege verminderde levensvatbaarheid, verhoogde gevoeligheid voor hantering en variabiliteit in koloniegroei. Bovendien tonen bestaande richtlijnen voor het identificeren en tellen van kolonies aanzienlijke variabiliteit in het definiëren van koloniegrootte en afstammingstypes, waardoor reproduceerbaarheid tussen studies beperkt wordt. Het hierin beschreven protocol is geoptimaliseerd voor de groei en differentiatie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen die zijn geïsoleerd uit MDS- en AML-patiëntenmonsters. Het protocol legt de nadruk op voorzichtige celbehandeling, steriele verwerking van patiëntmonsters, geoptimaliseerde kweekomstandigheden en groeitijden afgestemd op door patiënten afgeleide cellen. Dit protocol biedt een praktisch kader voor CFU-assays met behulp van door patiënten afgeleide monsters en stelt een standaardmaatstaf vast voor consistente kolonietelling en analyse in hematologisch maligniteitsonderzoek.

Inleiding

Hematopoëse is een streng gereguleerd proces waarbij hematopoëtische stamcellen (HSC's) die zich in beenmergniches bevinden, aanleiding geven tot alle volwassen bloedcellijnen. Door een hiërarchische reeks differentiatiegebeurtenissen genereren HSC's multipotente voorlopers die geleidelijk zich verbinden aan erythroïde, myeloïde en lymfoïde lijnen voordat ze eindelijke rijping ondergaan tot functionele circulerende bloedcellen. Dit proces wordt geleid door gecoördineerde signalering binnen de beenmergmicroomgeving en door intrinsieke transcriptie- en epigenetische reguleringsmechanismen. Verstoringen van deze regulerende routes, met name door de ophoping van genetische of somatische mutaties in HSC's, kunnen de normale differentiatie verstoren en leiden tot klonale uitbreiding van abnormale voorlopers. Dergelijke veranderingen kunnen uiteindelijk leiden tot hematologische aandoeningen die worden gekenmerkt door ineffectieve hematopoëse en cytopenieën, waaronder myelodysplastische syndromen (MDS) en acute myeloïde leukemie (AML)1,2,3,4,5.

De colony-forming unit (CFU) assay is een goed gevestigde in vitro techniek voor het evalueren van het differentiatiepotentieel van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's). Oorspronkelijk ontwikkeld als een kortdurende assay om het proliferatie- en differentiatievermogen van hematopoëtische voorlopers ^6,7,8 te meten, is de CFU-assay sindsdien een veelgebruikt hulpmiddel geworden in zowel klinische als experimentele^hematologie. In preklinische laboratoriumomgevingen wordt de assay vaak gebruikt om de impact van genetische verstoringen of kandidaat-therapieën op hematopoëtische differentiatie te beoordelen. Binnen de context van MDS- en AML-onderzoek bieden CFU-assays een functioneel inzicht in hoe moleculaire en genetische veranderingen de differentiatiecapaciteit van door patiënten afgeleide beenmerg of perifere bloedcellen beïnvloeden.

De CFU-assay omvat het cultiveren van HSPC's in een op methylcellulose gebaseerd halfvaste medium, aangevuld met gedefinieerde groeifactoren die de lijnspecifieke expansie en differentiatie ondersteunen. Onder deze omstandigheden vermenigvuldigen voorlopercellen en vormen ze afzonderlijke kolonies, die morfologisch kunnen worden geclassificeerd op basis van afstammingsidentiteit. Een commercieel verkrijgbaar op methylcellulose gebaseerd halfvast medium dat geoptimaliseerd is voor differentiatie tussen erytroïden en myeloïden wordt in dit protocol gebruikt. Het medium bevat een combinatie van cytokines, waaronder interleukine-3 (IL-3), interleukine-6 (IL-6), stamcelfactor (SCF), erytropoëtine (EPO), granulocytkoloniestimulerende factor (G-CSF) en granulocyten-macrofage kolonie-stimulerende factor (GM-CSF). Samen ondersteunen deze factoren de groei van erytroïde voorlopers zoals kolonievormende unit-erytroïde (CFU-E) en burst-vormende unit-erytroïde (BFU-E), myeloïde granulocyt-macrofagen voorlopers (CFU-GM), en multipotente voorlopers zoals granulocyten, erytrocyten, monocyten, megakaryocyten (CFU-GEMM)^10,11.

Ondanks zijn brede nut is het hierboven genoemde halfvaste medium beperkt in zijn differentiatiecapaciteit, omdat het de differentiatie van megakaryocyten en bloedplaatjes niet voldoende ondersteunt. Voor deze toepassingen zijn meer gespecialiseerde formuleringen met bloedplaatjesgroeifactoren geschikter; Ze vallen echter buiten de scope van het beschreven protocol. Over het algemeen kunnen onderzoekers door zorgvuldige selectie van mediaformulering gecombineerd met morfologische beoordeling en downstream-analyses zoals flowcytometrie de medicijngevoeligheid effectief evalueren via analyse van lineagecommitment en differentiatiepotentieel¹².

In deze studie wordt de CFU-assay gebruikt om het therapeutisch potentieel van combinatietherapieën voor de behandeling van terugkerende/refractaire hoog-risico MDS te onderzoeken. Pyrimethamine is een klinisch goedgekeurd antifolaat dat wordt gebruikt voor de behandeling van toxoplasmose en parasitaire malaria, en is recentelijk onderzocht als antikankermiddel^. Recente studies hebben aangetoond dat de behandeling met pyrimethamine kan werken door het remmen van belangrijke routes die de de novo pyrimidinesynthese reguleren¹⁶. Hier in dit protocol worden CFU-assays gebruikt om de klinische effectiviteit van pyrimethamine als single-agent therapie en als combinatietherapie met Venetoclax te onderzoeken, een huidige frontlinietherapie voor MDS- en AML-behandeling^17,18.

Ondanks de brede bruikbaarheid kent de CFU-assay verschillende technische beperkingen. Kolonieidentificatie en classificatie zijn sterk afhankelijk van morfologische criteria, wat variabiliteit kan veroorzaken tussen waarnemers en tussen onderzoekscentra 6,19,20,21. Daarnaast vertonen door patiënten afgeleide monsters van personen met MDS of AML vaak verminderde cellevensvatbaarheid, verhoogde fragiliteit en heterogeniteit, wat de vorming van kolonies en analyses stroomafwaarts kan bemoeilijken^. Het voorbereiden van kolonies voor verdere karakterisering, inclusief flowcytometrie, kan daarom zorgvuldig worden behandeld om de celintegriteit te behouden. Het ontbreken van gestandaardiseerde procedures voor kolonie-identificatie, telling en downstream analyse draagt verder bij aan variabiliteit tussen de studies. Deze technische overwegingen benadrukken de noodzaak van gestandaardiseerde procedures die specifiek zijn geoptimaliseerd voor door patiënten afgeleide hematopoëtische monsters.

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde workflow voor het uitvoeren van CFU-assays met mononucleaire cellen afkomstig van primaire beenmerg- of perifere bloedmonsters van patiënten met hematologische maligniteiten. De aanpak richt zich op praktische strategieën voor het omgaan met gevoelige patiënt-afgeleide cellen, het vaststellen van betrouwbare kweekomstandigheden en het implementeren van consistente criteria voor kolonie-identificatie en kwantificatie. Door gedetailleerde methodologische richtlijnen te bieden en de nadruk te leggen op reproduceerbare analysepraktijken, streeft dit protocol ernaar een betrouwbaardere evaluatie van hematopoëtische differentiatie en therapeutische respons in preklinische studies van MDS en AML te faciliteren.

Protocol

Deze studie maakt gebruik van gedeïdentificeerde menselijke biospecimens die zijn verkregen uit een biobank onder een door de Institutional Review Board goedgekeurd protocol, "Molecular Biology of Benignant and Malignant Hematological Disorders" (IRB Protocol #200536), aan het Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de instelling. Alle reagentia en apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbereiding van door patiënten afgeleide beenmerg- of perifere bloed mononucleaire cellen

OPMERKING: Volgens de gangbare richtlijnen voor het behandelen van patiëntenmonsters wordt aanbevolen een laboratoriumjas van de hele lengte te dragen en scheurbestendige wegwerphandschoenen in het laboratorium te werken en onder een laboratoriumcelkweekkap te werken ter persoonlijke bescherming tegen blootstelling aan bloedovergedragen ziekteverwekkers. Alle pipettips en serologische pipetten die in contact komen met patiëntcellen moeten minstens 30 minuten worden geweekt in een bleekoplossing van 10% voordat ze worden verwijderd in biohazard afval.

1. Experimentele voorbereiding
   1. Warm IMDM-medium, foetaal rundserum (FBS) en penicilline-streptomycine (Pen-strepto) antibiotica tot 37 °C gedurende minstens 30 minuten.
   2. Ontdooide halfvaste media in 4 °C 's nachts. Op de dag van het opmaken verwarm je de fles minstens 30 minuten tot kamertemperatuur (RT).
   3. Steriliseer de celkweekkap met UV-sterilisatie gedurende 15 minuten, en spuit daarna de afzuigkapoppervlakken, pipetten en buisrekken met 70% ethanol (EtOH).
   4. Bereid een afvalbeker voor met een bleekoplossing van 10% die groot genoeg is om besmette pipetpunten en serologische pipetten te verzamelen.
   5. Verkrijg beenmerg- of perifere bloed mononucleaire cellen die geïsoleerd zijn via dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethoden. Cellen kunnen op dezelfde dag van verzameling worden gebruikt of uit ingevroren, biobank-monsters.
2. Als monsters bevroren zijn, ontdooi ze dan snel in een waterbad van 37 °C totdat het grootste deel van het ijs is gesmolten en er slechts een klein ijskristal overblijft. Leg de monsters direct op ijs na het ontdooien.
   OPMERKING: Patiëntenmonsters zijn erg gevoelig voor ontdooien. Het is belangrijk om monsters zo snel mogelijk en in batches te ontdooien om celdood te minimaliseren.
3. Suspendeercellen in 5 mL verwarmde complete groeimedia (IMDM-media aangevuld met 4% FBS en 1% Pen-Strep).
4. Bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid met behulp van AO/PI kleurstof en een geautomatiseerde celteller.
5. Centrifugeer de cellen op 350 x g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur om de cellen te pelleten. Gooi supernatant weg.
6. Resuspendeer cellen in 5 mL steriele Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Herhaal centrifugatie naar pelletcellen en gooi supernatant weg.
7. Suspendeer cellen in complete groeimedia tot een concentratie van 2 miljoen levende cellen/mL. Bereid genoeg cellen voor voor 100.000 cellen per put van een 6-put plaat.

2. Geneesmiddelvoorbereiding en behandelingstoediening.

OPMERKING: Pyrimethamine wordt verkregen als een gelyofilieerd poeder en wordt intern gereconstitueerd in dimethylsulfoxide (DMSO) bij een concentratie van 100 mM; aliquots worden opgeslagen bij −80 °C. Venetoclax wordt vooraf opgelost gekocht in DMSO bij een concentratie van 10 mM en opgeslagen bij -20 °C. Voor dit experiment worden venetoclax en pyrimethamine als één dosis toegediend via vrije opname parallel aan een voertuigcontrole-DMSO-behandeling.
VOORZICHTIG: Pyrimethamine, venetoclax en DMSO zijn biohazard agentia. Hanteer alleen onder de motorkap, draag PBM, en gebruik het extra voorzichtig.

1. Op de dag van het opmaken ontdooi je het medicijn Aliquot op ijs, vortex, en draai je 30 seconden op maximale snelheid op een mini-centrifuge op tafel.
2. Vortex en meng een fles halfvaste media krachtig totdat alle componenten gehomogeniseerd zijn. Laat de afzuigkap 30 minuten ongestoord op kamertemperatuur staan zodat de belletjes naar het oppervlak kunnen stijgen.
3. Bereid 3 mL aliquots halfvaste media voor in steriele 15 mL conische buizen. Laat de buizen 30 minuten onaangeroerd blijven zodat de bellen naar het oppervlak kunnen stijgen. Extra halfvaste media-aliquots kunnen opnieuw worden ingevroren en opgeslagen bij -20 °C voor later gebruik.
4. Voeg niet meer dan 10 μL geneesmiddelvolume toe aan het halfvaste medium. Voor dit experiment worden de concentraties venetoclax en pyrimethamine aangepast volgens empirisch bepaalde synergetische omstandigheden. Voeg aan een voertuigcontrolegroep equivalente volumes DMSO toe. Bereid dubbele 3 mL aliquots voor voor elke conditie.
   OPMERKING: Het is belangrijk om het volume toegevoegde geneesmiddel verwaarloosbaar te houden, zodat het de uiteindelijke concentratie van het geneesmiddel in het halfvaste medium niet beïnvloedt.
5. Vortex media in 4–5 korte bursts om het middel volledig in de media te integreren.
   OPMERKING: Houd het celmengsel niet voor langere tijd op de vortexor, omdat dit celdood kan veroorzaken.
6. Voeg 100 μL cellen of een gelijk volume van 200.000 cellen toe aan de 3 mL aliquots van halfvaste media. Vortexmengsel in korte bursts totdat het volledig is opgenomen/gehomogeniseerd.
7. Bevestig een stompe 16 G naald aan een 3 mL spuit en laat de naald en spuit in het celmengsel vallen. Laat het 30 minuten onaangeroerd zodat de bellen naar het oppervlak kunnen stijgen.

3. Platering van met medicijnen behandelde celsuspensie.

1. Met een ondergedompelde naald en spuit neem je het cel- en medicijnmengsel op, waarbij je voorzichtig bent om geen luchtbellen te ademhalen. Wacht 3–5 minuten en neem dan het resterende mengsel op dat zich aan de zijkanten van de 15 mL conische buis heeft verzameld.
2. In een steriele 6-well plaat voeg je het celmengsel druppelwijs toe, waarbij grote druppels afwisselend worden gebruikt tussen 2 putten van een buitenste kolom van de plaat. Verspreid het mengsel door de plaat voorzichtig in cirkelbewegingen te kantelen, zodat de hele bodem van de holen gelijkmatig wordt bedekt. Deze twee putten vormen technische replicata.
   OPMERKING: Als er bubbels ontstaan of per ongeluk aan de putten worden toegevoegd, gebruik dan een pipetfiltertip om de bellen voorzichtig te laten knappen of naar de rand van de plaat te verplaatsen. Grote belletjes die in de plaat achterblijven, kunnen de groei van kolonies beïnvloeden.
3. Voeg het kolonie-assaymengsel alleen toe aan de buitenste kolommen van de 6-put plaat. Voeg aan de middenkolom 5 ml steriel water toe aan elke put. Water toevoegen aan de putten zorgt ervoor dat er voldoende vocht aanwezig is om te voorkomen dat het halfvaste medium uitdroogt.
4. Incubeer de plaat in een incubator van 37 °C met 5%_CO2. Controleer de celgroei en het waterpeil 2x per week. Cellen moeten ongeveer 7 dagen na het plateren kolonies vormen die met het oog zichtbaar zijn, en platen moeten ergens tussen 14–21 dagen na het plateren een samenvloeiing van 75%–80% bereiken.

4. Koloniebeeldvorming en -telling

OPMERKING: Dit protocol beschrijft parameters die gevalideerd zijn voor gebruik op het EVOS M7000 beeldvormingssysteem. Deze instellingen moeten mogelijk worden geoptimaliseerd of aangepast voor compatibiliteit met andere plaatbeeldvormingssystemen.

1. Verwijder de beschermende lichtfilterkap van het microscoopplatform. Zet de microscoop aan en open het bijbehorende softwareprogramma.
2. Plaats een lichtdiffuser in de bovenste lens van het microscoopapparaat.
3. Plaats de plaatpositie op het platform zodat put A1 linksboven staat.
4. Voer in de beeldvormingssoftware de volgende focus-instellingen in:
   1. Selecteer het vat dat gefotografeerd moet worden. In dit protocol wordt een 6-put plaat gebruikt.
   2. Stel het doel in op 4X.
   3. Selecteer de lichtbron als Trans of schakel de microscoop over op brightfield-modus.
   4. Zet het microscooplicht aan en stel handmatig de lichtintensiteit aan met de grove schuifregelaar. Voor het instrument dat in dit protocol wordt gebruikt, is het optimale bereik voor beeldvormingskolonies ongeveer 0,03.
   5. Als er een autofocusfunctie op het instrument staat, gebruik die dan om de scherpstelling aan te passen. Stel indien nodig de scherpstelling verder aan met de handmatige fijne scherpstelinstellingen.
5. Voer de volgende automatische beeldopname-instellingen in:
   1. Selecteer het gehele putgebied dat in elke put in beeld moet worden genomen.
   2. Selecteer de geautomatiseerde beeldopname om te beginnen vanuit het midden van de put en spiraalvormig naar buiten te spiraalen richting de randen van de put.
   3. Selecteer autofocus-instellingen zodat het instrument in elke put opnieuw scherpstelt.
   4. Selecteer dat de raw-afbeeldingen in elke put worden getiled/merged samengevoegd.
   5. Selecteer dat de afbeeldingen horizontaal en verticaal worden omgekeerd.
   6. Selecteer de instellingen voor gegevensopslag om "tegelafbeelding" en "samengevoegde afbeelding" te verzamelen.
   7. Voer de automatische kentekenscan uit. Het instrument dat in dit protocol wordt gebruikt, draait op een snelheid van 1,5 min/well.
   8. Verwijder de plaat, plaats het beschermfilterdeksel over het microscoopplatform, zet de microscoop uit en sluit de software.
   9. Na beeldvorming telt u het totale aantal individuele kolonies evenals myeloïde en erytroïde subtypes in elke put handmatig met behulp van de betegelde merged put-afbeeldingen.
6. Definieer kolonies volgens de volgende morfologische karakterisering:
   1. Beschouw een individuele kolonie of koloniecluster als onderscheidend wanneer deze ver genoeg van een andere celpopulatie verwijderd is, een afstand gelijk aan zijn eigen lengte. Populaties die binnen deze afstandsgrens vallen, worden gegroepeerd in één kolonietelling.
   2. Zorg ervoor dat de erythroïde kolonies diep gepigmenteerd zijn en donkerrood van kleur zijn. Deze kolonies verschijnen als dicht groeiende enkele populaties of clusters met duidelijk afgebakende randen. Kleinere erythroïde kolonies bestaande uit langzaam groeiende onvolwassen celpopulaties worden geclassificeerd als CFU-E. Grotere kolonies met volwassenere populaties worden geclassificeerd als BFU-E.
   3. Controleer of de myeloïde kolonies cellen bevatten die doorschijnender lijken en lichter van kleur zijn. Myeloïde kolonies zijn meer verspreid en bevatten geen duidelijk afgebakende randen. Myeloïde kolonies groeien vaker als losse populaties dan als clusters, hoewel clusters soms ook kunnen worden gezien. In beide gevallen worden myeloïde kolonies geclassificeerd als CFU-GM.
   4. Classificeer de gemengde kolonies die zowel erytroïde als myeloïde subtypes bevatten als CFU-GEMM.

5. Celoogst en bevriezen voor downstream analyse via flowcytometrie

1. Voer de onderstaande stappen uit voordat je begint:
   1. a. Bereid een fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuffer voor en verwarm deze (FACS-buffer, bestaande uit DPBS/4% FBS) en vriesmedium (FBS/10% DMSO) in een 37 °C waterbad gedurende minstens 30 minuten.
2. Voeg 5 ml verwarmde FACS-buffer toe aan het oppervlak van elke put. Incubeer platen minstens 30 minuten in een incubator van 37 °C om het halfvaste medium op te lossen.
3. Sussen de cellen grondig opnieuw met een 5 mL pipet en overbrengen naar een steriele 50 mL conische buis.
4. Met 5 ml verwarmde FACS-buffer spoelt u elke put drie keer en brengt het volledige volume over in de 50 mL conische buis.
5. Sussen cellen goed door in 4–5 korte bursts te vortexen, en centrifugeer dan op 400 x g gedurende 10 minuten bij RT naar pelletcellen. Als de pellet na centrifugatie niet zichtbaar is, blijven de cellen hangen in halfvaste media. Zonder te aspireren, voeg je extra 10–15 mL DPBS toe aan de buis om het halfvaste medium verder te verdunnen en goed te herstellen. Indien nodig incubeer je bij 37 °C gedurende 10–15 minuten om het medium volledig op te lossen, en daarna opnieuw pelletcellen.
6. Aspiraat het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in een 10 mL FACS-buffer. Centrifugeer op 400 x g gedurende 10 minuten bij RT om pelletcellen te gebruiken.
7. Sussifiseer cellen opnieuw in vriesmedia en aliquot 3 miljoen cellen/cryoviaal. Vries de flesjes in een vriescontainer met gecontroleerde snelheid bij -80 °C gedurende 24 uur om 1 °C per minuut koelsnelheid te bereiken.
8. Breng cryovials zo snel mogelijk over naar vloeibare stikstofopslag.
   OPMERKING: Monsters die langdurig op -20 °C worden gehouden, zullen de levensvatbaarheid verminderen. Het is belangrijk om cellen over te zetten naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

Resultaten

Figuur 1 illustreert de kolonie-assaypijplijn van patiëntmonsterisolatie tot analyse van kolonietellingen en koloniemorfologie. Figuur 2 toont belangrijke instellingen voor beeldkolonies op een brightfield-microscoop. Figuur 3 en Figuur 4 tonen representatieve beelden van kolonievorming van een enkel door de patiënt afgeleid monster 13 dagen na ...

Discussie

Het hier beschreven protocol beschrijft een geoptimaliseerde workflow voor het uitvoeren van CFU-assays met primaire beenmerg- en perifere bloedmonsters van patiënten, met bijzondere aandacht voor het behouden van cellevensvatbaarheid en het waarborgen van reproduceerbare koloniegroei. Verschillende stappen in het protocol zijn cruciaal voor het bereiken van betrouwbare kolonievorming bij het werken met door patiënten afgeleide monsters. Snelle ontdooiing van cryoppreserve mononucleaire ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Blunt-End 16 G naalden	STEMCELL Technologies	28110	voor het doseren en plateren van MethoCult media
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	celteller
CHT4 Telkamers (celteller slides)	Revvity	CHT4-SD100-002	slides voor celteller
Dimethyl sulfaat	Fisher Bioreagents	BP231-100	gebruikt voor geneesmiddelen reconstitutie en celvriesmedia
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	voor celkweek
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, Inc.	2701	voor sterilisatie van celkweekoppervlakken
EVOS M7000 beeldvormingssysteem	ThermoFisher Scientific	AMF7000	voor kolonie- en plaatbeeldvorming
Fetaal runderserum	BenchMark	100-106	media aanvulling voor celkweek en invriezen
IMDM Gemodificeerd Kweekmedia	Cytiva	SH30228.01	verrijkt kweekmedia geschikt voor het hanteren van patiëntenmonsters
LuerLok Tip 3 mL Spuiten	BD	309657	voor het doseren en plateren van MethoCult media
MethoCult H4435 Verrijkt	STEMCELL Technologies	04435	methylcellulose-gebaseerd semisolid media voor kolonie assay
Multiwell 6-well plaat	FALCON	353046	voor kolonie assay plateren
Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescerende Microscoop	Coastal Microscopes	51623	Voor kolonie morfologie beeldvorming en karakterisering
Pen Strep	Gibco	15140-122	antibioticum supplement voor celkweek
pyrimethamine	Sigma-Aldrich	46706	FDA-goedgekeurde antifolate
UltraPure Gedestilleerde water	Invitrogen	10977-015	voor kolonie assay plateren
venetoclax	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	FDA-goedgekeurde chemotherapie
ViaStain AOPI Kleuringsoplossing	Revvity	CS2-0106	levensvatbaarheidskleuring voor het tellen van levende cellen