Pankankerbio-informatica analyse gecombineerd met experimentele validatie van darmkanker: een studie naar TMED3 als diagnostische en prognostische biomarker

Samenvatting

Dit protocol combineert pankankerbio-informatica analyse met immunohistochemische validatie bij darmkanker om de expressie van Transmembrane Emp24 Protein Transport Domain 3, prognostische significantie, immuunassociaties en gerelateerde biologische routes te evalueren met behulp van openbare multiomics-databases en klinische weefselmonsters.

Samenvatting

Transmembrane Emp24 Protein Transport Domain 3 (TMED3), een lid van de p24-eiwitfamilie, is in verband gebracht met tumorproliferatie, invasie en migratie. Deze studie had als doel de expressiepatronen, de prognostische significantie, immuunassociaties en mogelijke biologische functies van TMED3 over meerdere kankertypen te evalueren met behulp van pankankerbio-informatica analyse gecombineerd met immunohistochemische (IHC) validatie bij darmkanker. Multiomics-datasets uit de databases The Cancer Genome Atlas, Genotype-Tissue Expression, UALCAN, Human Protein Atlas en cBioPortal werden geanalyseerd om TMED3-expressie en genetische veranderingen bij pankanker te onderzoeken. Immunohistochemie werd uitgevoerd om TMED3-eiwitexpressie in het weefsel van darmkanker te evalueren. Kaplan–Meier overlevingsanalyse en Cox-regressieanalyse werden gebruikt om de prognostische waarde van TMED3 te beoordelen. Spearman-correlatieanalyse werd uitgevoerd om de associaties van TMED3 met tumormutatiebelasting, microsatellietinstabiliteit (MSI), immuuncelinfiltratie en immuuncontrolepunten te evalueren. Gene Set Enrichment Analysis werd uitgevoerd om mogelijke biologische routes te onderzoeken die geassocieerd zijn met TMED3 bij darmkanker. TMED3-expressie was verhoogd bij de meeste tumortypen en werd geassocieerd met ongunstige algehele overleving en ziekte-specifieke overleving bij adrenocorticaal carcinoom, colonadenocarcinoom en uveaal melanoom. De grootste frequentie van TMED3 genetische veranderingen werd vastgesteld bij mesothelioom, waarbij amplificatie het overheersende type veranderde vormt. Daarnaast toonde TMED3-expressie significante correlaties met tumormutatielast en microsatellietinstabiliteit bij niernier-clearcellencarcinoom, maagadenocarcinoom en baarmoedercorpusendometriumcarcinoom. TMED3-expressie was ook geassocieerd met immuuninfiltratie en immuuncontrolepuntexpressie in verschillende tumoren. IHC-analyse toonde een verhoogde TMED3-expressie aan in het weefsel van darmkanker in vergelijking met normale colonweefsels en toonde een associatie met het T-stadium. Functionele verrijkingsanalyse identificeerde routes gerelateerd aan ribosoom, antigeenverwerking en presentatie, oxidatieve fosforylering en pentosefosfaat. Deze bevindingen geven aan dat TMED3 mogelijk een veelbelovende biomarker is voor de diagnose en prognostische evaluatie van darmkanker en andere tumortypen.

Inleiding

De Transmembrane Emp24 Domain (TMED) eiwitfamilie bestaat uit vier subfamilies (α, β, γ en δ) die gewoonlijk voorkomen als monomeren, dimeren of oligomere complexen in eukaryote cellen. Leden van de TMED-familie zijn betrokken bij intracellulaire vesikelhandel en zijn betrokken bij diverse menselijke ziekten, waaronder kanker, immuungerelateerde aandoeningen, diabetes, neurodegeneratieve ziekten, niet-alcoholische leververvetting, gedilateerde cardiomyopathie, mucine 1 nierziekte (MKD) en het Sjögren-syndroom (SS)¹. Transmembrane emp24 domeinbevattend eiwit 3 (TMED3), een lid van de p24-eiwitfamilie, is een sterk geconserveerd single-pass type I transmembrane eiwit dat gecodeerd is op chromosoom 15q25.1 bij mensen ^2,3. Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat TMED3 abnormaal tot expressie komt in verschillende maligniteiten en betrokken is bij tumorinitiatie, proliferatie, invasie, metastase en progressie van tumoren. Verhoogde TMED3-expressie is gerapporteerd bij osteosarcoom⁴, longplaveiselcelcarcinoom⁵, borstkanker⁶, endometriumcarcinoom⁷ en colorectale kanker⁸. Experimentele studies hebben aangetoond dat onderdrukking van TMED3-expressie de proliferatie van tumorcellen, het metastaserende vermogen en anti-apoptotische activiteit remt, waardoor de tumorprogressie wordt beperkt. Bij glioom is TMED3-overexpressie geassocieerd met een hogere tumorgraad en een slechtere prognose, en TMED3 is gerapporteerd als bevorderaar van glioblastoomprogressie door regulatie van ZBTB7A⁹. Hoewel eerdere onderzoeken de biologische rol van TMED3 in specifieke tumortypen hebben onderzocht, zijn de expressiepatronen, de prognostische betekenis en moleculaire functies bij pankanker nog niet systematisch gekarakteriseerd.

Recente vooruitgang in multiomics-databases en bio-informatica-analyse heeft systematische evaluatie van genexpressie, prognose, immuunkenmerken en moleculaire veranderingen tussen verschillende tumortypes mogelijk gemaakt. In vergelijking met enkelcohortstudies biedt geïntegreerde pankankeranalyse met behulp van publiek beschikbare databases een bredere aanpak voor het identificeren van potentiële biomarkers en therapeutische doelwitten over kankers heen. In de huidige studie werden uitgebreide bio-informatische analyses uitgevoerd om de rol van TMED3 over meerdere kankertypen te onderzoeken met behulp van publiek beschikbare multiomics-databases, waaronder The Cancer Genome Atlas (TCGA), Genotype-Tissue Expression (GTEx), UALCAN, Human Protein Atlas en cBioPortal. De studie evalueerde systematisch TMED3-expressiepatronen, klinisch-pathologische kenmerken, prognostische significantie, immuungerelateerde associaties en mogelijke biologische functies bij pankanker. Daarnaast werd immunohistochemische (IHC) analyse uitgevoerd in colonkankerweefsels om TMED3-eiwitexpressie en de associatie ervan met klinisch-pathologische kenmerken te valideren. Onze pankankeranalyse dient als screeningsstrategie om kandidaatbiomarkers te identificeren. Vervolgens voerden we experimentele validatie uit, specifiek bij colorectale kanker (CRC). De resultaten tonen aan dat TMED3 een veelbelovende prognostische biomarker is in CRC, hoewel de relevantie voor andere kankertypen verder onderzoek vereist.

Protocol

Alle procedures met menselijk weefsel werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele bioveiligheids- en ethische richtlijnen en in een gecertificeerde biologische veiligheidskast. Het studieprotocol werd goedgekeurd door de Research Ethics Committee van het Tangshan Central Hospital (nr. TZYL/K/2023-16), en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers vóór de monsterafname.

Dataverzameling
TMED3-expressieprofielgegevens van verschillende tumoren en ongepaarde normale weefsels werden verkregen uit de TCGA- en GTEx-databases^10,11 (TCGA: https://portal.gdc.cancer.gov/; GTEx: https://gtexportal.org/; geraadpleegd op 1 juli 2025). Wilcoxon rank-sum tests werden uitgevoerd om de differentiële TMED3-expressie tussen tumor en ongepaarde normale weefsels te analyseren. Transcript per miljoen (TPM)-genormaliseerde RNA-sequencing-expressiematrices, gedownload van UCSC Xena, werden gebruikt voor downstream analyses. Expressiewaarden werden geharmoniseerd met log₂(TPM + 1) transformatie vóór statistische analyse. TMED3-expressiegegevens voor 33 tumortypen en gematchte normale weefsels werden vervolgens gedownload uit de TCGA-database. Wilcoxon signed-rank tests werden gebruikt om de differentiële TMED3-expressie tussen tumoren en gematchte normale weefsels te evalueren. Differentiële TMED3-eiwitexpressie tussen tumor en normale weefsels werd verkregen uit de UALCAN-database¹² (http://ualcan.path.uab.edu; geraadpleegd op 1 juli 2025). De module voor proteomics-analyse werd geraadpleegd en de optie "Pan-cancer View" werd geselecteerd voor analyse. Eiwitexpressie-analyses werden uitgevoerd met behulp van de CPTAC-datasets die beschikbaar zijn via de UALCAN "Pan-cancer View" module met standaardinstellingen voor het platform en zonder extra monsterfiltering.

Analyse van klinisch-pathologische kenmerken
Klinisch-pathologische informatie van 33 tumortypen in de TCGA-database werd verzameld om de relatie tussen TMED3-expressie en het pathologische stadium te onderzoeken. Tumorstadia werden ingedeeld in vroegstadium (stadium I–II) en gevorderde fase (stadium III–IV) groepen. Verschillen in TMED3-expressie tussen stadiagroepen werden geëvalueerd met behulp van Wilcoxon rangsomtesten over meerdere kankertypen.

Prognostische analyse
Gegevens over overlevingstijd en overlevingsstatus van 33 tumortypen werden verkregen voor prognostische analyse. Normale gevallen en gevallen zonder klinische informatie werden uitgesloten. Ontbrekende waarden werden behandeld op basis van de ontbrekendheid van elke variabele. TMED3-expressie werd verdeeld in groepen met hoge en lage expressie volgens de mediane expressiewaarde. Het survival-pakket (Versie 3.2-7) in R-statistische analysesoftware (versie 4.2.1) werd gebruikt om Cox-regressieanalyses van proportionele gevaren uit te voeren. De resultaten werden visualiseerd met behulp van de survminer- en ggplot2-pakketten. Algehele overleving (OS) werd gedefinieerd als het interval van diagnose tot overlijden door welke oorzaak dan ook, terwijl ziekte-specifieke overleving (DSS) werd gedefinieerd als het interval van diagnose tot dood dat aan de specifieke kanker kan worden toegeschreven, waarbij sterfgevallen die niet gerelateerd zijn aan de maligniteit als gecensureerde gebeurtenissen werden behandeld. Vervolgens werden Kaplan–Meier overlevingsanalyses uitgevoerd om de relaties tussen TMED3-expressie en zowel OS als DSS bij colonadenocarcinoom (COAD) te beoordelen.

Mutatieanalyse
De cBioPortal-database (www.cbioportal.org; geraadpleegd op 5 juli 2025) werd gebruikt om de frequentie van TMED3-genetische veranderingen te analyseren bij 33 kankertypen¹³. De cBioPortal-website werd bezocht en "TMED3" werd ingevoerd in de snelle zoekbalk om het mutatieprofiel van TMED3 over meerdere kankertypen te analyseren. Genetische veranderingen van TMED3 omvatten voornamelijk mutatie, amplificatie, diepe deletie en meervoudige veranderingen. Standaard pankankerstudies en query-instellingen beschikbaar in cBioPortal werden gebruikt voor mutatieanalyse zonder extra filtering.

Correlatieanalyse van DNA-methylering
DNA-methylatieanalyse werd uitgevoerd om de promotormethylatiestatus van TMED3 in tumoren en normale weefsels te evalueren met behulp van de UALCAN-database (https://ualcan.path.uab.edu/; geraadpleegd op 5 juli 2025). De DNA-methylatiestatus van het TMED3-promotorgebied werd geanalyseerd met behulp van Level 3-methylatiegegevens die werden gegenereerd van het Illumina Infinium HumanMethylation450K-platform in TCGA. Methylatieniveaus werden uitgedrukt als β waarden, berekend als β = intensiteit van gemethyleerde probe / (intensiteit van de gemethyleerde probe + intensiteit van niet-gemethyleerde probe), met waarden variërend van 0 (niet-gemethyleerd) tot 1 (volledig gemethyleerd). CpG-probes binnen 1500 bp stroomopwaarts van de transcriptiestartplaats (TSS), waaronder de TSS200- en TSS1500 regio's gedefinieerd door UALCAN, werden geanalyseerd om de methylatiestatus van promotor te evalueren. UALCAN extraheerde automatisch alle beschikbare CpG-probes binnen het promotorgebied van het doelgen zonder extra filtering. Methylatiewaarden β van pankanker- en normale weefsels werden verkregen, en er werden ongepaarde twee-steekproef t-tests uitgevoerd om verschillen tussen groepen te vergelijken. Er werd een significantiedrempel van α = 0,05 gebruikt, en P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Analyse van de onderlinge relatie tussen TMED3, tumormutatiebelasting en microsatellietinstabiliteit
Tumor mutatielast (TMB) en microsatellietinstabiliteit (MSI) werden geanalyseerd om hun associaties met TMED3-expressie bij meerdere kankertypen te onderzoeken. Uniform verwerkte pankankerdatasets werden gedownload uit de UCSC Xena-database (https://xenabrowser.net/; geraadpleegd op 5 juli 2025), en TMED3-expressieprofielen werden geëxtraheerd voor latere analyses. Level 4 Simple Nucleotide Variation-gegevens voor TCGA-monsters gegenereerd met MuTect2 zijn verkregen uit de Genomic Data Commons (GDC) database (https://portal.gdc.cancer.gov/)¹⁴. TMED3-expressiegegevens werden geïntegreerd met TMB-datasets en expressiewaarden werden genormaliseerd met log₂(x + 1) transformatie vóór statistische analyse. MSI-scores voor individuele tumortypen werden verzameld uit eerder gepubliceerde studies¹⁵ en vervolgens samengevoegd met TMED3-expressiegegevens na dezelfde normalisatieprocedure. Verbanden tussen TMED3-expressie en TMB/MSI werden beoordeeld met behulp van Spearman-correlatieanalyse in pankankerdatasets^16,17.

Analyse van immuunkenmerken van TMED3
Het ESTIMATE-algoritme werd toegepast om stromale scores, immuunscores en ESTIMATE-scores voor meerdere tumortypen te berekenen. Stromale en immuuninfiltratiescores in pankankerdatasets zijn gegenereerd met het schattingspakket (Versie 1.0.13) in de statistische analysesoftware. Verschillen in stromale score, immuunscore en ESTIMATE-score tussen groepen met hoge en lage TMED3-expressie werden geëvalueerd met behulp van Wilcoxon rangsomtests. Daarnaast werden immuno-checkpoint-gerelateerde analyses uitgevoerd om de relaties tussen TMED3-expressie en immuno-checkpointmoleculen te onderzoeken, waaronder geprogrammeerd celdoodproteïne 1 (PD-1), geprogrammeerde doodsligand 1 (PD-L1) en cytotoxisch T-lymfocyt-geassocieerd eiwit 4 (CTLA4), over verschillende kankertypen. STAR-count expressiegegevens en bijbehorende klinische informatie voor COAD werden gedownload uit de TCGA-database. TPM-geformatteerde expressiematrices werden geëxtraheerd en genormaliseerd met behulp van log₂(TPM + 1) transformatie. Expressieprofielen van acht immuuncontrolepunt-gerelateerde genen werden vervolgens verkregen uit COAD-monsters, en correlaties tussen TMED3-expressie en immuuncontrolepuntmarkers werden geanalyseerd met behulp van Spearman-correlatieanalyse.

Geneesmiddelgevoeligheidsanalyse
Geneesmiddelgevoeligheidsanalyse werd uitgevoerd met het GSCALite-platform om de relatie tussen TMED3-expressie en responsiviteit van antikankermedicijnen bij verschillende kankertypen¹⁸ te onderzoeken. Niveau 3 RNA-sequencinggegevens en bijbehorende klinische informatie voor COAD-monsters werden verkregen uit de TCGA-dataset. Voorspelde chemotherapie-responsen voor elk monster werden gegenereerd met behulp van gegevens uit de Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) database (https://www.cancerrxgene.org/). De voorspelling van de medicijnrespons werd uitgevoerd met het pRRophetic-pakket in de statistische analysesoftware. Geschatte half-maximale inhibitieconcentratiewaarden (IC₅₀) werden berekend met behulp van ridge regressie met standaardinstellingen, inclusief batch-effectcorrectie via het combat algorithm en weefselspecifieke aanpassingsanalyses. Gerepliceerde genexpressiemetingen werden gemiddeld vóór de downstream analyse.

Expressie en prognose van TMED3 bij darmkanker
TMED3-expressieprofielen en bijbehorende klinisch-pathologische gegevens voor colonadenocarcinoom zijn verkregen uit de TCGA-database. Differentiële TMED3-expressie tussen darmkankerweefsels en niet-gematchte normale weefsels werd geëvalueerd met behulp van Wilcoxon rangsomtests, terwijl de verbanden tussen TMED3-expressie en klinisch-pathologische kenmerken werden geanalyseerd met chi-kwadraattests. Patiënten werden gestratificeerd in groepen met hoge en lage expressie op basis van het mediane TMED3-expressieniveau. Vervolgens werd een Kaplan–Meier-overlevingsanalyse uitgevoerd om prognostische verschillen tussen de twee groepen te vergelijken. Univariate en multivariate Cox proportional hazards regressieanalyses werden uitgevoerd om de prognostische significantie van TMED3-expressie bij darmkanker te beoordelen. Daarnaast werd een analyse van de tijdsafhankelijke ontvanger-operating characteristic (ROC) curve uitgevoerd om de voorspellende prestaties van TMED3-expressie voor 1-, 3- en 5-jarige besturingssystemen te evalueren. ROC-analyses werden uitgevoerd met het timeROC-pakket in de statistische analysesoftware, en grafische visualisaties werden gegenereerd met het ggplot2-pakket.

Immunohistochemie-analyse
In totaal werden 60 monsters van darmkanker en 20 niet-kankerweefsels willekeurig geselecteerd vanuit het Tangshan Central Hospital. De studie werd goedgekeurd door de lokale institutionele beoordelingscommissie (nr. TZYL/K/2023-16), en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd van alle patiënten verkregen vóór de operatie. Alle weefselmonsters zijn genomen van patiënten die een chirurgische resectie ondergingen zonder voorafgaande chemotherapie of immunotherapie. De cohort omvatte 39 mannelijke en 21 vrouwelijke patiënten van 20–87 jaar. Volgens de stadiëringscriteria van Duke werden 33 patiënten geclassificeerd als stadium I+II en 27 patiënten als stadium III+IV. De verdeling van de stadia van de cohort kan potentiële selectiebias naar gevorderde ziektestadia introduceren; daarom moeten overlevingsgerelateerde bevindingen voorzichtig worden geïnterpreteerd.

Paraffine-ingebedde weefselmonsters werden in plakjes van 4 μm gesneden, gevolgd door deparaffinisatie en rehydratatie. Endogene peroxidaseactiviteit werd gedoofd met 4% H2_O2, en de niet-specifieke binding werd vervolgens geblokkeerd met geitenserum. Secties werden vervolgens 's nachts geïncubeerd bij 4°C met het primaire antilichaam TMED3 bij een verdunning van 1:100. De volgende dag werd het schapenanti-konijn IgG-polymeer (PV-6000) 30 minuten bij kamertemperatuur aangebracht. De immunoreactiviteit werd gevisualiseerd met diaminobenzidinekleuring, en secties werden gemonteerd met neutrale hars. Histologische kleuring werd onderzocht onder een optische microscoop met hoge vergroting. De intensiteit van immunokleuring werd beoordeeld op 0 (negatief), 1 (zwak), 2 (matig) en 3 (sterk), terwijl het aandeel positieve tumorcellen werd beoordeeld als 1 (1%–25%), 2 (26%–50%), 3 (51%–75%) of 4 (76%–100%). De uiteindelijke immunohistochemische scores werden berekend door de kleuringsintensiteit te vermenigvuldigen met het percentage van de score van positieve tumorcellen. TMED3-expressieniveaus werden geclassificeerd als negatief/laag expressief (score ≤ 6) of overexpressie (score > 6)¹⁹.

Genverrijkingsanalyse van TMED3 bij darmkanker
Genverrijkingsanalyse werd uitgevoerd om de potentiële biologische functies en signaalroutes te evalueren die geassocieerd zijn met TMED3-expressie bij darmkanker. Differentieel tot expressie gebrachte genen tussen groepen met hoge en lage TMED3-expressie werden gescreend met het DESeq2-pakket in de statistische analysesoftware. Ruwe telgegevens verkregen van TCGA werden genormaliseerd met behulp van de mediaanratio-normalisatiemethode die in DESeq2 is geïmplementeerd. Genen met lage expressie en tellingen <10 in meer dan 50% van de monsters werden uitgesloten vóór de analyse. Differentieel tot expressie gebrachte genen werden geïdentificeerd met behulp van drempels van |log₂ (FC)| ≥ 1 en aangepaste P < 0,05 na Benjamini–Hochberg (BH) meervoudige testcorrectie. Alle analytische parameters werden vastgesteld om reproduceerbaarheid van de analyse te waarborgen.

Vervolgens werd Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) uitgevoerd met het clusterProfiler-pakket in R, gebaseerd op de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) gensets (versie 7.5.1) verkregen uit de Molecular Signatures Database (MSigDB). Een vooraf gerangschikte genenlijst werd gegenereerd volgens de log2-fold-change-waarden tussen high- en low-TMED3-expressiegroepen. Verrijkingsanalyse werd uitgevoerd met 1000 fenotypepermutaties, en gensets met 15–500 genen werden in de analyse opgenomen. Routes met een genormaliseerde verrijkingsscore (NES) absolute waarden van >1, gecorrigeerd P < 0,05 en een valse ontdekkingsrate (FDR) < 0,25 werden als significant verrijkt beschouwd. De verrijking van het Parkinson-ziektepad bleef bestaan omdat deze route nauw samenhangt met mitochondriale disfunctie en oxidatieve fosforyleringsgerelateerde biologische processen, die ook betrokken zijn bij tumormetabole herprogrammering en kankerprogressie.

Statistische analyse
Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de statistische analysesoftware. Differentiële expressie tussen groepen werd beoordeeld met tweezijdige Wilcoxon rank-sum tests voor ongepaarde steekproeven en Wilcoxon teken-rang tests voor gepaarde steekproeven. Verbanden tussen TMED3-expressie en klinisch-pathologische variabelen werden geëvalueerd met chi-kwadraattests. Overlevingsanalyses werden uitgevoerd met het overlevingspakket (versie 3.3-1), en Kaplan–Meier-overlevingscurves werden gegenereerd met het survminer-pakket. Verschillen in overlevingsuitkomsten tussen groepen werden vergeleken met behulp van de log-rank test. Cox proportionele hazards regressiemodellen werden toegepast om prognostische factoren te identificeren die met OS. Patiënten werden gecategoriseerd in groepen met hoge en lage expressie op basis van het mediane TMED3-expressieniveau. Tijdsafhankelijke ROC-analyses werden uitgevoerd met het timeROC-pakket, en figuren werden gegenereerd met het ggplot2-pakket. Tenzij anders vermeld, werd statistische significantie gedefinieerd als een tweezijdige P-waarde van < 0,05.

Spearman-correlatieanalyse werd uitgevoerd om de correlaties tussen TMED3-expressie en immuunkenmerken, TMB en MSI te evalueren. Genormaliseerde kwantitatieve expressiegegevens verkregen uit de bijbehorende openbare databases werden gebruikt voor alle correlatie-analyses. Voor TCGA RNA-sequencinggegevens werden TPM-geformatteerde expressiewaarden getransformeerd met log₂(TPM + 1) normalisatie voorafgaand aan de analyse, waar van toepassing. Monsters met ontbrekende klinische of moleculaire gegevens werden uitgesloten vóór statistische analyse. Spearman-correlatieanalyses werden uitgevoerd als tweehoekige niet-parametrische tests. Ruwe P-waarden werden gebruikt voor analyses met beperkte vergelijkingen, waaronder Wilcoxon-tests, Spearman-correlatieanalyses en overlevingsanalyses. Voor grootschalige bio-informatica-analyses met hoge doorvoer, waaronder differentiële genexpressieanalyse, KEGG-verrijkingsanalyse en GSEA, werd meervoudige testcorrectie uitgevoerd met de BH FDR-methode. Gecorrigeerde FDR-waarden van <0,05 werden als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Expressieanalyse van TMED3 bij pankanker
Analyse van TCGA- en GTEx-datasets toonde aan dat de expressie van TMED3-messenger ribonucleïnezuur (mRNA) significant verhoogd was in de meeste tumorweefsels vergeleken met corresponderende normale weefsels, waaronder adrenocorticacarcinoom (ACC), blaasurotheliale carcinoom (BLCA), borstinvasieve carcinoom (BRCA), cervicale plaveiselcelcarcinoom en endocervicaal adenocarcinoom (CESC), cholangiocarcinoom (CHOL), colonadenocarcinoom (COAD), diffuse grote B-cel lymfoom (DLBC), slokdarmcarcinoom (ESCA), glioblastoom multiforme (GBM), nierrenale clearcellencarcinoom (KIRC), niernierpapillaire celcarcinoom (KIRP), hersenen lagere graad glioom (LGG), leverhepatocellulair carcinoom (LIHC), longadenocarcinoom (LUAD), longplaveiselcelcarcinoom (LUSC), eierstok serous cystadenocarcinoom (OV), pancreatische adenocarcinoom (PAAD), feochromocytoom en paraganglioom (PCPG), prostaatadenocarcinoom (PRAD), rectum adenocarcinoom (READ), huidhuidhuidmelanoom (SKCM), maagadenocarcinoom (STAD), testiculaire kiemceltumoren (TGCT), schildkliercarcinoom (THCA), thymoom (THYM), baarmoedercorpus endometriumcarcinoom (UCEC) en baarmoedercarcinosarcoom (UCS), terwijl verminderde expressie werd waargenomen bij hoofd- en halsplaveiselcelcarcinoom (HNSC) en acute myeloïde leukemie (LAML) (Figuur 1A). Gekoppelde aangrenzende normale weefsels dienden als controles voor gepaarde expressie-analyses. Gepaarde TCGA-analyse bevestigde verder een significant verhoogde TMED3-expressie in BLCA, BRCA, CHOL, COAD, nierchromofoob (KICH), KIRP, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, STAD en UCEC-weefsels vergeleken met gepaarde normale weefsels (Figuur 1B). Daarnaast toonde eiwitexpressieanalyse met behulp van de UALCAN/Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) database verhoogde TMED3-eiwitniveaus aan in BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV en UCEC tumorweefsels, terwijl een verminderde eiwitexpressie werd waargenomen in PAAD vergeleken met normale weefsels (Figuur 1C). De expressie van TMED3-eiwitten was echter lager in PAAD dan in normale weefsels. Dit verschil tussen mRNA- en eiwitexpressiepatronen kan post-transcriptionele of posttranslationele regulatiemechanismen weerspiegelen. Deze bevindingen suggereren dat TMED3 abnormaal wordt opgewaardeerd in meerdere kankers en mogelijk geassocieerd is met diagnostische en prognostische kenmerken bij meerdere kankers.

Figuur 1. TMED3-expressieprofielen bij menselijke kankers. (A) Differentiële expressie van TMED3 mRNA tussen tumor en normale weefsels over meerdere kankertypen op basis van TCGA- en GTEx-datasets. Expressieniveaus worden weergegeven als logaritme₂ (TPM + 1). (B) Gepaarde analyse van TMED3 mRNA-expressie tussen tumorweefsels en gekoppelde normale weefsels uit TCGA-datasets. (C) Differentiële TMED3-eiwitexpressie tussen normale weefsels en primaire tumoren in CPTAC/UALCAN-datasets, waaronder borstinvasieve carcinoom (BRCA), colonadenocarcinoom (COAD), glioblastoma multiforme (GBM), nierrenale clearcellulaire carcinoom (KIRC), leverhepatocellulair carcinoom (LIHC), longadenocarcinoom (LUAD), longplaveiselcelcarcinoom (LUSC), ovarium serous cystadenocarcinoom (OV), pancreasadenocarcinoom (PAAD) en baarmoedercorpus endometriumcarcinoom (UCEC). Gegevens worden gepresenteerd als boxplots. De statistische significantie werd geanalyseerd met behulp van Wilcoxon rank-sum of Wilcoxon signed-rank tests, afhankelijk van toepassing. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; NS, niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Analyse van klinisch-pathologische kenmerken
Analyse van het klinische stadium toonde aan dat de expressie van TMED3 significant hoger was bij tumoren in een gevorderd stadium (stadium III–IV) vergeleken met tumoren in een vroeg stadium (stadium I–II) in ACC, KIRC, KIRP en LUAD (Figuur 2). Daarentegen was de expressie van TMED3 significant verminderd in gevorderd stadium UCEC-weefsels. Deze bevindingen suggereren dat verhoogde TMED3-expressie mogelijk geassocieerd is met tumorprogressie bij verschillende kankertypen.

Figuur 2. Associatie tussen TMED3-expressie en pathologisch stadium over meerdere kankers. Vioolgrafieken tonen TMED3 mRNA-expressieniveaus in tumoren in een vroeg stadium (stadium I–II) en tumoren in een gevorderd stadium (stadium III–IV) bij adrenocorticaal carcinoom (ACC), nierren-clearcellencarcinoom (KIRC), nierpapillaire celcarcinoom (KIRP), longadenocarcinoom (LUAD) en baarmoedercorpus endometriumcarcinoom (UCEC). Expressieniveaus worden weergegeven als logaritme₂ (TPM + 1). De statistische significantie werd geëvalueerd met behulp van Wilcoxon rangsomtesten. *P < 0,05, ***P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Prognostische analyse
Cox-regressie- en overlevingsanalyses toonden aan dat een hoge expressie van TMED3 geassocieerd was met slechtere OS-effecten in ACC, COAD, LUAD en UVM (Figuur 3A). DSS-analyse toonde verder aan dat verhoogde expressie van TMED3 significant geassocieerd was met ongunstige DSS in ACC, COAD, GBM, KIRP en UVM (Figuur 3B). Opmerkelijk is dat ACC, COAD en UVM consequent een slechte prognose vertoonden voor zowel OS als DSS bij patiënten met een hoge TMED3-expressie. Trendniveau prognostische associaties werden ook waargenomen bij geselecteerde tumortypen, waaronder LUAD, KIRC en LGG. Deze bevindingen suggereren dat TMED3-expressie prognostische relevantie kan hebben bij meerdere maligniteiten.

Figuur 3. Prognostische significantie van TMED3-expressie in pankankeranalyse. (A) Forestplot dat de associatie toont tussen TMED3-expressie en algehele overleving (OS) over meerdere kankertypen. (B) Bosgrafiek die de associatie toont tussen TMED3-expressie en ziekte-specifieke overleving (DSS) over meerdere kankertypen. Hazardratio's (HR's) en 95% betrouwbaarheidsintervallen (95% BI) werden berekend met behulp van Cox proporsionele hazards regressieanalyse. HR > 1 duidt op een slechte prognose die geassocieerd is met een hoge expressie van TMED3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Mutatieanalyse
Analyse van genetische veranderingen met behulp van de cBioPortal-database toonde aan dat TMED3-veranderingen bij kankers voornamelijk bestonden uit mutaties, amplificaties, diepe deleties en meervoudige veranderingen (Figuur 4). De hoogste frequentie van TMED3-veranderingen werd waargenomen bij mesothelioom (MESO), voornamelijk veroorzaakt door genamplificatie (2,3%). ESCA vertoonde gemengde alteratietypen, waaronder mutatie (0,55%), amplificatie (1,1%) en diepe deletie (0,55%). Daarentegen werden geen detecteerbare TMED3 genetische veranderingen vastgesteld in LIHC, KICH, THCA, PCPG, CHOL, UVM, LAML, UCS, DLBC, KIRC, TGCT en GBM-datasets. Deze bevindingen wijzen erop dat TMED3-genomische veranderingen op een tumorspecifieke manier plaatsvinden en kunnen bijdragen aan de heterogeniteit van kanker.

Figuur 4. Genetisch veranderingslandschap van TMED3 bij kankers. Frequentie en typen van TMED3 genetische veranderingen in pankankerdatasets verkregen uit de cBioPortal-database. Alteratiecategorieën omvatten mutatie, amplificatie, diepe deletie en meervoudige alteraties. De y-as geeft de veranderingsfrequentie (%) tussen kankertypen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

DNA-methylatieanalyse
Analyse van de UALCAN-database toonde aan dat de methyleringsniveaus van TMED3-promotoren significant verhoogd waren in BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD en PRAD tumorweefsels vergeleken met corresponderende normale weefsels (Figuur 5). Daarentegen werden verminderde methylatieniveaus van TMED3-promotor waargenomen in BLCA-, TGCT- en UCEC-weefsels ten opzichte van normale controles. Deze bevindingen suggereren dat afwijkende methylering van de TMED3-promotor kan bijdragen aan tumorspecifieke regulatie van TMED3-expressie.

Figuur 5. Promotor methylatieniveaus van TMED3 bij kankers. Vergelijking van TMED3-promotor methylatieniveaus tussen tumorweefsels en overeenkomstige normale weefsels bij blaasurotheliale carcinoom (BLCA), borstinvasieve carcinoom (BRCA), colonadenocarcinoom (COAD), slokdarmcarcinoom (ESCA), hoofd- en halsplaveiselcelcarcinoom (HNSC), nierren-clearcellcarcinoom (KIRC), niernierpapillaire celcarcinoom (KIRP), leverhepatocellulair carcinoom (LIHC), longadenocarcinoom (LUAD), pancreasadenocarcinoom (PAAD), prostaatadenocarcinoom (PRAD), testiculaire kiemceltumoren (TGCT) en datasets van baarmoedercorpus endometrium (UCEC) verkregen van UALCAN. Gegevens worden gepresenteerd als β waarden in boxplots. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Analyse van TMED3-, TMB- en MSI-correlaties
Spearman-correlatieanalyse toonde aan dat TMED3-expressie positief gecorreleerd was met TMB in ACC, ESCA, KIRC, LGG, PAAD, STAD, THYM en UCEC, terwijl negatieve correlaties werden waargenomen in CESC, LUAD en TGCT (Figuur 6A). Daarnaast was TMED3-expressie positief geassocieerd met MSI in DLBC, KIRC, SKCM, STAD en UCEC (Figuur 6B). Opmerkelijk is dat TMED3-expressie positieve correlaties vertoonde met zowel TMB als MSI in KIRC, STAD en UCEC, wat kan wijzen op mogelijke associaties met tumorimmunogeniteit in deze kankers.

Figuur 6. Correlatie van TMED3-expressie met tumormutatiebelasting en microsatellietinstabiliteit in pankankeranalyse. (A) Radarplot die de correlatie toont tussen TMED3-expressie en tumormutatielast (TMB) tussen kankers. (B) Radarplot dat de correlatie toont tussen TMED3-expressie en microsatellietinstabiliteit (MSI) tussen kankers. Correlatiecoëfficiënten werden berekend met behulp van Spearman-correlatieanalyse. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Analyse van immuunkarakteristieken
ESTIMATE-analyse toonde aan dat TMED3-expressie negatief correleerde met stromale score, immuunscore en ESTIMAT-score in BCLA, ESCA, LAML, LUAD, LUSC, PAAD, PRAD, SKCM, STAD, THCA en UCEC (Figuur 7A). Daarentegen werden positieve correlaties tussen TMED3-expressie en deze immuungerelateerde scores waargenomen bij LGG, LIHC en PCPG. Er werden geen significante correlaties vastgesteld in ACC, CHOL, DLBC, GBM, KICH, KIRC, KIRP, OV en UCS. Deze bevindingen suggereren dat TMED3 mogelijk de tumormicro-omgeving en de infiltratie van immuuncellen op een kankertype-afhankelijke manier beïnvloedt. Immuno-checkpointcorrelatieanalyse toonde verder aan dat TMED3-expressie negatief geassocieerd was met de immuuncheckpoint-gerelateerde genen CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) en CTLA4 in BLCA, BRCA, CESC, ESCA, HNSC, LUAD, LUSC, PRAD, SKCM en THCA (Figuur 7B). Positieve correlaties tussen TMED3-expressie en immuuncontrolepuntgenen werden vastgesteld in LIHC en UVM, terwijl er geen significante associaties werden waargenomen bij GBM, KICH, LAML, MESO, OV, PCPG, READ en TGCT. Deze resultaten geven aan dat TMED3 mogelijk geassocieerd is met tumor-immuunregulatie en immuuncheckpoint-signalering bij geselecteerde kankers.

Figuur 7. Associaties tussen TMED3-expressie en immuunkenmerken van de tumor. (A) Heatmap die correlaties toont tussen TMED3-expressie en stromale score, immuunscore en ESTIMATE-score over kankers berekend met het ESTIMATE-algoritme. (B) Heatmap die correlaties toont tussen TMED3-expressie en immuuncontrolepunt-gerelateerde genen, waaronder CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) en CTLA4. Correlatiecoëfficiënten werden bepaald met behulp van Spearman-correlatieanalyse. Kleurschaal geeft de correlatiesterkte aan. *P < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Geneesmiddelgevoeligheidsanalyse
Geneesmiddelgevoeligheidsanalyse met het GSCALite-platform op basis van GDSC-datasets toonde aan dat de expressie van TMED3 negatief correleerde met de halfmaximale remmende concentratie (IC₅₀) waarden van 17-AAG, lapatinib, PD-0325901, RDEA119 en trametinib (Figuur 8). Deze bevindingen suggereren dat tumoren met verhoogde TMED3-expressie een verhoogde gevoeligheid voor deze antikankermiddelen kunnen vertonen, wat wijst op mogelijke verbanden tussen TMED3-expressie en therapeutische gevoeligheid.

Figuur 8. Correlatie tussen TMED3-expressie en gevoeligheid voor antikankermedicijnen. Bubble plot die correlaties toont tussen TMED3 mRNA-expressie en gevoeligheid voor antikankermedicijnen, verkregen uit Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) datasets via het GSCALite-platform. De bubbelgrootte geeft statistische significantie aan op basis van valse ontdekkingsfrequentie (FDR), en kleur geeft de correlatiecoëfficiënten aan. Negatieve correlaties wijzen op verhoogde geneesmiddelgevoeligheid die geassocieerd is met een hoge expressie van TMED3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Expressie en prognose van TMED3 bij darmkanker
TMED3-expressieanalyse toonde significant verhoogde TMED3 mRNA-niveaus aan in darmkankerweefsels vergeleken met normale colonweefsels in TCGA-datasets (Figuur 9A). Gepaarde analyse met gematchte aangrenzende normale weefsels als controles bevestigde verder verhoogde TMED3-expressie in darmkankerweefsels (Figuur 9B). In overeenstemming met de transcriptomische bevindingen toonde eiwitexpressieanalyse met behulp van UALCAN/CPTAC-datasets en immunohistochemische kleuring een verhoogde TMED3-eiwitexpressie in dikke darmkankerweefsels vergeleken met normale colonweefsels (Figuur 9C–9E). ROC-curveanalyse toonde een oppervlakte onder de curve (AUC) waarde van 0,869, wat wijst op gunstige diagnostische prestaties van TMED3 bij het onderscheiden van colonkanker van normaal weefsel (Figuur 9F). Klinisch-pathologische analyse toonde verder aan dat TMED3-expressie significant geassocieerd was met het T-stadium, terwijl er geen significante verbanden werden waargenomen met leeftijd, geslacht, N-stadium of TNM-stadium (Tabel 1). Deze bevindingen ondersteunen de mogelijke diagnostische betekenis van TMED3 bij darmkanker.

Figuur 9. Expressie, diagnostische waarde en immunohistochemische validatie van TMED3 bij darmkanker. (A) Differentiële expressie van TMED3 mRNA tussen darmkanker en normale colonweefsels uit TCGA-datasets. (B) Gepaarde analyse van TMED3 mRNA-expressie in darmkankerweefsels en gematchte aangrenzende normale weefsels. (C) TMED3-eiwitexpressie in darmkanker en normale weefsels verkregen uit CPTAC/UALCAN-datasets. (D) Representatieve immunohistochemische kleuring van TMED3 in normaal colonweefsel. (E) Vertegenwoordigende immunohistochemische kleuring van TMED3 in darmkankerweefsel met verhoogde TMED3-expressie. (F) Receiver operating characteristic (ROC) curve die de diagnostische waarde van TMED3 bij darmkanker evalueert. Schaalbalken = 100 μm. Het gebied onder de curve (AUC) was 0,869 met een 95% betrouwbaarheidsinterval (BI) van 0,813–0,924. De statistische significantie werd geanalyseerd met behulp van Wilcoxon rank-sum of Wilcoxon signed-rank tests, afhankelijk van toepassing. P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Type		TMED3		P-waarde	χ2
		Lage expressie	Hoge expressie
Leeftijd
≤ 55	25	15	10	0.13	2.34
> 55	35	14	21
Geslacht
Vrouwelijk	21	10	11	0.94	0.007
Mannelijk	39	19	20
T-fase
T1+T2	23	15	8	0.04	4.26
T3+T4	37	14	23
N Stage
N0	30	12	18	0.2	1.67
N1+N2	30	17	13
TNM Stage
I+II	33	13	20	0.13	2.35
III+IV	27	16	11

Tabel 1: Associatie tussen TMED3-expressie en klinisch-pathologische kenmerken bij darmkanker. Klinische pathologische kenmerken van patiënten met darmkanker werden vergeleken tussen groepen met lage en hoge TMED3-expressie. Verbanden tussen TMED3-expressie en klinisch-pathologische variabelen, waaronder leeftijd, geslacht, T-stadium, N-stadium en TNM-stadium, werden geanalyseerd met chi-kwadraat (χ²) tests. De gegevens worden gepresenteerd als het aantal patiënten in elke subgroep. Statistische significantie werd gedefinieerd als P < 0,05.

KM-overlevingsanalyse toonde aan dat patiënten met een hoge TMED3-expressie significant slechtere OS-expressie (P = 0,031) en DSS (P = 0,020) vertoonden in vergelijking met patiënten met een lage TMED3-expressie (Figuur 10A en 10B). Tijdafhankelijke ROC-analyse toonde aan dat de voorspellende prestaties van TMED3-expressie voor OS AUC-waarden opleverden van respectievelijk 0,620, 0,564 en 0,575 na 1, 3 en 5 jaar (Figuur 10C). Bovendien identificeerden univariate en multivariate Cox-regressieanalyses T-fase, M-stadium, pathologische fase en TMED3-expressie als prognostische factoren die geassocieerd zijn met de algehele overleving bij darmkanker (Tabel 2). Deze resultaten suggereren dat verhoogde expressie van TMED3 geassocieerd is met een slechte prognose bij darmkanker, hoewel de tijdsafhankelijke ROC-analyse slechts bescheiden voorspellende prestaties liet zien.

Figuur 10. Prognostische betekenis van TMED3-expressie bij darmkanker. (A) Kaplan–Meier (KM) algehele overlevingscurves (OS) die patiënten met hoge en lage TMED3-expressie bij darmkanker vergelijken. (B) Kaplan–Meier-ziekte-specifieke overlevingscurves (DSS) die patiënten met hoge en lage TMED3-expressie vergelijken. (C) Tijdsafhankelijke ontvanger-operating characteristic (ROC) curves die de voorspellende prestaties van TMED3-expressie evalueren voor 1-, 3- en 5-jaar OS. Overlevingsverschillen werden geanalyseerd met behulp van de log-rank test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Kenmerken	Univariate analyse		Multivariate analyse
	Hazardverhouding (95% BI)	P-waarde	Hazardverhouding (95% BI)	P-waarde
Geslacht	1.101(0.746–1.625)	0.627
T-fase	3.072(1.423–6.631)	0.004	3.817(1.174–12.407)	0.026
N-fase	2.592(1.743–3.855)	<0,001	0.587(0.223–1.584)	0.28
M-fase	4.193(2.683–6.554)	<0,001	2.272(1.314–3.930)	0.003
Pathologische fase	2.947(1.942–4.471)	<0,001	3.115(1.032–9.401)	0.044
TMED3	1.537(1.037–2.277)	0.032	1.599(1.039–2.462)	0.033

Tabel 2: Univariate en multivariate Cox proportionele hazards regressieanalyses van prognostische factoren die geassocieerd zijn met de algehele overleving bij darmkanker. Univariate en multivariate Cox proportionele hazards regressieanalyses werden uitgevoerd om de prognostische significantie van klinisch pathologische kenmerken en TMED3-expressie bij patiënten met darmkanker te evalueren. Hazard ratio's (HR's) worden gepresenteerd met 95% betrouwbaarheidsintervallen (95% BI). Variabelen waren onder andere geslacht, T-stadium, N-stadium, M-stadium, pathologisch stadium en TMED3-expressie. Statistische significantie werd gedefinieerd als P < 0,05.

Geneesmiddelgevoeligheidsanalyse toonde aan dat patiënten in de groep met hoge TMED3-expressie lagere geschatte IC_50-waarden vertoonden voor 5-fluorouracil, lapatinib en trametinib in vergelijking met de groep met lage TMED3-expressie (Figuur 11). Deze bevindingen suggereren dat patiënten met darmkanker en verhoogde TMED3-expressie een verhoogde gevoeligheid voor deze chemotherapeutische en gerichte therapeutische middelen kunnen vertonen, wat wijst op mogelijke verbanden tussen TMED3-expressie en therapeutische respons.

Figuur 11. Correlatie tussen TMED3-expressie en chemotherapeutische medicijngevoeligheid bij darmkanker. Boxgrafieken tonen geschatte half-maximale remmende concentratiewaarden (IC₅₀) voor 5-fluorouracil, lapatinib en trametinib tussen groepen met lage TMED3-expressie (G1) en hoge TMED3-expressie (G2). Lagere IC_50-waarden duiden op een grotere gevoeligheid voor geneesmiddelen. De statistische significantie werd geanalyseerd met behulp van Wilcoxon rangsomtesten. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Genverrijkingsanalyse
GSEA toonde aan met behulp van KEGG-datasets uit de MSigDB-database aan dat TMED3-gerelateerde genen in darmkanker significant verrijkt waren in routes die geassocieerd zijn met ribosoom, antigeenverwerking en presentatie, oxidatieve fosforylering en de pentosefosfaatroute (Figuur 12). Deze bevindingen suggereren dat TMED3 mogelijk deelneemt aan tumorprogressie via bovenstaande routes in darmkanker.

Figuur 12. Genenset-verrijkingsanalyse (GSEA) van TMED3-gerelateerde genen bij darmkanker. GSEA-grafieken tonen verrijking van TMED3-gerelateerde genen in routes die geassocieerd zijn met antigeenverwerking en presentatie, ribosoom-, oxidatieve fosforylering en pentosefosfaatweg in darmkanker. De genormaliseerde verrijkingsscore (NES), nominale P-waarde en false discovery rate (FDR) waarden worden in elk paneel aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze studie toonde aan dat TMED3 abnormaal tot expressie kwam bij meerdere kankersoorten en geassocieerd was met tumorprogressie, prognose, immuunkenmerken, TMB, MSI en medicijngevoeligheid. Bij darmkanker was TMED3-overexpressie geassocieerd met ongunstige overlevingsuitkomsten en verhoogde diagnostische waarde. Functionele verrijkingsanalyse suggereerde verder dat TMED3 mogelijk deelneemt aan kankergerelateerde metabole en signaalroutes. Gezamenlijk ondersteunen deze bevindingen verder onderzoek naar TMED3 als een potentiële diagnostische en prognostische biomarker bij pankanker, met name bij darmkanker.

Beschikbaarheid van gegevens:
De datasets die in deze studie zijn geanalyseerd, zijn verkregen uit openbaar beschikbare databases, waaronder The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov/projects/; geraadpleegd op 1 juli 2025), UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/; geraadpleegd op 1 juli 2025), cBioPortal (https://www.cbioportal.org/; geraadpleegd op 5 juli 2025) en het Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC)-platform via GSCA (https://guolab.wchscu.cn/GSCA/#/drug; geraadpleegd op 5 juli 2025). Alle verwerkte gegevens die tijdens deze studie zijn gegenereerd, zijn opgenomen in het artikel.

Discussie

TMED-eiwitten zijn sterk geconserveerde eiwitten die het emp24-domein bevatten en bestaan als monomeren of dimeren binnen eukaryote cellen²⁰. Leden van de TMED-familie zijn type I transmembrane eiwitten die deelnemen aan vesikelgemedieerde eiwittransport en intracellulair transport²⁰. De p24-eiwitfamilie bestaat uit 10 TMED-leden, waaronder TMED3. Steeds meer bewijs toont aan dat TMED3 abnormaal tot expressie komt in verschillende maligniteiten, zoals endometriumcarcinoom, osteosarcoom, clear cell carcinoom, hepatocellulair carcinoom, prostaatkanker en borstkanker 4,6,21,22,23. Verhoogde expressie van TMED3 is ook in verband gebracht met een ongunstige prognose bij meerdere tumortypes 3,5,17,18,19. Bij longplaveiselcelcarcinoom werd aangetoond dat TMED3 tumorprogressie bevordert door regulering van ezrin, terwijl TMED3 het stilmaken van celproliferatie, kolonievorming, migratie en apoptose-gerelateerde eiwitdysregulatie^{onderdrukte 5}. Gezamenlijk geven deze studies aan dat TMED3 nauw betrokken is bij de ontwikkeling en progressie van kanker; de biologische functies en moleculaire mechanismen bij pankanker moeten echter nog volledig worden opgehelderd.

In de huidige studie werden meerdere openbare databases geïntegreerd om de expressiepatronen, de prognostische significantie, immuunkenmerken en mogelijke biologische functies van TMED3 bij kankers volledig te evalueren. De expressie van TMED3 was significant verhoogd bij 26 tumortypen, en deze bevindingen werden verder bevestigd met behulp van gepaarde tumor- en aangrenzende normale weefselanalyses in verschillende kankers. Consistent toonden CPTAC-gegevens verhoogde TMED3-eiwitexpressie aan in BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV en UCEC. Interessant is dat, hoewel TMED3 mRNA-expressie verhoogd was in PAAD-weefsels, verminderde eiwitexpressie werd waargenomen in de UALCAN-database, wat suggereert dat post-transcriptionele regulatie, eiwitafbraak of posttranslationele aanpassingen aan deze discrepantie kunnen bijdragen. Eerdere studies toonden aan dat TMED3-overexpressie in borstkankercellen de accumulatie van β-catenine en Axin-2 bevordert in zowel het cytoplasma als de kern van MCF-7-cellen en de expressie van Wnt/β-catenine downstream doelen, waaronder c-myc, MMP7 en TCF4, versterkt, waardoor tumorcelproliferatie, migratie en invasie wordt bevorderd²⁴. Evenzo is gerapporteerd dat TMED3 wordt opgereguleerd in niet-kleincellige longkanker, en het stilzetten van TMED3 onderdrukt tumorcelproliferatie en invasieve vermogen²⁵. In de huidige studie toonden klinisch-pathologische analyses aan dat de expressie van TMED3 verhoogd was in gevorderde ACC, KIRC, KIRP en LUAD, terwijl een lagere expressie werd waargenomen in gevorderde fase van UCEC, wat wijst op mogelijke tumorspecifieke biologische rollen van TMED3 tijdens het progressie van kanker. Overlevingsanalyses toonden verder significante verbanden aan tussen hoge TMED3-expressie en ongunstige OS- en DSS-effecten in ACC, COAD en UVM, wat de potentiële prognostische waarde van TMED3 bij meerdere maligniteiten ondersteunt. Daarnaast toonde promotormethylatieanalyse verhoogde TMED3-methylatieniveaus aan in BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD en PRAD, terwijl dale methyleringsniveaus werden vastgesteld in BLCA, TGCT en UCEC. Deze bevindingen wijzen erop dat abnormale methylering van promotoren kan bijdragen aan de ontregeling van TMED3-expressie op een tumorafhankelijke manier en kan bijdragen aan de ontwikkeling van kanker.

MSI vertegenwoordigt een aparte moleculaire subtype van kanker die vaak geassocieerd wordt met verbeterde respons op immunotherapie, omdat deze tumoren vaak een verhoogde mutatielast en verhoogde PD-L1-expressie^{vertonen 26,27}. Tumoren met een hoge TMB kunnen talrijke neoantigenen genereren die afkomstig zijn van somatische mutaties, waardoor de door T-cellen gemedieerde antitumor-immuunactiviteit wordt versterkt en mogelijk de gevoeligheid voor immuuncheckpointblokkade^28,29 wordt verhoogd. In de huidige studie toonde TMED3-expressie positieve correlaties met zowel TMB als MSI in KIRC, STAD en UCEC, wat aangeeft dat TMED3 mogelijk verband houdt met tumorimmunogeniciteit en immunotherapeutische respons bij deze kankertypen. Toenemend bewijs heeft aangetoond dat de tumormicro-omgeving, met name immuun- en stromale componenten, een cruciale rol speelt in het progressie van kanker, de therapeutische respons, recidief en de prognose van de patiënt. Het ESTIMATE-algoritme berekent stromale, immuun- en ESTIMATE-scores op basis van immuungerelateerde genexpressiepatronen, en eerdere onderzoeken hebben significante relaties gerapporteerd tussen deze scores en klinische uitkomsten bij prostaatkanker, glioblastoom en darmkanker 30,31,32. Onze analyses toonden aan dat TMED3-expressie variabel geassocieerd was met stromale score, immuunscore en ESTIMATE-score over verschillende tumortypen, wat suggereert dat TMED3 kan bijdragen aan tumorprogressie door modulatie van de tumormicro-omgeving. Bovendien was TMED3-expressie gecorreleerd met meerdere genen die aan immuuncontrolepunten samenhangen, waaronder CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) en CTLA4, hoewel de richting en omvang van deze associaties verschilden per tumortype. Significante positieve correlaties tussen TMED3 en immuuncontrolepuntmarkers werden vastgesteld in ACC, KIRP, LGG, LIHC, THYM en UVM, wat suggereert dat tumoren met verhoogde TMED3-expressie in deze kankers een verhoogde gevoeligheid voor immunotherapie kunnen vertonen. Geneesmiddelgevoeligheidsanalyses toonden bovendien verbanden aan tussen TMED3-expressie en responsiviteit op 17-AAG, lapatinib, PD-0325901, RDEA119 en trametinib, wat wijst op een mogelijke relatie tussen TMED3-expressie en therapeutische effectiviteit.

Darmkanker werd geselecteerd voor immunohistochemische validatie, en de resultaten bevestigden dat de expressie van TMED3 duidelijk verhoogd was in het weefsel van darmkanker vergeleken met normaal colonweefsel, wat overeenkomt met eerdere bevindingen⁷. Kliniopathologische analyses toonden verder een significante associatie aan tussen TMED3-expressie en T-stadium bij darmkanker. Daarnaast toonde TMED3 een potentiële diagnostische waarde, terwijl een verhoogde expressie van TMED3 geassocieerd was met een slechtere patiëntprognose. Echter, tijdafhankelijke ROC-analyses toonden aan dat de AUC-waarden voor het voorspellen van 1-, 3- en 5-jaars OS slechts marginaal boven 0,5 lagen, wat wijst op beperkte voorspellende nauwkeurigheid ondanks statistische significantie. Deze bevindingen suggereren dat TMED3 momenteel meer waarde heeft als exploratieve prognostische biomarker dan als robuuste voorspeller voor routinematige klinische toepassing. Univariate en multivariate Cox-regressieanalyses identificeerden verder het T-stadium, het M-stadium, het pathologische stadium en TMED3-expressie als onafhankelijke prognostische factoren die geassocieerd zijn met OS bij darmkanker. Geneesmiddelgevoeligheidsanalyses gaven aan dat patiënten met verhoogde TMED3-expressie mogelijk beter reageerden op veelgebruikte therapeutische middelen, waaronder 5-fluorouracil, lapatinib en trametinib. Bovendien toonden functionele verrijkingsanalyses aan dat TMED3-gerelateerde genen in darmkanker voornamelijk verrijkt waren in routes die geassocieerd zijn met ribosoom, antigeenverwerking en presentatie, oxidatieve fosforylering en de pentosefosfaatroute.

Deze studie evalueerde systematisch de expressieprofielen, prognostische waarde en immuungerelateerde kenmerken van TMED3 over meerdere kankertypen. Toch moeten verschillende beperkingen worden overwogen. De meeste bevindingen waren afkomstig uit bio-informatica- en multiomics-analyses op basis van openbare datasets, en experimentele validatie was beperkt tot immunohistochemische analyses in dikkedarmkankerweefsels. Bovendien werden functionele experimenten niet uitgevoerd om de precieze moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de rol van TMED3 in tumorprogressie. Daarom zijn aanvullende in vitro- en in vivo-studies nodig om de biologische functies en mogelijke therapeutische betekenis van TMED3 bij verschillende maligniteiten verder te verduidelijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.5% Ammonia Solution	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1336-21-6	N/A
1% Acid Alcohol	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
10% Neutral Buffered Formalin	Wuhan Huntz Biotechnology Co., Ltd	H-H8060	N/A
100% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
70% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
80% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
95% Ethanol	Shandong Lirun Medical Technology Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
Alcian Blue Stain	Baso Diagnostics Inc., Zhuhai	BA4121	N/A
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center	N/A	SCR_014555
Citrate-Based Antigen Retrieval Buffer	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9640-CN	N/A
clusterProfiler package	Bioconductor	N/A	SCR_016884
DESeq2 package	Bioconductor	N/A	SCR_015687
Diaminobenzidine Tetrahydrochloride Hydrate	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
ESTIMATE package	R package	Version 1.0.13	N/A
GSCALite platform	GSCALite	N/A	N/A
GTEx database	GTEx Consortium	N/A	SCR_013042
Hematoxylin	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
Hydrogen Peroxide	OriGene Technologies, Inc	PV-6000D	N/A
Kaplan–Meier Survival Analysis	survival R package	Version 3.2-7	SCR_021137
KEGG Gene Sets	MSigDB	Version 7.5.1	SCR_016863
Light Microscope	Zeiss Technology (Suzhou) Co., Ltd	N/A	N/A
Paraffin Embedding Medium	PATHO-Reagent Department of YL Company	CAS:8002-74-2	N/A
Polymer-Based Detection System	Leica Biosystems Newcastle Ltd	PV-6000	N/A
R statistical analysis software	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.2.1	SCR_001905
Secondary Rabbit Anti-Mouse IgG	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
TCGA database	National Cancer Institute	N/A	SCR_003193
TMED3 Primary Antibody	CUSABIO Technology, Houston, USA	CSB-PA897107LA01HU	N/A
Tris-Buffered Saline (TBS)	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9590-CN	N/A
UALCAN database	UALCAN	N/A	SCR_015827
Wilcoxon Statistical Analysis	stats R package	N/A	SCR_003005
Xylene	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1330-20-7	N/A