Een gestandaardiseerd in vitro protocol voor het evalueren van de differentiatie en proliferatie van menselijke stamcellen uit het dentine-pulpweefsel op nanomateriaal-scaffolds

Samenvatting

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde en reproduceerbare workflow voor het evalueren van de proliferatieve capaciteit en de osteogene en odontogene differentiatie van humane dentale stamcellen gekweekt op nanomateriaal-scaffolds, met behulp van gestandaardiseerde assays (ALP-activiteit, RANKL-immunofluorescentie [osteogeen] en DMP-1-immunofluorescentie [odontogeen]) en normalisatiestrategieën om de vergelijkbaarheid tussen studies te waarborgen.

Samenvatting

Een betrouwbare beoordeling van de osteogene en odontogene differentiatie, alsovél de proliferatie van stamcellen, is essentieel voor het evalueren van de biologische prestaties van regeneratieve strategieën op basis van scaffolds. Variabiliteit in experimentele protocollen, de selectie van assays en de interpretatie van gegevens beperkt echter vaak de reproduceerbaarheid en de vergelijking tussen studies. Het in dit artikel beschreven protocol presenteert een gestandaardiseerde, reproduceerbare workflow voor de in vitro evaluatie van de osteogene en odontogene differentiatie, alsovél de proliferatiecapaciteit, van stamcellen gekweekt op biomateriaalscaffolds. Osteogene commitment wordt geëvalueerd aan de hand van de enzymatische activiteit van alkalische fosfatase (ALP) en immunofluorescentie van Receptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand (RANKL), terwijl odontogene commitment wordt beoordeeld via DMP-1 (dentin matrix protein-1) immunofluorescentie; beide proteine-eindpunten worden gekwantificeerd met behulp van een gestandaardiseerde H-score methodologie. Kritieke experimentele parameters, waaronder celzaaidichtheid, inductietijdlijnen, assaycondities, normalisatiestrategieën (waaronder proteïne-genormaliseerde ALP-activiteit, cel-genormaliseerde 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) viabiliteit en immunofluorescentie H-score) en benaderingen voor data-analyse, worden gedetailleerd beschreven, samen met richtlijnen voor probleemoplossing om technische variabiliteit te minimaliseren. De methodologie is toegepast als een gestandaardiseerd kader in meerdere experimentele studies met scaffolds, waarbij robuustheid en reproduceerbaarheid werden aangetoond. Door een uitgebreid, gevalideerd kader te bieden, beoogt dit artikel de gestandaardiseerde beoordeling van interacties tussen stamcellen en scaffolds te vergemakkelijken en de vergelijkbaarheid tussen preklinische regeneratieve studies te verbeteren.

Inleiding

Regeneratieve endodontologie vertegenwoordigt een paradigmaverschuiving in de tandheelkunde, waarbij de focus ligt op het herstel van de vitaliteit van de dentale pulpa door het gebruik van stamcellen, groeifactoren en scaffolds^1,2. Het behouden van de pulpavitaliteit is essentieel voor de sensorische functie en de immuunrespons en is bijzonder cruciaal bij de behandeling van onvoltooide tanden met necrotische pulpa om verdere wortelontwikkeling mogelijk te maken².

Menselijke dentale pulpstamcellen (DPSCs) en stamcellen uit de apicale papil (SCAPs) zijn primaire kandidaten voor deze procedures vanwege hun hoge proliferatieve potentieel, zelfvernieuwingsvermogen, immunosuppressieve eigenschappen en het vermogen om onder geschikte micro-omgevingsfactoren te differentiëren tot odontoblast-achtige cellen, waardoor zij zeer levensvatbare kandidaten zijn voor toekomstige toepassingen in de regeneratieve geneeskunde en celgebaseerde therapeutische interventies^3,4,5.

Hoewel conventioneel geformuleerde materialen, zoals cementen op basis van calciumsilicaat, zijn onderzocht, suggereert recent bewijs dat nanoparticulaire modificatie de interacties tussen biomaterialen en cellen aanzienlijk kan beïnvloeden⁶. Nanogestructureerde biomaterialen kunnen een meer biomimetische micro-omgeving bieden, wat potentieel de adhesie van stamcellen en lineage-specifieke differentiatie verbetert⁷. Echter blijft het biologische gedrag van nieuwe materialen, zoals NeoMTA2 in nanoparticulaire vorm, onvoldoende begrepen in vergelijking met gevestigde materialen, zoals nanohydroxyapatiet⁸. Dit protocol voorziet in de behoefte aan een gestandaardiseerd methodologisch kader om deze interacties nauwkeurig en reproduceerbaar te evalueren.

Dit gestandaardiseerde raamwerk is bijzonder geschikt voor studies waarin nieuwe biomaterialen of nanomateriaalsubstraten onder identieke biologische omstandigheden worden geëvalueerd, waarbij vergelijkbaarheid tussen studies van essentieel belang is. Het biedt voordelen ten opzichte van benaderingen met een enkele assay door levensvatbaarheidsscreening (MTT), vroege osteogene commitment (ALP-activiteit) en differentiatie op proteïneniveau (immunofluorescentie H-score) te integreren in één enkele workflow. Onderzoekers die conventionele alizarinerood-kleuring of assays op één tijdstip gebruiken, kunnen profiteren van de adoptie van dit multiparametrische raamwerk om waarnemersbias te verminderen en de kwantitatieve resolutie te verbeteren. Dit protocol is echter niet bedoeld voor driedimensionale organoïdenkweken, co-cultuursystemen of stamcelmodellen van dierlijke oorsprong zonder passende aanpassingen. Onderzoekers die genexpressieprofilering vereisen (bijv. RT-qPCR voor RUNX2, OCN of DSPP) dienen deze workflow aan te vullen met moleculaire assays, aangezien het huidige protocol zich uitsluitend richt op proteïne- en enzymatische eindpunten.

Om het bifunctionele differentiatievermogen van dentale stamcellen volledig in kaart te brengen, maakt dit protocol gebruik van twee complementaire immunofluorescentiemarkers die verschillende biologische eindpunten weerspiegelen. RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) wordt gebruikt als marker voor osteogene lineage-committement: de expressie ervan op osteoblast-achtige cellen weerspiegelt calciumion-gestuurde mineralisatiesignalering en activatie van botvormende cellen, in overeenstemming met het gebruik ervan in verschillende studies die SCAPs evalueerden^4,8,9. DMP-1 (dentin matrix protein-1) wordt parallel gebruikt als een specifieke marker voor odontogene/dentinogene differentiatie: de upregulatie ervan in odontoblast-achtige cellen weerspiegelt de inductie van dentine-matrixvorming en pulpa-specifiek herstel van hard weefsel, en is bijzonder relevant wanneer de doelcelpopulatie bestaat uit DPSCs¹⁰. Door zowel RANKL als DMP-1 binnen hetzelfde experimentele kader te kwantificeren met behulp van de H-score-methodologie, stelt dit protocol onderzoekers in staat om osteogeen committement te onderscheiden van odontogeen committement; twee overlappende, maar mechanistisch verschillende uitkomsten van interacties tussen stamcellen en scaffolds, zonder dat hiervoor afzonderlijke experimentele ontwerpen nodig zijn.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Faculteit Tandheelkunde van de Ain Shams University, met goedkeuringsnummer FDASU-Rec IM112105. Alle procedures met menselijke weefsels zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Voorafgaand aan de tandextractie en het oogsten van stamcellen is van alle deelnemers schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen.

1. Bereiding en karakterisering van nanomaterialen

1. Synthetiseer nanomaterialen volgens specifieke vereisten^10,11. Maal voor Nano-NeoMTA2 het poeder met een planetaire kogelmolen (zie Materialentabel) gedurende 10 h bij 350 rpm met intervallen van 3 min aan/uit. Gebruik een gewichtsverhouding kogel-poeder van 10:1 met zirconia maalballen (5 mm diameter) in een zirconia maalkruik. Verifieer de uiteindelijke deeltjesgrootte met een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) (doel: <200 nm) voordat u verdergaat.
   WAARSCHUWING: NeoMTA2-poeder kan bij inademing luchtwegirritatie veroorzaken. Voer alle droge maalgangen uit in een gecertificeerde zuurkast onder gebruik van een N95-ademhalingsmasker, een veiligheidsbril en nitrielhandschoenen.
2. Bereid nanohydroxyapatiet voor met een natchemische precipitatiemethode^8,11,12: 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. Bereid 1 L van een 0,5 M calciumnitraatoplossing en 0,6 L van een 0,3 M ammoniumfosfaatoplossing voor, beide in gedeïoniseerd water. Voeg de calciumnitraatoplossing druppelgewijs toe aan de ammoniumfosfaatoplossing met een snelheid van ongeveer 2–3 mL/min onder continu roeren bij 400 rpm en verhit tot 70 °C, waarbij de pH 10–12 wordt gehouden door druppelgewijze toevoeging van ammoniumhydroxide⁸.
   WAARSCHUWING: Ammoniumhydroxide is corrosief en laat toxische ammoniakdampen vrij. Hanteer dit uitsluitend in een chemische zuurkast. Draag zuurbestendige handschoenen, een spatbril en een laboratoriumjas. Spoel huidcontact onmiddellijk minstens 15 min met water.
3. Behandel het resulterende apatietprecipitaat hydrothermisch in een autoclaaf bij 140 °C en 0,3 MPa gedurende 2–3 h¹⁰. Vriesdroog het gezuiverde precipitaat bij -50 °C onder een vacuüm van ≤0,05 mbar gedurende 48 h⁸.
4. Bereid bioactieve glas 45S5-nanodeeltjes voor met de sol-gelmethode als volgt:
   1. Bereid de precursoryoplossing door 40 mL tetraethylorthosilicaat (TEOS) te mengen met 10 mL 2 M salpzuur (HNO₃) als zuurkatalysator in een polypropyleen bekerglas onder continu roeren bij 300 rpm op kamertemperatuur.
   2. Voeg na 30 min calciumnitraattetrahydraat (Ca(NO₃)₂·4H₂O) en natriumnitraat (NaNO₃) toe om de doelsamenstelling in molaire percentages te bereiken: 45 mol% SiO₂, 24,5 mol% CaO, 24,5 mol% Na₂O en 6 mol% P₂O₅. Voeg triethylfosfaat (TEP) toe als fosforprecursor.
   3. Roer 24 h op kamertemperatuur. Laat de gel 24 h rijpen bij 60 °C in een afgesloten container. Droog 24 h bij 120 °C. Calcineer in een moffeloven bij 650 °C gedurende 3 h (opwarmingssnelheid: 2 °C/min). Maal het product en bevestig de fasesamenstelling via TEM en röntgendiffractie (XRD)^4,9.
      WAARSCHUWING: TEOS en ethanol zijn brandbaar. HNO₃ is corrosief. Voer alle procedures uit in een zuurkast, uit de buurt van ontstekingsbronnen.
5. Karakteriseer alle bereide nanodeeltjes met hoge-resolutie TEM en XRD om de deeltjesgrootte en kristalliniteit te bevestigen⁸. Registreer de gemiddelde deeltjesgrootte, de polydispersiteitsindex (PDI) en het zetapotentiaal met dynamische lichtverstrooiing (DLS) om de colloïdale stabiliteit te bevestigen. Accepteer batches met een gemiddelde deeltjesgrootte <200 nm en een zetapotentiaal <−15 mV of >+15 mV.

2. Oogsten en kweken van stamcellen

1. Win DPSC's of SCAP's uit vers geëxtraheerde geïmpacteerde mandibulaire derde molaren na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming¹⁰. Verwerk de geëxtraheerde tanden binnen 2 u na extractie en transporteer deze in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 °C.
   OPMERKING: De criteria voor donorgeschiktheid omvatten systemisch gezonde volwassenen in de leeftijd van 18–35 jaar, niet-rokers, zonder geschiedenis van antibioticagebruik in de voorafgaande 3 maanden, zonder periodontal ziekte en zonder radiografisch bewijs van periapicale pathologie.
2. Isoleer de cellen met de enzymatische digestiemethode⁹. Hak het tandweefsel in stukjes van 1–2 mm en digereer deze met een collagenase type I-oplossing met een concentratie van 3 mg/mL in serumvrij Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) gedurende 1 u bij 37 °C onder continue agitatie van 60 rpm op een schudplatform⁸. Neutraliseer met volledig kweekmedium en filter door een cellzeef van 70 µm.
   WAARSCHUWING: Collagenase type I kan endotoxinen bevatten. Gebruik uitsluitend op endotoxinen geteste collagenase van weefselkweekkwaliteit. Draag handschoenen en vermijd inademing.
3. Zaai de enkelcel-suspensie uit in flessen van 75 cm² met een initiële dichtheid van 1 × 10⁴ cellen/cm² in volledig kweekmedium bestaande uit DMEM, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (Tabel met Materialen)⁸.
4. Incubeer de flessen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂⁸. Controleer dagelijks op groei en contaminatie met een omgekeerde fasecontrastmicroscoop¹⁰. Vervang het kweekmedium elke 48–72 u. Gooi elke fles weg die tekenen van contaminatie vertoont (troebeling, kleurverandering, onregelmatige celmorfologie).
5. Oogst de cellen na de derde passage, wanneer een confluentie van ongeveer 70–80% is bereikt⁸. Aspireer voor de passage het medium, spoel met PBS en detach de cellen met 0,25% trypsine-EDTA bij 37 °C gedurende 3–5 min. Neutraliseer met volledig kweekmedium, centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en zaai opnieuw uit bij 1 × 10⁴ cellen/cm². Gebruik uitsluitend cellen tussen passage 3 en passage 6 om de fenotypische stabiliteit te behouden.

3. Karakterisering van stamcellen

1. Beoordeel het immunofenotype van de geïsoleerde cellen met behulp van flowcytometrie^8,10. Karakteriseer de cellen bij passage drie. Voeg een ongekleurde negatieve controle en enkelvoudig gekleurde compensatiecontroles toe voor elk gebruikte fluorochroom.
2. Stel de celconcentratie in op 10⁶/mL in PBS. Centrifugeer 10 min bij 800 x g en was het pellet twee keer met PBS^8,10.
3. Kleur de cellen met anti-humane antilichamen voor mesenchymale markers (CD44, CD73) en hematopoëtische markers (CD45) in de door de fabrikant aanbevolen verdunningen (doorgaans 1:100 in PBS met 1% runder serumalbumine (BSA) (Tabel met materialen)^8,10. Incubeer 45 min bij 4 °C in het donker. Was twee keer met PBS en resuspendeer in 300 µL PBS voor acquisitie.
4. Analyseer de cellen met behulp van flowcytometrie-analysesoftware (Tabel met materialen) om het immunofenotype te beoordelen (expressie van CD44 en CD73, met CD45 als hematopoëtische exclusiemarker). Pas sequentiële gating toe: (a) scatter-gating (FSC-A vs. SSC-A); (b) doublet-exclusie (FSC-H vs. FSC-A); (c) fluorochroom-specifieke gates ingesteld tegenover ongekleurde controles. Rapporteer het percentage positieve cellen voor elke marker samen met de gating-strategie.

4. Bepaling van de veilige materiaalconcentratie (halfmaximale effectieve concentratie, EC₅₀)

1. Bepaal de EC₅₀ met behulp van statistische analysesoftware (GraphPad Prism 9). Pas de dosis-responstgegevens toe op een niet-lineaire regressie sigmoïdale curve (vier-parameter logistisch model: Y = Bottom + (Top − Bottom) / (1 + 10^((LogEC₅₀ − X) × HillSlope))). Rapporteer de EC₅₀-waarde in µg/mL met een 95% betrouwbaarheidsinterval⁸.
2. Bereid seriële verdunningen van de nanomaterialen (50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 en 1,56 µg/mL) voor in 1 mL PBS. Vortex de stocksuspensie gedurende 30 s en sonicize vervolgens (probe sonicator, 40 W, 30 s aan/10 s uit voor 3 cycli bij 4 °C) om een homogene suspensie te garanderen. UV-steriliseer in een veiligheidskast onder UV-licht gedurende 30 min.
3. Kweek stamcellen bij een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen/well in 96-well platen gedurende 72 h met de verschillende concentraties en tel de levensvatbare cellen met Trypan blauw om de EC₅₀ te berekenen met behulp van het vier-parameter logistische model beschreven in stap 4.1.
4. Voer experimenten in triplikaat uit (n = 3 onafhankelijke wells per concentratie) met ten minste drie biologische replica's. Rapporteer EC₅₀-waarden als gemiddelde ± SD en bereken de variatiecoëfficiënt (CV%) over de replica's (acceptabele CV <15%).

5. Evaluatie van osteogene en odontogene differentiatie

OPMERKING: In deze sectie worden twee complementaire differentiatiepaden beoordeeld met behulp van parallelle immunofluorescentie-assays vanuit dezelfde celpreparatie. RANKL (stap 5.5) dient als de osteogene marker; DMP-1 (stap 5.6) dient als de odontogene marker. Beiden worden gekwantificeerd via dezelfde H-score-methodologie (stap 5.8). Voer beide assays uit op afzonderlijke dekglasjes die gelijktijdig zijn geprepareerd.

1. Zaai stamcellen in six-well platen met een dichtheid van 4,5 × 10⁵ cellen/well. Laat de cellen 24 uur hechten in volledig kweekmedium voordat de differentiatie wordt geïnitieerd.
2. Verdeel de monsters in vier groepen: negatieve controle (alleen DMEM), positieve controle (osteogeen/odontogeen differentiatiemedium) en experimentele groepen (nanomaterialen bij EC₅₀-afgeleide veilige concentraties).
3. Bereid osteogeen differentiatiemedium door DMEM aan te vullen met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 10 mM β-glycerofosfaat, 50 µg/mL ascorbinezuur (L-ascorbaat-2-fosfaat) en 100 nM dexamethason. Vervang het medium elke 48 uur. Incubeer gedurende 72 uur bij 37 °C en 5% CO2₂.
4. Meting van de ALP-activiteit
   1. Zaai cellen uit in 24-wells cultuurplaten bij 1 × 10⁴ cellen/putje en incuberen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2₂ gedurende 72 u.
   2. Aspireer het cultuurmedium, spoel de wells met PBS en lyseer de cellen door toe te voegen 200 µL lysisbuffer per putje (0,1% Triton X-100 in PBS) en incuberen bij 4 °C gedurende 10 min met voorzichtig schudden.
   3. Verzamel het lysaat en centrifugeer bij 500 x u gedurende 5 min bij 4 °Cgebruik het supernatant voor alle daaropvolgende ALP-metingen. Breng over 50 µL van elk testmonster en 100 µL van p-nitrofenolstandaarden in een 96-well microtiterplaat. Voeg AMP-substraatbuffer toe (Tabel met materialen) om de katalytische reactie te initiëren.
   4. Na een tweede incubatie van 30 min bij 37 °C, stop de reactie door toe te voegen van 50 µL van 0,5 M NaOH per well. Meet onmiddellijk de absorbantie bij 405 nm met een microplaatlezer voor absorbantie (Tabel met materialen).
   5. Stel een standaardcurve op van de absorptie tegenover de p-nitrofenolconcentratie en bereken de ALP-activiteit in U/L.
   6. Bepaal het totale eiwitgehalte van hetzelfde cellysaat met behulp van een Bradford- of BCA-eiwitassay. Normaliseer de ALP-activiteit naar het totale eiwitgehalte en rapporteer de uiteindelijke resultaten als U/mg eiwit.
5. Osteogene marker (RANKL)
   1. Beoordeel de eiwitexpressie van RANKL middels immunofluorescentie. Bereid eerst isotype- en secundaire-alleencontroles voor: (a) vervang het primaire antilichaam door een isotype-overeenkomstige konijnen-IgG in dezelfde concentratie, en (b) laat het primaire antilichaam in afzonderlijke wells volledig weg.
   2. Fixeer de cellen gedurende 15 min bij kamertemperatuur met vers bereid 4% formaldehyde in PBS. Was drie keer met PBS (telkens 5 min).
   3. Permeabiliseer gedurende 10 min met 0,1% Triton X-100 in PBS en blok vervolgens gedurende 1 u bij kamertemperatuur met 5% normaal geiten serum in PBS om aspecifieke binding te verminderen. Voeg zonder te wassen direct Rabbit Anti-RANKL primair antilichaam toe in een verdunning van 1:200 in blokkeringsbuffer (Tabel van materialen) en incuberen gedurende de nacht bij 4 °C.
   4. Was drie keer met PBS en incubeer vervolgens met een geconjugeerd fluorofoor secundair antilichaam Goat Anti-Rabbit IgG in een verdunning van 1:500 in blokkeringsbuffer (Tabel met materialen) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker⁸Na incubatie met het secundaire antilichaam drie keer wassen met PBS (telkens 5 min) en direct doorgaan naar stap 5.7 voor het monteren.
      WAARSCHUWING: Formaldehyde (4% oplossing) is een toxisch fixatief en waarschijnlijk carcinogeen. Bereid en gebruik dit uitsluitend in een gecertificeerde chemische zuurkast. Draag nitrielhandschoenen, een spatbril en een laboratoriumjas. Voer afvalverwijdering uit volgens de institutionele richtlijnen.
      OPMERKING. De celidentiteit wordt in plaats daarvan bevestigd via fasecontrastmicroscopie en morfologische criteria voorafgaand aan de immunofluorescentie-scoring (zie stap 5.10).
6. Odontogene marker (DMP-1)
   OPMERKING: Beoordeel de expressie van het DMP-1-eiwit (dentin matrix protein-1) met behulp van immunofluorescentie parallel aan stap 5.5 om de odontogene commitment te evalueren.
   1. Herhaal alle fixatie-, permeabilisatie- en blokkeringsstappen zoals beschreven in stap 5.5 met een aparte set dekglasjes uit dezelfde celpreparatie, inclusief isotypecontroles en controles met enkel secundaire antilichamen.
   2. Voeg na het blokkeren, zonder te wassen, direct een anti-DMP-1 primair antilichaam toe (zie Tabel met Materialen) in een verdunning van 1:200 in blokkeringsbuffer en incuberen gedurende de nacht bij 4 °CWas drie keer met PBS en incubeer vervolgens met het geschikte fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichaam (gebruik een spectraal verschillend fluorochroom dan dat voor RANKL is gebruikt; zie Tabel van Materialen) bij een verdunning van 1:500 in blokkeringsbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
   3. Leg fluorescentiebeelden vast bij een 10x vergroting om de DMP-1-expressie te evalueren als indicator voor odontoblast-achtige differentiatie¹⁰Na incubatie met het secundaire antilichaam drie keer wassen met PBS (telkens 5 min) en direct doorgaan naar stap 5.7 voor het monteren.
7. Monteer de preparaten met een antifade-montagemedium (zie Tabel met materialen) en laat dit een nacht bij kamertemperatuur inkleven. Monteer de met RANKL en DMP-1 gekleurde coupes apart en label deze duidelijk (bijv. "RANKL Groep 1" en "DMP-1 Groep 1") vóór de beeldvorming.
8. Beoordeel de preparaten onmiddellijk via fluorescentiemicroscopie of bewaar ze bij 4 °C beschermd tegen licht. Kwantificeer de eiwitexpressie door de kleuringsintensiteit te evalueren met behulp van een gestandaardiseerd viertraps scoresysteem: 0 (geen kleuring), 1+ (zwak), 2+ (matig) en 3+ (sterk).
9. Verwrijf beelden met identieke microscoopinstellingen (belichtingstijd, laservermogen en gain) voor alle experimentele groepen. Pas identieke instellingen onafhankelijk toe voor elke marker (RANKL en DMP-1) om consistentie binnen de markers over de groepen heen te waarborgen.
10. Kwantificeer minimaal vijf willekeurig geselecteerde sterk vergrote velden (20x objectief) per putje. Laat de score bepalen door twee onafhankelijke, geblindeerde waarnemers en rapporteer de Cohen's kappa-coëfficiënt (acceptabele kappa ≥ 0,7).
11. Bereken de H-score met behulp van de formule: H-score = Σ(i × P_i), waarbij i = kleuringsintensiteit (1, 2 of 3) en P_i = percentage cellen (0–100%) bij elk intensiteitsniveau.
    OPMERKING: De H-score varieert van 0 tot 300¹⁰.
12. Normaliseer de H-scoregegevens naar het totaal aantal cellen per veld, bepaald door het handmatig tellen van alle zichtbare cellen in elk veld onder fasecontrastmicroscopie voorafgaand aan de immunofluorescentie-imaging, om rekening te houden met verschillen in celdichtheid tussen de wells.
13. Bereken en rapporteer de H-scores afzonderlijk voor RANKL (osteogeen eindpunt) en DMP-1 (odontogeen eindpunt) om een directe vergelijking tussen de twee differentiatiepaden mogelijk te maken.

6. Evaluatie van proliferatie en levensvatbaarheid

1. Voer een celtelling uit met een hemocytometer en Trypanblauw-kleuring om levensvatige van niet-levensvatige cellen te onderscheiden. Bereken het totale aantal levensvatbare cellen per mL cultuur. Tel ten minste 100 cellen per monster voor statistische betrouwbaarheid.
2. Voer de MTT-assay uit om de mitochondriale metabole activiteit te meten^8,10.
   1. Voeg MTT-oplossing toe tot een eindconcentratie van 0,5 mg/ml (Tabel met materialen) aan de cellen toevoegen en 4 uur incuberen bij 37 °CVerwijder de oplossing en voeg een solubiliseringsmiddel toe (bijv. SDS-HCl; zie Tabel met materialen), en meet de optische dichtheid bij 570 nm met een spectrofotometer (referentiegolflengte: 630–650 nm).
   2. Bereken de cellevensvatbaarheid als volgt: Levensvatbaarheid (%) = (Absorbantie van behandelde cellen / Absorbantie van onbehandelde controlecellen) × 100. Waarden >100% duidt op proliferatieve stimulatie ten opzichte van de negatieve controle. Voeg een blanco putje toe voor achtergrondcorrectie.
   3. Normaliseer de resultaten naar het celgetal met behulp van een parallelle Trypanblauw-telling. Voer alle assays in triplikaat uit (n = 3 wells/groep, ≥3 biologische replica's).
      WAARSCHUWING: SDS-HCl solubilisatiebuffer is corrosief. Hanteer dit met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). Voer formazaanhoudend afval af in overeenstemming met de institutionele regelgeving.

Resultaten

Alle hier gepresenteerde resultaten zijn aangepast uit begeleidende studies^4,8,9,10 die zijn uitgevoerd door dezelfde onderzoeksgroep onder een eenduidige institutionele ethische goedkeuring (FDASU-Rec IM112105).

Karakterisering van nanomaterialen en isolatie van stamcellen
De gestandaardiseerde workflow levert in eerste instantie kwantificeerbare bevestiging van de eigenschappen van het scaffold en de fenotypes van de stamcellen op. Na de synthese worden de bereide nanomaterialen gevalideerd met behulp van hoge-resolutie TEM en XRD om de partikelgrootte en kristalliniteit te bevestigen (Figuur 1A,B). Tegelijkertijd vertonen DPSC's of SCAP's, geïsoleerd via enzymatische digestie, een robuuste hechting en proliferatie in volledig kweekmedium. Flowcytometrie-analyse valideert het immunofenotype van de geoogste cellen bij passage 3, wat resulteert in een hoge expressie van mesenchymale markers (CD44, CD43) en de niet-hematopoëtische oorsprong bevestigt door de afwezigheid van CD45 (Figuur 1C).

Vaststellen van een veilige materiaalkoncentratie en proliferatie
Door stamcellen gedurende 72 u te kweken bij seriële verdunningen van de nanomaterialen (50–1,56 µg/mL), levert een vierparameter logistische regressie van de levensvatbare celaantallen een betrouwbare EC₅₀-waarde op (niet-lineair sigmoïdaal dosis-responbmodel, zoals beschreven in stap 4.1). MTT-levensvatigheidswaarden die 100% overschrijden, duiden op proliferatieve stimulatie ten opzichte van de onbehandelde controle, aangezien de waarden worden genormaliseerd naar de negatieve controlegroep (onbehandelde cellen gesteld op 100%). Een waarde van ~196% voor Nano-NeoMTA2 weerspiegelt bijvoorbeeld bioactieve stimulatie van de mitochondriale activiteit in plaats van >100% absolute celoverleving⁹.

In verschillende studies waarin dit gestandaardiseerde protocol is toegepast, EC₅₀ waarden van 7.9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)⁸ en 9.92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSC's)¹⁰ werden vastgesteld met behulp van het vierparameter logistisch model (stap 4.1), waarmee veilige werkconcentraties voor gebruik in de in dit protocol beschreven differentiatie-assays zijn bevestigd. Deze waarden zijn opgenomen in Tabel 1 als representatieve validatiemetrieken.

Kwantificering van osteogene en odontogene differentiatie (dual-marker beoordeling)
De duale immunofluorescentiebenadering levert twee verschillende, complementaire uitkomstmaten op uit dezelfde celpreparatie. Voor de osteogene beoordeling onderscheidden RANKL H-scores alle vier de groepen met statistische significantie: cellen gekweekt met Nano-NeoMTA2 vertoonden een aanzienlijk hogere RANKL-expressie dan de negatieve controle, wat consistent is met een opgereguleerde osteoblast-achtige activatie (Figuur 2A, Tabel 1)^8,9. Voor de odontogene beoordeling onthulden DMP-1 H-scores een robuuste odontoblast-achtige differentiatie in DPSC's gekweekt met Nano-NeoMTA2, met H-scores die significant hoger waren dan die in de nanohydroxyapatiet- en negatieve controlegroepen, wat een preferentiële dentinogene commitment bevestigt (Figuur 3A, Tabel 1)¹⁰. De celidentiteit werd vóór de scoring bevestigd door fasecontrastmicroscopie en karakteristieke morfologische criteria (spoelvormige of polygonale morfologie).

De ALP-activiteit werd spectrophotometrisch bepaald voor alle groepen bij 405 nm, wat diende als een vroege enzymatische marker voor zowel osteogene als odontogene differentiatie (Tabel 1). Spectrophotometrische MTT-analyse bevestigde dat alle nanomaterialen bij veilige concentraties afgeleid van de EC₅₀ een hoge celviabiliteit behielden ten opzichte van de negatieve controle, in overeenstemming met de gepresenteerde representatieve waarden (Tabel 1).

Suboptimale en mislukte experimentele resultaten
Suboptimale resultaten zijn samengevat in Tabel 2. Een lage celviabiliteit in de MTT-assay wijst doorgaans erop dat de concentratie van het nanomateriaal de EC₅₀-drempel overschrijdt of dat de UV-sterilisatie onvoldoende was. Inconsistente ALP-absorbentie (CV > 20%) duidt over het algemeen op een ongelijkmatige zaaidichtheid of onvolledige homogenisatie van de lysisbuffer. Een zwak of afwezig immunofluorescentiesignaal voor zowel RANKL als DMP-1 is meestal het gevolg van antilichaam-inactivering, onvoldoende permeabilisatie of overfixatie; het gebruik van vers 4% formaldehyde en eenmalige antilichaam-aliquots lost dit op. Kruisreactiviteit tussen de RANKL- en DMP-1-kanalen moet worden uitgesloten door de beelden van de controles met enkel secundaire antilichamen te beoordelen vóór de scoring.

Figuur 1: Gestandaardiseerde karakterisering van nanomaterialen en validatie van het fenotype van stamcellen. (A) XRD-spectra die de kristallijne fase en structurele integriteit van de nanodeeltjes bevestigen. (B) Representatieve TEM-beelden die de nanostructuur van de deeltjesgrootte, morfologie en homogene dispersie van de gesynthetiseerde biomaterialen aantonen; vergelijking tussen NeoMTA2 en hydroxyapatiet. Beelden met lage vergroting worden getoond voor (a) NeoMTA2 en (b) hydroxyapatiet, terwijl beelden met hoge vergroting worden gedetailleerd in (c) NeoMTA2 en (d) hydroxyapatiet. Schaalbalken zijn weergegeven in de linkerbenedenhoek. (C) Flowcytometrisch gating-protocol voor de karakterisering van stamcellen. Representatieve multiparametrische dot-plots tonen cellen gekleurd voor CD44, CD73 (aangeduid als CD43 PE in de oorspronkelijke plots) en CD45. De CD44+ en CD73+ subpopulaties werden gegated op basis van de CD45-expressie. Paneel A en C zijn aangepast van Zaki et al.⁸ (CC BY-NC-SA) en Paneel B is aangepast van Habib et al.¹⁰ (CC BY-NC). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Kwantitatieve en semi-kwantitatieve beoordeling van osteogene differentiatie via RANKL-immunofluorescentie. (A) Representatieve hoge-resolutie immunofluorescentie-micrografieën die de expressie van cruciale osteogene eiwitmarkers RANKL vastleggen binnen de 2D-scaffold-micro-omgeving (a) Negatieve controlecellen vormen kleine kolonies met zwakke, membraangebonden RANKL-expressie, terwijl (b) positieve controlecellen een verhoogd aantal osteoblast-achtige kolonies vertonen met een dichte, homogene expressie. Stamcellen behandeld met (c) NHAP, (d) NHAP/chitosan, en (e) bioactieve glasnanodeeltjes vertonen geavanceerde differentiatie, gekenmerkt door grote, samengevoegde osteoblast-achtige kolonies met intense, homogene RANKL-lokalisatie in zowel het membraan als de nucleus; aangepast van: Elshahat et al.⁴. (B) Staafdiagrammen die de H-score kwantificatie van RANKL-expressie over de verschillende studies weergeven. Toepassing van de H-score-methodologie voor het normaliseren van immunofluorescentiegegevens. Door de visuele kleuringsintensiteit (gescoord van 0–3) wiskundig te integreren met het percentage positief gekleurde cellen, vertaalt de H-score kwalitatieve microscopie naar een robuuste, semi-kwantitatieve metriek, waardoor subjectieve waarnemersbias aanzienlijk wordt verminderd. (a) Vergelijking van Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) en bioactieve glasnanodeeltjes (NBG; 500 µg/mL) tegenover de positieve controle van het osteogene medium (OM-PC) en de DMEM-negatieve controle (DMEM-NC). NBG riep het hoogste expressieprofiel op (p &lt; 0,001). Aangepast van Abdelaziz et al. 9 (CC BY-NC-ND 4.0). (b) Evaluatie van nanohydroxyapatiet (NHAP; 10 µg/mL), NHAP/chitosan-composiet (10 µg/mL), en NBG (500 µg/mL) ten opzichte van de controles, waarbij NHAP/chitosan de hoogste H-scores vertoont. Aangepast van Elshahat et al.⁴ (CC BY 4.0). (c) Beoordeling van Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) versus NHAP (10 µg/mL) en controles, wat een significant verhoogde RANKL-expressie in de Nano-NeoMTA aantoont, aangepast van: Zaki et al.⁸. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve immunofluorescentiebeelden en H-score analyse. (A) Immunofluorescentiemicroscopische evaluatie van de expressie van Dentin Matrix Protein (DMP-1) over de experimentele groepen; groene fluorescentie duidt op een positieve kleuring voor polyklonale anti-DMP-1 antilichamen. (a) Negatieve controle: humane dentinepulpa-stamcellen (hDPSCs) in ongedifferentieerd medium (UM) vertonen kleine celaggregaten met een zwakke, uniforme DMP-1 expressie (+). (b) Positieve controle: hDPSCs in odontogeen medium (OM) vertonen een expansie van kolonies gekenmerkt door dichte, homogene DMP-1 signalen (++). (c) Nanohydroxyapatiet (10 μg/mL) en (d) Nano-NeoMTA2 (9.92 μg/mL): gedifferentieerde hDPSCs vormen grote, samengevoegde kolonies van odontoblast-achtige cellen die een robuuste, homogene DMP-1 expressie vertonen, gelokaliseerd in de membranen en kernen. Vergroting: ×10. Gele cirkels duiden odontoblast-achtige kolonies aan; gele pijlen duiden intense DMP-1 expressie aan. (B) Staafdiagram dat de H-score kwantificatie van de Dentin Matrix Protein expressie over de studiegroepen weergeeft. Er werd een zeer significant verschil waargenomen tussen de evaluatiegroepen, waarbij de hoogste H-score werd waargenomen in de Nano-NeoMTA2 cohort (169.33 ± 4.04), gevolgd door nanohydroxyapatiet (140.33 ± 2.52) en de negatieve controle (15.33 ± 1.53). Panelen A en B zijn aangepast van Habib et al.¹⁰ (CC BY-NC). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Assay / Parameter	Nanomateriaal / Celtype	Representatieve waarde (Gemiddelde ± SD)	Normalisatie	Bron
Celviabiliteit (MTT-assay)
MTT-viabiliteit	Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs	~196% (OD = 1,56 ± 0,24)	Genormaliseerd ten opzichte van onbehandelde controle (DMEM-NC = 100%)	Abdelaziz et al.⁹
MTT-viabiliteit	Chitosan-nHA (10 µg/mL) / SCAPs	~99,97%	Genormaliseerd ten opzichte van onbehandelde controle (DMEM-NC = 100%)	Elshahat et al.⁴
MTT-viabiliteit — Positieve Controle	OM-PC / SCAPs	113,46% (OD = 0,93 ± 0,03)	Genormaliseerd ten opzichte van onbehandelde controle (DMEM-NC = 100%)	Abdelaziz et al.⁹
MTT-viabiliteit — Negatieve Controle	DMEM-NC / SCAPs	100% (OD = 0,82 ± 0,02) — Referentieniveau	DMEM-NC gedefinieerd als 100% referentie voor alle groepen	Abdelaziz et al.⁹
Alkalische fosfatase (ALP)-activiteit
ALP-activiteit	Bioactieve glas-nanodeeltjes (500 µg/mL) / SCAPs	69,86 ± 0,98 U/L	Genormaliseerd naar totaal eiwitgehalte (U/mg eiwit, Bradford/BCA-assay)	Abdelaziz et al.⁹
ALP-activiteit — Positieve Controle	OM-PC / SCAPs	77,68 ± 1,28 U/L	Genormaliseerd naar totaal eiwitgehalte (U/mg eiwit, Bradford/BCA-assay)	Abdelaziz et al.⁹
ALP-activiteit — Negatieve Controle	DMEM-NC / SCAPs	55,81 ± 1,6 U/L	Genormaliseerd naar totaal eiwitgehalte (U/mg eiwit, Bradford/BCA-assay)	Abdelaziz et al.⁹
Veilige materiaalkoncentratie (EC₅₀)
EC₅₀ (SCAPs)	Nano-NeoMTA2 / SCAPs	7,9 µg/mL	Logistisch model met vier parameters (niet-lineaire sigmoïdale dosis-respons, GraphPad Prism 9)	Zaki et al.⁸
EC₅₀ (DPSCs)	Nano-NeoMTA2 / DPSCs	9,92 µg/mL	Logistisch model met vier parameters (niet-lineaire sigmoïdale dosis-respons, GraphPad Prism 9)	Habib et al.10
H-score — RANKL-eiwitexpressie (Osteogene marker)
H-score (RANKL) Osteogene marker	Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs	164 ± 4 (schaal 0–300)	Totaal aantal zichtbare cellen per veld (fasecontrastmicroscopie)	Zaki et al.⁸
H-score (RANKL) Osteogene marker	nHA (10 µg/mL) / SCAPs	68 ± 3 (schaal 0–300)	Totaal aantal zichtbare cellen per veld (fasecontrastmicroscopie)	Zaki et al.⁸
H-score (RANKL) Positieve Controle	OM-PC / SCAPs	84 ± 1 (schaal 0–300)	Totaal aantal zichtbare cellen per veld (fasecontrastmicroscopie)	Zaki et al.⁸
H-score (RANKL) Negatieve Controle	DMEM-NC / SCAPs	18 ± 1 (schaal 0–300)	Totaal aantal zichtbare cellen per veld (fasecontrastmicroscopie)	Zaki et al.⁸
H-score — DMP-1-eiwitexpressie (Odontogene marker)
H-score (DMP-1) Odontogene marker	Nano-NeoMTA2 (9,92 µg/mL) / DPSCs	169,33 ± 4,04 (schaal 0–300)	Totaal aantal zichtbare cellen per veld (fasecontrastmicroscopie)	Habib et al.10
H-score (DMP-1) Odontogene marker	nHA (10 µg/mL) / DPSCs	140,33 ± 2,52 (schaal 0–300)	Totaal aantal zichtbare cellen per veld (fasecontrastmicroscopie)	Habib et al.10
H-score (DMP-1) Negatieve Controle	DMEM-NC / DPSCs	15,33 ± 1,53 (schaal 0–300)	Totaal aantal zichtbare cellen per veld (fasecontrastmicroscopie)	Habib et al.10
H-score (DMP-1) Odontogene marker [Positieve Controle -OM-PC]	OM-PC / DPSCs	~103 H-score (schaal 0–300)	Totaal aantal cellen per veld (fasecontrastmicroscopie)	Habib et al. Eur Endod J, 202610
H-score = Σ(i × Pi): i = kleurintensiteit (1, 2 of 3); Pi = percentage cellen bij elk intensiteitsniveau (0–100%); bereik 0–300.  MTT-viabiliteit uitgedrukt relatief aan DMEM-NC gesteld als 100% referentie.  ALP-activiteit uitgedrukt als U/L uit enzymatische defosforylering van p-nitrofenylfosfaat; verder genormaliseerd naar totaal eiwitgehalte (U/mg eiwit).  OM-PC = osteogene/odontogene inductiemedium (positieve controle).  DMEM-NC = Dulbecco’s Modified Eagle Medium (negatieve controle).

Tabel 1: Representatieve resultaten van de gestandaardiseerde in vitro evaluatieworkflow. Representatieve kwantitatieve uitkomsten uit eerder gepubliceerde studies die celproliferatie, alkalische fosfatase-activiteit en immunofluorescentie-analyses aantonen, uitgevoerd met gebruik van het gestandaardiseerde protocol.

Waargenomen probleem	Mogelijke oorzaak	Aanbevolen oplossing
Lage cellevensvatbaarheid in MTT-assay (OD < onbehandelde controle)	Nanomateriaalconcentratie overschrijdt EC₅₀, of onvoldoende UV-sterilisatie, of inadequate dispersie van nanodeeltjes.	Voer EC opnieuw uit₅₀ bepaling (Sectie 4). Verleng de UV-sterilisatie tot 30 min. Verifieer de homogene nanodeeltjessuspensie door middel van probe-sonicatie (40 W, 30 s aan/uit, 3 cycli bij 4 °C) direct voor gebruik.
MTT-levensvatigheid CV >15% over de replica's	Pipetteerfouten, ongelijkmatige celuitzaaiing of variabele MTT-incubatietijd/-temperatuur.	Gebruik voor alle toevoegingen een gekalibreerde multichannelpipet. Bevestig de zaaidichtheid met een hemocytometer vóór het uitplaten. Handhaaf een strikte incubatie van 4 u bij 37 °C in een bevochtigde CO2-omgeving₂ incubator. Voeg een blanco putje toe voor achtergrondcorrectie.
Inconsistente ALP-absorptiewaarden (CV >20% over de putjes)	Ongelijkmatige celzaaidichtheid, onvolledige cellyse of inconsistenties bij het pipetteren tijdens de toevoeging van het substraat.	Houd u strikt aan 1 × 10⁴ cellen/well in 24-well platen. Vortex de lysisbuffer grondig voor gebruik. Houd een consistente lysisincubatie aan (10 min, 4 °C, voorzichtig schudden). Controleer de achtergrondabsorbentie met een blanco put zonder cellen.
Zwakke of afwezige RANKL-immunofluorescentie signaal (stap 5.4a)	Antilichaminactivering door onjuiste opslag, overfixatie waardoor de toegankelijkheid van epitopen afneemt, of onvoldoende permeabilisatie.	Bereid vlak voor gebruik verse 4% formaldehyde. Voeg voor het blokkeren een permeabilisatieoplossing met 0,1% Triton X-100 toe (10 min, kamertemperatuur). Titreer de verdunning van het primaire antilichaam (begin bij 1:200). Neem een positieve controle van een weefselcoupe mee. Verdeel de antilichaamvoorraad in aliquoten om herhaalde vries-dooi-cycli te vermijden.
Zwakke of afwezige DMP-1-immunofluorescentie signaal (stap 5.4b)	Inactivering van antilichamen door herhaalde vries-dooi-cycli, suboptimale verdunning van het primaire antilichaam of een incompatibele gastsoort van het secundaire antilichaam.	Verdeel het anti-DMP-1-antilichaam in aliquoten om vries-dooi-cycli te vermijden. Titreer de verdunning beginnend bij 1:200. Bevestig de compatibiliteit van de gastdiersoorten tussen het primaire (DMP-1) en het secundaire antilichaam. Neem een coupesectie van dentineweefsel op als positieve controle voor DMP-1.
Kruisreactiviteit tussen RANKL en DMP-1 fluorescentiekanalen	Spectrale overlap in emissiespectra indien hetzelfde fluorochroom wordt gebruikt voor beide secundaire antilichamen, of onvoldoende kanaalscheiding op de fluorescentiemicroscoop.	Gebruik spectraal verschillende fluorochromen van secundaire antilichamen voor RANKL en DMP-1 (bijv. Alexa Fluor 488 voor de ene marker, Alexa Fluor 594 voor de andere). Beoordeel de controlebeelden met enkel secundaire antilichamen voor elk kanaal onafhankelijk voordat u overgaat tot de scoring. Leg de RANKL- en DMP-1-beelden afzonderlijk vast met behulp van de sequentiële acquisitiemodus.
Hoge aspecifieke achtergrond bij immunofluorescentiekleuring	Onvoldoende blokkeren van eiwitten, een te hoge concentratie van het secundaire antilichaam of inadequate wasstappen tussen de incubaties.	Verleng de blokkeringsincubatie tot 2 uur bij kamertemperatuur. Verhoog de verdunning van het secundaire antilichaam naar 1:1000. Bevestig de specificiteit met de controle met alleen het secundaire antilichaam (zonder primair antilichaam). Zorg dat alle PBS-wasstappen volledig zijn (3 × 5 min elk).
Inter-waarnemer-variabiliteit van de H-score (Cohen's kappa) <0,7, stap 5.6)	Inconsistente toepassing van de vierpuntschaal voor kleuringsintensiteit (0, 1+, 2+, 3+) tussen waarnemers, of onvoldoende kalibratie voorafgaand aan de scoringssessies.	Voer voorafgaand aan de formele scoring een gezamenlijke kalibratiesessie uit met representatieve trainingsbeelden. Gebruik voor alle waarnemers identieke instellingen voor de beeldweergave (helderheid, contrast). Score een minimum van vijf hoog-vermogensvelden per well en bereken na elke 10 velden de kappa om drift te monitoren.
EC₅₀ curve convergeert niet of de pasvorm onvoldoende is (stap 4.1)	Onvoldoende datapunten, een te smal concentratiebereik, of het niet bereiken van een homogene suspensie voorafgaand aan het uitplaten.	Breid het bereik van de seriële verdunning uit om ten minste 6 concentraties te omvatten over een bereik van 50–1.56 µg/mLZorg ervoor dat de probe-sonicatie onmiddellijk voor elke verdunningsstap wordt uitgevoerd. Herhaal dit met ten minste 3 onafhankelijke biologische replica's. Bevestig de CV <15% over herhalingen.

Tabel 2: Kritieke parameters en gids voor probleemoplossing. Veelvoorkomende technische problemen tijdens het protocol, hun mogelijke oorzaken en aanbevolen oplossingen om de experimentele reproduceerbaarheid en datakwaliteit te verbeteren. Afkortingen: CV = variatiecoëfficiënt; RT = kamertemperatuur.

Discussie

De kritische stappen in dit protocol omvatten de nauwkeurige bepaling van de EC₅₀, een homogene nanomateriaalsuspensie en de normalisatie van de resultaten van de biologische assays. De berekening van de EC₅₀ via niet-lineaire regressie (vier-parameter logistisch model) biedt een nauwkeurigere schatting van de dosis-respons dan lineaire interpolatie en verdient de voorkeur wanneer er voldoende datapunten beschikbaar zijn^13,14. Het waarborgen van een homogene nanodeeltjessuspensie door middel van probe-sonificatie direct vóór blootstelling aan de cellen is cruciaal; slecht gedispergeerde suspensies leiden tot onbetrouwbare dosis-respons-curves en vertroebelen de EC₅₀-schattingen. Voor nieuwe materialen zoals NeoMTA2 is malen tot op nanoschaal een essentiële eerste stap, aangezien de bulkdeeltjesgrootte de oppervlaktereactiviteit en de daaropvolgende bioactiviteit aanzienlijk beïnvloedt^13,14. Indien een lage celviabiliteit wordt waargenomen bij concentraties die naar verwachting veilig zijn, dienen onderzoekers het UV-sterilisatieprotocol te verifiëren en de maal- en dispersieprocedures opnieuw te onderzoeken voordat de EC₅₀-assay wordt herhaald¹⁰.

Een hoeksteen van dit protocol is het gebruik van twee complementaire immunofluorescentiemarkers die distincte, maar overlappende differentiatiepaden weerspiegelen. De upregulatie van RANKL op osteoblast-achtige cellen weerspiegelt calciumion-gestuurde osteogene signalering en is proportioneel aan het aantal osteogene cellen^8,9, terwijl DMP-1-expressie dient als een specifieke indicator voor odontoblast-achtige differentiatie en dentinogene activiteit, wat het bijzonder relevant maakt wanneer de doelcelpopulatie uit DPSCs bestaat¹⁰. Door beide markers te kwantificeren met behulp van de H-score-methodologie, stelt dit protocol onderzoekers in staat om binnen één gestandaardiseerd assay-systeem onderscheid te maken tussen osteogene en odontogene lineage-commitment, een vooruitgang ten opzichte van benaderingen met een enkele marker die geen onderscheid kunnen maken tussen botvormende en dentinevormende commitment. Om de vergelijkbaarheid tussen studies te waarborgen, moeten zowel de RANKL- als de DMP-1 H-scores worden gerapporteerd in alle publicaties waarin dit protocol wordt gebruikt. Onderzoekers dienen spectraal verschillende fluorochromen te gebruiken voor de twee secundaire antilichamen om overlap tussen de kanalen te voorkomen en moeten de controlebeelden met alleen secundaire antilichamen beoordelen vóór de scoring.

Bij het aanpassen van dit protocol aan alternatieve biomaterialen of celmodellen kunnen verschillende methodologische wijzigingen nodig zijn. Voor sterk ondoorzichtige of gekleurde scaffolds kan interferentie met de MTT-absorbentie bij 570 nm een alternatieve viabiliteitsassay vereisen, zoals CellTiter-Glo (luminescentie) of PrestoBlue (resazurine-reductie), die minder gevoelig zijn voor optische interferentie door scaffoldmaterialen. Onderzoekers die SCAP's in plaats van DPSC's gebruiken, moeten er rekening mee houden dat SCAP's neigen naar een sterkere RANKL-expressie, wat hun grotere osteogene commitment weerspiegelt, terwijl DPSC's een meer uitgesproken DMP-1-expressie vertonen, wat wijst op hun sterkere odontogene/dentinogene lineage-bias. Het passagenummer is een kritische variabele: cellen voorbij passage 6 moeten worden vermeden, omdat ze een verminderd differentiatievermogen en een gewijzigde expressie van oppervlaktemarkers kunnen vertonen.

Beperkingen van dit methodologisch kader omvatten een kortstondig beoordelingsvenster (72 h), waardoor mineralisatiegebeurtenissen in de late fase, die gewoonlijk 14–21 dagen vereisen, mogelijk niet worden vastgelegd. Het ontbreken van in vivo validatie vormt een aanzienlijke translationele kloof. Het gebruik van de H-score introduceert potentiële variabiliteit tussen waarnemers; de inter-waarnemer betrouwbaarheid (Cohen's kappa) zoals gerapporteerd in sectie 5.10 moet worden opgenomen in alle gepubliceerde resultaten.

Dit raamwerk biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande benaderingen met een enkel eindpunt. Conventionele osteogene assays vertrouwen vaak uitsluitend op alizarinerood-kleuring of ALP-activiteit op één tijdstip. De integratie van MTT-viabiliteitsscreening, kwantificering van de ALP-activiteit en dubbele RANKL + DMP-1 immunofluorescentie H-scoring binnen één enkele workflow levert een multiparametrische output die een directe statistische vergelijking tussen verschillende scaffold-types onder identieke experimentele omstandigheden mogelijk maakt. De beschreven normalisatiestrategieën, waarbij de ALP-activiteit wordt uitgedrukt per mg proteïne, de MTT-resultaten als percentage van de onbehandelde controle en de H-score wordt genormaliseerd naar het totaal aantal cellen per veld, elimineren storende factoren door variabiliteit tussen de wells^4,8.

Toekomstige studies kunnen deze methodologie toepassen om de effecten van biomaterialen op inflammatoire markers, angiogene responsen of alternatieve stamcelmodellen te evalueren. De assay-sequentie is bovendien aanpasbaar voor 3D-scaffoldformaten. Uiteindelijk zal de adoptie van dit gestandaardiseerde kader door onafhankelijke laboratoria betekenisvolle meta-analytische vergelijkingen van de scaffoldprestaties in preklinisch onderzoek naar regeneratieve tandheelkunde faciliteren¹⁵.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
24-wells kweekplaten	Corning	3527	Gebruikt voor ALP-assays
96-wells platen	Corning	3596	Gebruikt voor ALP-absorptiemetingen en MTT-assays
ALP-assay kit	Abcam	ab83369 (of equivalent)	Gebruikt om alkalische fosfatase-activiteit te meten
ALP-substraatbuffer (2-amino-2-methyl-1-propanol)	Sigma-Aldrich	N/A	Gebruikt om de ALP-katalytische reactie te initiëren
Ammoniumhydroxide (NH4OH)	N/A	N/A	Gebruikt voor pH-aanpassing tijdens nanohydroxyapatiet-synthese. BIJTEND
Anti-DMP-1 primair antilichaam	N/A	N/A	Odontogene marker; 1:200 verdunning in blokkeringsbuffer; overnacht bij 4 °C
Anti-human CD44 antilichaam (CD44-FITC)	Beckman Coulter	N/A	Gebruikt voor flowcytometrie; positieve marker voor mesenchymale stamcellen
Anti-human CD45 antilichaam (CD45-PC5)	Beckman Coulter	N/A	Gebruikt voor flowcytometrie; negatieve marker voor hematopoëtische lijn
Anti-human CD73 antilichaam (CD73-PE)	Beckman Coulter	N/A	Gebruikt voor flowcytometrie; positieve marker voor mesenchymale stamcellen
Autoclaaf (hydrothermale reactor)	Tuttnauer	N/A	Gebruikt voor hydrothermale behandeling van nanohydroxyapatiet bij 140 °C, 0.3 MPa
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225 (of equivalent)	Gebruikt om de totale proteïneconcentratie te bepalen voor normalisatie van de ALP-activiteit
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	N/A	ingesteld op 37 °C en 5% CO2 voor alle celkweekstappen
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich	C0130	Gebruikt voor enzymatische digestie van dentale weefsels tijdens stamcelisolatie
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	11965-092	Basaal kweekmedium; ook gebruikt als negatieve controlegroep
Fetaal runderserum (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10270-106	Supplement voor compleet kweekmedium; MSC-gekwalificeerd FBS gebruikt voor differentiatiemedium
Flowcytometer (Navios)	Beckman Coulter	Navios	Gebruikt voor immunofenotypering van stamcellen
Flowcytometrie-analyse software (Navios)	Beckman Coulter	N/A	Gebruikt voor gating en data-analyse van flowcytometrie-panels
Fluorescentiemicroscoop	Labomed / NY Microscope Company	9126000	Gebruikt voor immunofluorescentie-imaging en H-score scoring
Vriesdroger (lyofilisator)	Labconco	N/A	Gebruikt om nanomateriaalprecipitaten te drogen bij −50 °C
Geit anti-konijn IgG secundair antilichaam (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	A-11034	Fluorescerend secundair antilichaam; 1:500 verdunning; 1 u bij kamertemperatuur
Geit anti-konijn IgG secundair antilichaam (Alexa Fluor 594)	Invitrogen (of equivalent)	A-11012 (of equivalent)	Spectraal verschillend secundair antilichaam gebruikt voor DMP-1 immunofluorescentie bij multiplex kleuring
GraphPad Prism software	GraphPad Software	Versie 9	Gebruikt voor EC50 berekening en statistische analyse
Hemocytometer	Neubauer	N/A	Gebruikt voor handmatige celtelling en totaal celgetal voor H-score normalisatie
Inverteerde fasecontrastmicroscoop	Olympus	N/A	Gebruikt voor dagelijkse monitoring van celgroei en morfologie
Montagemedium, antifade (ProLong Gold)	Invitrogen	P36930	Gebruikt voor het monteren van coupes na immunofluorescentiekleuring
MTT-reagens	Invitrogen	M6494	Gebruikt om de metabole activiteit van cellen te beoordelen; 0.5 mg/mL, 4 u bij 37 °C
Nanohydroxyapatiet (NHAP)	Nanogate, Cairo, Egypte	N/A	Gesynthetiseerd door natte precipitatie of commercieel verkregen; gebruikt bij 10 µg/mL
NeoMTA2 poeder	NuSmile Ltd. / Avalon Biomed	N/A	Startmateriaal voor Nano-NeoMTA2 preparatie via planetaire kogelmolen
Normaal geitenserum	N/A	N/A	Gebruikt voor blokkering (5% in PBS) vóór applicatie van het primaire antilichaam
Osteogene/odontogene differentiatiemedium	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	N/A	Positief controlemedium; bevat DMEM, FBS, ascorbaat, bèta-glycerofosfaat en dexamethason
Paraformaldehyde (4%)	Sigma-Aldrich	P6148	Gebruikt voor celfixatie vóór immunofluorescentie. GIFTIG — gebruik in zuurkast
PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7.4)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10010-023	Gebruikt voor celwassing, antilichaamverdunning en nanomateriaalsuspensie
Penicilline-streptomycine oplossing	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	15140-122	Antibioticumsupplement; gebruikt bij 1% in compleet kweekmedium
Planetaire kogelmolen	Retsch (of equivalent)	PM 400	Gebruikt voor het nanodimensioneren van NeoMTA2 poeder; 350 rpm, 10 u
p-Nitrophenol standaarden	Sigma-Aldrich	N/A	Gebruikt om de ALP-activiteitsstandaardcurve te genereren
Konijn anti-RANKL primair antilichaam	Abcam	ab9957	Osteogene marker; 1:200 verdunning; overnacht bij 4 °C
Konijn IgG isotype controle-antilichaam		N/A	Negatieve controle voor immunofluorescentie; concentratie gelijk aan primair antilichaam
SDS-HCl solubilisatielossing	Sigma-Aldrich	N/A	Gebruikt om MTT-formazankristallen op te lossen. BIJTEND
Zes-wells weefselkweekplaten	Corning	3516	Gebruikt voor differentiatie-assays
Natriumhydroxide (NaOH), 0.5 M	Sigma-Aldrich (of equivalent)	N/A	Gebruikt om de ALP-reactie te stoppen vóór de absorptiemeting; BIJTEND
Sonicator (sondeprobe / ultrasoon bad)	Branson Ultrasonics	N/A	Gebruikt voor dispersie van nanodeeltjes vóór biologische assays
T-75 kweekflessen	Corning	430641	Gebruikt voor expansie van stamcellen
TEOS (tetraethylorthosilicaat)	N/A	N/A	Silicaprecursor voor 45S5 bioactief glas sol-gel synthese. ONTBRANDBAAR
Transmissie-elektronenmicroscoop	JEOL Ltd.	JEM-2100	Gebruikt voor karakterisering van grootte en morfologie van nanomateriaal
Triton X-100 (0.1% in PBS)	N/A	N/A	Gebruikt voor celpermeabilisatie vóór immunofluorescentie
Trypaanblauw oplossing (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154	Gebruikt voor beoordeling van celviabiliteit
Röntgendiffractometer (X'PERT-PRO)	PANalytical	X'PERT-PRO	Gebruikt voor kristallografische analyse van nanodeeltjes