Dit protocol beschrijft methoden voor het genereren van samengestelde transgene zebravisjes, het imagen van immuuncellen geassocieerd met tumoren in larvale en volwassen zebravisjes, en het kwantificeren van de frequentie van immuuncellen binnen de tumor-micro-omgeving.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beeldvorming en kwantificering van immuuncellen in de tumoromgeving met behulp van een zebravismodel voor neuroblastoom
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De rekrutering van immuuncellen naar de tumoromgeving (TME) is een belangrijk onderdeel van de immuunregulatie en tumorprogressie. Het bestuderen van de ruimtelijke en temporele relaties tussen immuuncellen en tumorcellen in vivo kan inzicht bieden in interacties binnen de TME. Het visualiseren en kwantificeren van deze interacties in intacte organismen blijft echter uitdagend met conventionele beeldvormings- en histologische benaderingen. Zebravissen vormen een waardevol model voor kankeronderzoek vanwege hun genetische hanteerbaarheid, snelle ontwikkeling en optische transparantie tijdens vroege ontwikkelingsstadia, waardoor visualisatie van fluorescentiegelabelde cellen mogelijk is. in vivoHier presenteren wij een protocol voor het genereren, identificeren, beelden en kwantificeren van immuun- en tumorcellen die differentieel zijn gelabeld met fluorescente markers in een zebravismodel van neuroblastoom. Het protocol omvat het fokken en screenen van samengestelde transgene zebravisjes, live-imaging van larven, de preparatie en beeldvorming van volwassen tumordragende vissen, en de kwantificering van immuuncellen rondom en binnen tumorregio's. Met behulp van transgene reporterlijnen, CD4+ immuuncellen en MYCN-gestuurde neuroblastoomcellen kunnen worden gevisualiseerd en geanalyseerd in verschillende ontwikkelingsstadia. De workflow maakt het mogelijk om de lokalisatie van immuuncellen ten opzichte van tumoren in zowel larvale als volwassen vissen te beoordelen en kan worden gebruikt om de abundantie van immuuncellen in verschillende ziektestadia te vergelijken. Dit protocol biedt een reproduceerbare aanpak voor het imagen en kwantificeren van immuuncellen binnen de TME in vivo met gebruik van zebravis en kan studies naar immuun-tumorinteracties in andere kankermodellen faciliteren.
Inleiding
De tumoromgeving (TME) is een ecosysteem bestaande uit tumor-, immuun-, fibroblast- en vasculaire cellen1. De TME speelt een essentiële rol bij de progressie van kanker, de therapeutische respons en de antitumorale immuniteit. Binnen de TME zijn immuuncellen belangrijke regulatoren van het lot van de tumor, waarbij ze ofwel deelnemen aan antitumorale responsen ofwel immunosuppressie induceren2. Het begrijpen van de rekrutering, distributie en functie van immuuncellen binnen de TME is cruciaal voor het verduidelijken van de mechanismen waarmee tumoren aan immuunbewaking ontsnappen. Conventionele benaderingen voor het best....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
All animal procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) at Boston University Chobanian & Avedisian School of Medicine under protocol PROTO202100001. The overall workflow for generation of compound transgenic zebrafish, larval imaging, adult tissue preparation, and image analysis is summarized in Figure 1.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De algemene experimentele workflow wordt weergegeven in Figuur 1. Volwassen Tg(cd4-1:mCherry) zebravissen werden gekruist met Tg(dβh:MYCN;dβh:EGFP) zebravissen om samengestelde transgene nakomelingen te genereren waarin CD4+ cellen en dβh-expresserende cellen respectievelijk differentieel werden gelabeld met mCherry- en EGFP-fluorescentie. Embryo's werden gescreend op de juiste fluorescentiemarkers en vervolgens geanalyseerd middels live confocale imagin.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier beschreven protocol maakt gebruik van zebravis als in vivo model om immuuncellen binnen de TME te visualiseren en te kwantificeren. Verschillende factoren zijn cruciaal voor een succesvolle implementatie van deze benadering. Ten eerste zijn de juiste selectie en validatie van samengestelde transgene zebravislijnen essentieel. Larven moeten worden gescreend op de verwachte fluorescente expressiepatronen en, indien nodig, worden bevestigd via genotypering. De expressie van immuun-reporters en oncogenen mo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen te hebben.
Dankbetuigingen
Wij erkennen de ondersteuning van de National Institutes of Health (NIH; 1UL1TR001430, CA215059 en NS140967), de American Cancer Society (RSG-17-204-01-TBG), de National Science Foundation (1911253) en Alex’s Lemonade Stand Foundation aan H.F.; en van een Warren Alpert Distinguished Scholars Fellowship aan X.Q. Y.W. werd ondersteund door het Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (UROP) en het St. Baldrick’s Summer Fellowship Program. M.V. werd ondersteund door het St. Baldrick’s Summer Fellowship Program. De inhoud van dit artikel is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële sta....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 200 µL Gel Loading Tip | MilliporeSigma | 1022-0600 | Gebruikt voor manipulatie van larven |
| Kunstplanten | The Hidden Reef | 62874200000000000 | Optionele verrijking voor kweek |
| Bleekmiddel | Fisher Scientific | 50371500 | Gebruikt voor decomcontaminatie van embryo's |
| Cell Counter Plugin | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Fiji-plugin gebruikt voor celkwantificering |
| Computer en Monitor | HP | 2TB68A8#ABA | Gebruikt voor beeldacquisitie en analyse |
| Confocale microscoop | Zeiss | LSM 710 | Gebruikt voor beeldvorming van larven en volwassenen |
| Cryomould, plastic | Epredia | 22-050-160 | Gebruikt voor OCT-inbedding |
| Cryostaat | Thermo Fisher Scientific | 95-664-0EC70 | Gebruikt voor cryosectie |
| Droogijs | Fisher Scientific | N/A | Gebruikt voor transport van monsters |
| Fiji Software | National Institutes of Health (NIH) | Version 1.54p | Software voor beeldanalyse |
| Fijnmazig net | Carolina Biological | 651345 | Gebruikt voor het verzamelen van embryo's |
| Visincubator | VWR | 35960-056 | Gehouden op 28,5°C |
| Pincet | Fisher Scientific | 10-316B | Gebruikt voor monsterbehandeling |
| Glass-bottom dish | IBIDI | 81218-200 | Gebruikt voor beeldvorming |
| Low-melting agarose | Prolab Supply | 9012-36-6 | Gebruikt voor het monteren van larven en volwassenen |
| Paartank (hoofdtank, scheidingswand, roostergedeelte) | Carolina Biological | 161937 | Gebruikt voor de kweek van zebravissen |
| Nutating Rocker | Midsci | R2D-30 | Gebruikt voor fixatie tijdens incubatie overnacht |
| OCT-compound | Tissue-Tek | 4583 | Inbeddingsmedium voor cryosectie |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 158127-500G | Fixatief |
| Petrischaal, plastic | MilliporeSigma | BR452000 | Gebruikt voor het hanteren van embryo's en larven |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Gibco | 14080-055 | Gebruikt voor was- en fixatieprocedures |
| Plastic transferpipet | Fisher Scientific | 50-998-100 | Gebruikt voor overdracht van embryo's en larven |
| Scheermesje | Fisher Scientific | 12-640 | Gebruikt tijdens monsterpreparatie |
| Geleidbaarheidsmeter | YSI | EC300ACC-04 | Gebruikt om de saliniteit van rotifer-water te verifiëren |
| Rotiferen | The Hidden Reef | 116151603 | Gebruikt voor de opkweek van larven |
| Natriumthiosulfaat | Thermo Fisher Scientific | AAA1762936 | Gebruikt voor neutralisatie van bleekmiddel |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590A | Cryoprotectiemiddel |
| Tricaine methansulfonaat | Western Chemical | NC0872873 | Anesthesicum; verkocht door Fisher Scientific |
| Pincet | Fisher Scientific | 12-000-122 | Gebruikt voor monsterbehandeling |
| Rechte fluorescentiemicroscoop | Leica | M165 | Gebruikt voor fluorescentiescreening |
Referenties
- Anderson NM, Simon MC. The tumor microenvironment. Curr Biol. 2020;30(16):R921-R925.
- Kumagai S, Momoi Y, Nishikawa H. Immunogenomic cancer evolution: A framework to understand cancer immunosuppression. Sci Immunol. 2025;10(105):eabo5570.
- Keren L, et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 2018;174(6):1373-1387.e19.
- Gerner MY, et al. Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 2012;37(2):364-376.
- Pittet MJ, Weissleder R. Intravital imaging. Cell. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar