Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een nieuwe schaalbiopsiemethode om kwaadaardige en niet-kwaadaardige lymfocyten van zebravissen te verzamelen

143 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72153

⸱

7 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Division of Pediatric Hematology-Oncology, Department of Pediatrics, Stephenson Cancer Center, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

In dit artikel

Samenvatting

Een nieuwe schaalbiopsiemethode maakt het mogelijk om acute lymfoblastische leukemiecellen van levende zebravissen te verzamelen. De resultaten tonen een overvloed aan lymfocyten in wildtype (WT) visschubben, en een sterk verhoogde lymfocyten in schubben van vissen met ALL (acute lymfoblastische leukemie). Deze techniek maakt minimaal invasieve studie van epidermale normale en kwaadaardige lymfocyten mogelijk.

Samenvatting

Zebravissen (Danio rerio) zijn een krachtig model voor het bestuderen van lymfopoëse en lymfoïde kankers, aangezien zebravissen en mensen vergelijkbare adaptieve immuunsystemen delen, waaronder B- en T-cellen. Verschillende D. rerio T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL) modellen worden beschreven, waaronder vissen die lymfoblast-specifieke humane MYC (hMYC) tot expressie brengen. We meldden dat rag2:hMYC-vissen ook B-cel acute lymfoblastische leukemie (B-ALL) ontwikkelen, waardoor ze nuttig zijn om beide ALLE typen te bestuderen. Een beperking van zebrafish ALL-modellen is dat er geen niet-dodelijke methoden bestaan voor seriële bemonstering van ALL. Om dit aan te pakken, hebben we een nieuwe 'schaalbiopsie'-methode ontwikkeld om ALLE cellen van levende zebravissen te verzamelen. Kennis over welke lymfocyten zich in normale zebravisschubben bevinden is echter schaars. Om normale epidermale lymfocytidentiteiten te definiëren, voerden we dus schaalbiopten uit op lymfocyten-gelabelde transgene lijnen zonder rag2:hMYC. We gebruikten conventionele en confocale microscopie om de schubben te analyseren, waarbij overvloedige epidermale lymfocyten aan het licht kwamen. We analyseerden ook schubben van vissen met T- en B-ALL, die een duidelijk verhoogde lymfocytenconcentratie in confluente sheets van ALL-cellen in veel schubben aantoonden. Vervolgens gebruikten we fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om niet-maligne en ALLE lymfocyten van schubben te zuiveren voor ex vivo studies. Flowcytometrische en expressieanalyses van ALLE cellen uit schubben of andere weefsels van dezelfde vis toonden aan dat de genexpressie van ALLE cellen op schaal leek op die van ALLE cellen elders. We hebben ook het aantal normale T-, B-, T-ALL- en B-ALL-cellen gekwantificeerd dat per schaal gezuiverd kon worden. Al met al biedt schubbiopsie een niet-dodelijke, minimaal invasieve techniek om zebravis-epidermale lymfocyten te bestuderen, waardoor ex vivo studies mogelijk zijn, inclusief analyses van kwaadaardige monsters.

Inleiding

De barrièrefunctie en -rol van de huid van zoogdieren in de immuniteit zijn vastgesteld 1,2,3. Zoogdierlymfocyten dragen bij aan de cutane immuniteit, waarbij cytotoxische T-cellen in de epidermis zitten, en B-, T- en natuurlijke killer (NK) cellen aanwezig zijn in de dermis 1,3,4,5. Zebravissen hebben deze lymfocyten, met oppervlakte-immunoglobulinen, T-celreceptoren, major histocompatibility complex (MHC)-receptoren, cytokines en hun receptoren, en andere immuunmoleculen, en delen daarmee de meeste immunologische kenmerkenvan zoogdieren 6,7,8,9. Recente studies van zebravishuid en schubben toonden verschillende cutane lymfocytpopulaties aan, waaronder epitheliale T- en B-cellen10,11, en een lymfoïde netwerk dat de T-celhandel en antigeensurveillance faciliteert12. Overeenkomsten tussen lymfocyten van teleostvissen en zoogdieren maken D. rerio tot een krachtig in vivo model om lymfopoëse, lymfocytfunctie en lymfoïde ziekten te bestuderen, waaronder acute lymfoblastische leukemie (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.

Ons eerdere onderzoek toonde aan dat T- en B-lijnage ALL (T-ALL, B-ALL) beide voorkomen bij transgene rag2:hMYC zebravissen, waardoor deze lijn nuttig is om beide ALLE types 13,15,21,22 te bestuderen. Een belangrijke beperking van D. rerio ALL-modellen, met name in longitudinale expressiestudies of geneesmiddelentesten, is het ontbreken van methoden om seriële ALL-monsters van individuele dieren te verzamelen. Eerdere methoden, zoals retro-orbitale bloedafname, zijn technisch uitdagend vanwege de kleine omvang van D. rerio, waardoor seriële bloedmonstersmoeilijk worden genomen. Daarom euthanaseren de meeste onderzoekers zebravissen om ALLE cellen te verkrijgen. Dit is gebruikelijke praktijk in het laboratorium en bij de meeste in het veld, maar het sluit de mogelijkheid uit om longitudinale experimenten op levende dieren uit te voeren. Om dit te overwinnen, beschreven we onlangs epitheliale T- en B-lymfocyten in zebravisschubben die zijn verzameld met een niet-dodelijke schubbiopsiestrategie 10. Een andere recente studie toonde een T-celreservoir op of nabij het zebravisoppervlak, tussen aangrenzende schubben12. D. rerio herbergt honderden schubben, die snel regenereren slechts enkele dagen na verwijderingvan 24. Samen wijzen deze bevindingen en kenmerken erop dat zebravisschubben een bron zijn van lymfocyten die geen euthanasie vereisen, waardoor longitudinale studies bij levende vissen mogelijk zijn.

Hier beschrijven we een schaalbiopsiemethode voor het verzamelen van zebravis-epidermale lymfocyten van vissen met lymfocytenspecifieke fluorofoormarkers, met of zonder ALL. Om T-lijncellen te bestuderen, gebruikten we goed gevestigde lck:GFP-vissen en een vergelijkbare lck:mCherry-lijn; beide labelen T- en T-ALLE cellen10, 13, 15, 20. Om B-lijncellen te bestuderen, gebruikten we cd79a:GFP en cd79b:GFP transgene vissen met fluorescentie-gelabelde B- en B-ALL-cellen 10,13,17. Elk van deze lijnen maakt visualisatie mogelijk met fluorescentiemicroscopie en flowcytometrische celsorteringzuivering 13. We onderzochten schubben na de biopsie, genereerden hoogresolutiebeelden van lymfocyten in schubben, identificeerden epidermale lymfocytgenexpressie met qRT-PCR, vergeleken deze met die van lymfocyten van andere lymfoïde weefsels van dezelfde vis, en kwantificeerden lymfocyten per schaal door middel van flowcytometrie/fluorescentie-geactiveerde celsortering. Samenvattend beschrijft het protocol een eenvoudige en praktische methode om lymfocyten uit levende zebravissen te verkrijgen, waaronder het bemonsteren van individuele dieren in de longitudinale periode over meerdere tijdspunten in een experimentele sequentie. Deze methode is bedoeld om de lymfocytenbiologie van zebravissen, leukemieprogressie, medicijnresponsen of andere longitudinale experimentele ontwerpen te bestuderen die herhaalde bemonstering van individuele zebravissen vereisen. We ontwikkelden het protocol met volwassen transgene zebravissen met fluorescentie-gelabelde lymfocytpopulaties en valideerden het voor latere toepassingen, waaronder fluorescentiemicroscopie, flowcytometrie/fluorescentie-geactiveerde celsortering, RNA-expressie-analyses en andere ex vivo studies die levensvatbare lymfocyten vereisten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het University of Oklahoma Health Sciences Center (protocollen 24-028-EAH en 25-068-EACHIR). Dit protocol biedt een benadering om normale en/of kwaadaardige lymfocyten te isoleren en te analyseren van de schubben van levende zebravissen, met details over het doel, de uitvoering en de principes die aan deze procedures ten grondslag liggen.

VOORZICHTIG: MS-222 is een gevaarlijk chemisch anestheticum en moet worden behandeld met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), zoals laboratoriumhandschoenen, oogbescherming en een laboratoriumjas. Verwijder MS-222 oplossingen in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor chemisch afval. Wees voorzichtig bij het hanteren van naalden en tangen om scherpe verwondingen te voorkomen. Beschouw alle biologische monsters als potentieel biologisch gevaarlijk en voer afval af volgens de institutionele bioveiligheidsprocedures.

1. Voorbereiding van sorteermedia

  1. Supplement 1× RPMI 1640 media-oplossing met 1% foetaal rundserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine.
    OPMERKING: RPMI 1640 media houdt de levensvatbaarheid van lymfocyten ex vivo. RPMI 1640 kan worden vervangen door 0,9× PBS. Foetaal rundereserum (FBS) levert groeifactoren om de cellulaire levensvatbaarheid te bevorderen. Penicilline en streptomycine beperken bacteriële besmetting.
  2. Aliquot-media in 1,5 mL microcentrifugebuizen in volumes van 500 μL, waarbij elke buis bedoeld is voor schalen van 10–20. Houd sorteermediabuizen op ijs.

2. Zebravisanesthesie, fluorescentiemicroscopiescreening en beeldvorming

  1. Verdoof D. rerio met gebufferde 0,02% tricaïne methanesulfonaat (MS-222), bereid volgens de richtlijnen voor de institutionele dierenverzorging met water uit het vissysteem.
  2. Zodra de vis is gesedeerd, plaats je de vis voorzichtig in een celkweekschotel met voldoende systeemwater (plus 0,02% MS-222) om vocht te behouden tijdens het volgende gebruik.
  3. Onderzoek en beeld verdoofde vissen met een epifluorescentiemicroscoop om fluorescentie van het transgen(en) te detecteren. Deze stap identificeert fluorescerende schubben voor een biopsie.
    OPMERKING: Lijnen zonder fluorescerende transgenen kunnen worden bekeken met standaard lichtmicroscopie.
  4. Gebruik fluorescentie om T-cellen te identificeren (lck:GFP of lck:mCherry fish) of T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP of lck:mCherry fish). T-lijncellen zijn helder fluorescerend in deze lijnen; B-ALLE cellen zijn zwak fluorescerend in de lck:GFP- en lck:mCherry-achtergronden 13,15,21.
  5. Screen B-lineage-labeld cd79a:GFP of cd79b:GFP-vissen (met of zonder rag2:hMYC) voor epidermale B-cellen en/of B-ALL, waarbij GFP wordt gebruikt om schubben voor biopsie te selecteren.
  6. Oefen met het positioneren van zebravissen en het aanpassen van de microscoopinstellingen vóór de biopsie, als beeldvorming gewenst is
    OPMERKING: Beeldvorming en biopsie vereisen 5–7 minuten sedatie via 0,02% MS-222. Monitor de operculaire beweging continu. Als de operculaire beweging aanzienlijk vertraagt of stopt, plaats de vis dan onmiddellijk in een anesthetic-vrij systeem en stop de biopsie. Breng elke 1–2 minuut tijdens beeldvorming en biopsie opnieuw ~50–100 μL verdovend viswater aan op de huid, het operculum en de kieuwen om het vocht aan de oppervlakte te behouden.

3. Schaalverzameling en -voorbereiding

  1. Om de vis voor een biopsie te positioneren, leg je de gesedeerde vis op zijn zij in een celkweekschaal.
  2. Om te voorkomen dat de vis tijdens de biopsie wegglijdt, gebruik je een vochtige spons met een lineaire of V-vormige uitsparing en plaats je deze in de celkweekschaal om de vis te wiegen.
  3. Zorg er ook voor dat het waterpeil van het systeem nauwelijks de bodem van de celkweekschaal bedekt (genoeg om het oppervlak vochtig te houden) zodat de oppervlaktespanning de vis stabiliseert.
  4. Breng periodiek ~50–100 μL van 0,02% MS-222, bereid in systeemwater, toe op het operculum en de kieuwen om vocht te behouden en de anesthesie tijdens beeldvorming en biopsie te behouden.
  5. Voer een biopsie uit met behulp van epifluorescentiemicroscopie om sterk fluorescerende schubben te selecteren die verrijkt zijn met lymfocyten of ALLE cellen.
  6. Verzamel 10–20 aangrenzende schubben uit één sterk fluorescerend gebied, bij voorkeur binnen de eerste of tweede horizontale gepigmenteerde streep.
    OPMERKING: Eén schaal is over het algemeen voldoende voor beeldvorming. Een verzameling van 10–20 schubben levert doorgaans >1.000 lymfocyten op van WT-vissen en wordt aanbevolen voor downstream-analyses zoals flowcytometrie en qRT-PCR.
  7. Dominante hand (naald): Gebruik een naald van 31 gauge, plaats voorzichtig de naaldpunt onder de achterrand van een schub en draai deze naar voren (d.w.z. cephalad). Gebruik voor elke vis een andere steriele naald. Schone pincet tussen de vissen; steriliseer indien vereist volgens institutionele procedures.
    OPMERKING: Het verhogen van de schub met een naald is beter dan alleen een pincett, omdat het de schub optilt om oppervlakkig schrapen te minimaliseren. Dit zorgt ervoor dat de tere epidermale laag onder de schub aan het oppervlak blijft hechten, wat cruciaal is voor het maximaliseren van de celopbrengst.
  8. Niet-dominante hand (pincett): Houdt de weegschaal in de voorovergedraaide positie met de naald vast en grijpt met de pincet het stijve buitenoppervlak van de schub. Haal de schub in een vloeiende beweging uit zijn zak.
    OPMERKING: Lichte bloedingen kunnen optreden op plekken waar schubben worden verwijderd, wat doorgaans zelfbeperkt is.
  9. Als er overmatig bloeding optreedt, oefen dan zachte druk uit met een tang en spoel kort af met 0,02% MS-222 in systeemwater.
    OPMERKING: Hemostase kan binnen enkele seconden worden bereikt voordat men naar de volgende toonladder gaat.
  10. Om meerdere schubben te bioptiëren, verzamel je 10–20 schubben per vis, waarbij aangrenzende schubben uit een aaneengesloten gebied in één horizontale gepigmenteerde streep worden verwijderd, in plaats van meerdere lichaamsdelen of beide zijden van het dier.
  11. Trek individuele schubben achter elkaar en houd ze tijdens het verzamelen op de uiteinden van de tang, met het mediale schuboppervlak naar boven gericht.
  12. Om te voorkomen dat de opgehoopte schubben worden verstoord door het daaropvolgende verwijderen van schubben, draai je elke schub eerst naar voren en grijp je deze vervolgens aan de achterrand. Overbreng weegschalen naar een buis met sorteermedia nadat elke 5 weegschalen zijn verzameld, of wanneer extra weegschalen niet veilig op de pincetten kunnen worden vastgehouden.
  13. Na het verzamelen van de schaal verwerkt u monsters zo snel mogelijk. Onmiddellijk overbrengen van de tang naar 1,5 mL buizen met 500 μL koud sorteermedium op ijs om de cellevensvatbaarheid te behouden. Decontaminateer de pincet tussen vissen met 70% ethanol voordat je volgende monsters neemt. Verwerk de schubben van elke vis in aparte buizen tijdens verzameling, dissociatie en voor analyses stroomafwaarts.
  14. Na het verzamelen van schubben wordt de vis onmiddellijk overgebracht naar een terugwinningstank met zoet systeemwater zonder MS-222.
  15. Monitor operculaire bewegingen en zwemgedrag totdat normale ademhaling en houding zijn hersteld. Controleer de biopsieplaats op aanhoudende bloedingen of tekenen van stress voordat de vis teruggebracht wordt naar het circulatiesysteem.
  16. Zet de vis terug in zijn thuisbak nadat het normaal evenwicht en het zwemmen zijn hervat.

4. Celdissociatie en filtering

  1. Controleer de weegschalen onderin de buis. Schubben zijn met het blote oog gemakkelijk zichtbaar voordat ze dissocieren. Dissocieer schubben met een steriele plastic microbuis-stamperhomogenisator door zachte, gecontroleerde handmatige druk toe te passen gedurende 30–60 seconden.
  2. Gebruik langzame rotatie en op-en-neer beweging om epidermiscellen vrij te maken zonder overmatige schuiving van schubben.
  3. Blijf dissociëren totdat de sorteermedia zichtbaar troebel worden.
    OPMERKING: Het succes van de procedure blijkt uit troebel dat het medium troebel wordt, wat wijst op een hoge concentratie vrijgemaakte cellen in suspensie.
  4. Laat gehomogeniseerde monsters door een 35 μm nylon gaasfilter lopen om afval te verwijderen en single-cel suspensies te genereren voor flowcytometrie/fluorescentie-geactiveerde celsortering.
  5. Als er na de initiële filtratie zichtbare celaggregaten aanwezig zijn, haal het monster direct voor de flowcytometrische analyse opnieuw door een nieuw 35 μm gaasfilter. Herhaal de filtratie niet meer dan 2x in totaal om celverlies te minimaliseren.

5. Flowcytometrische analyse

  1. Analyseer monsters met flowcytometrie.
    OPMERKING: Flowcytometrie kan worden uitgevoerd vóór fluorescentie-geactiveerde celsorteerzuivering of RNA-extractie om de samenstelling van het monster te beoordelen.
  2. Analyseer single-cell suspenties met een flowcytometer uitgerust met een 488 nm laser voor GFP-detectie en een 561 nm laser voor mCherry-detectie.
  3. Sluit puin uit met behulp van voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverspreiding (SSC) parameters. Identificeer lymfocyten met behulp van de eerder beschreven lymfocytpoort 10,13,21.
  4. Sluit celaggregaten uit via singlet gating (d.w.z. SSC-area [SSC-A] versus SSC-hoogte [SSC-H]) parameters.
  5. Beoordeel de levensvatbaarheid van cellen met propidiumjodide (PI) of een vergelijkbare levende/dode kleurstof. Sluit PI-positieve cellen uit van latere analyses en sorteerprocedures.
  6. Stel fluorescentiepoorten vast met niet-transgene zebraviscontroles en eenkleurige fluorescerende transgene controles. Definieer GFP-positieve en mCherry-positieve populaties ten opzichte van negatieve controles.
  7. Exporteer flowcytometriestandaardbestanden (FCS) en analyseer data met flow cytometrie-analysesoftware.

6. Fluorescentie-geactiveerde celsortering

  1. Om cellen te sorteren, gebruik je een fluorescentie-geactiveerde celsortering uitgerust met 488 nm en/of 561 nm lasers voor GFP- en mCherry-detectie.
  2. Poort lymphocyten (FSC/SSC), singlets (SSC-A versus SSC-H) en levensvatbare cellen (PI-negatief) sequentieel vóór fluorescentie-gebaseerde sortering.
  3. Definieer GFPlo, GFPhi en mCherry-positieve populaties met behulp van fluorescentiepoorten die zijn vastgesteld uit negatieve controlemonsters.
  4. Sorteer GFPlo, GFPhi en mCherry-positieve populaties in verzamelbuizen met gekoelde sorteermedia.
    OPMERKING: In dit werk met de lck:GFP-lijn zijn hoge GFP (GFPhi) versus lage GFP (GFPlo) cellen verschillende lymfocytenlijnen, zoals eerder beschreven10,13,15,21.
  5. Houd gesorteerde monsters op ijs en ga direct over op latere toepassingen, zoals RNA-isolatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgens bovenstaande stappen hebben we volwassen zebravissen verdoofd en gescreend op fluorescerende lymfocyten of ALL via microscopie. Wildtype (WT) lck:GFP-vissen vertoonden fluorescentie voornamelijk in het thymische gebied, terwijl cd79b:GFP-vissen fluorescentie vertoonden in het kop/kieuwgebied, wat overeenkomt met eerdere waarnemingen10 (Figuur 1A, links). Daarentegen vertoonden dubbel-transgene rag2:hMYC; ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een niet-dodelijke schaalbiopsie voor het verzamelen van zebravis-epidermale lymfocyten, waaronder zowel niet-maligne lymfocyten als acute lymfoblastische leukemie (ALL) cellen. Zebravissen zijn goed gevestigde modellen voor lymfopoëse en lymfoïde maligniteiten, maar de meeste benaderingen om lymfocyten te verkrijgen vereisen euthanasie en weefseldissecties, waardoor longitudinale studies van individuele dierenvoorkomen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen financiële belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Wij danken Ameera Hasan, M.B.B.S., Ph.D., en Brashé Wood voor hun bijdragen aan dit project. De studies werden ondersteund door het OUHSC Stephenson Cancer Center Pilot Grant Program, het Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research (OCASCR), de Presbyterian Health Foundation Team Science and Seed Grant Programs, en de W.J. Jones Family Foundation. FACS door de OUHSC Stephenson Cancer Center Molecular Biology and Cytometry Research Core werd gefinancierd door de NCI Cancer Center Support Grant Award P30 CA225520. Deze studie werd deels ondersteund door fondsen van de American Cancer Society (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC). Iman Owens is een ACS post-baccalaureate "STRONG" programma-scholar.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents & Consumables:
Tricaine methanesulfonate (MS-222)Sigma-AldrichE10521Anesthetisch middel
RPMI 1640 mediumThermoFisher11875093Media voor lymfocytlevensvatbaarheid
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442Voor cellulaire levensvatbaarheid
Penicilline-StreptomycineThermoFisher15140122Bacterie-infectie beperken
70% ethanolThermoScientificT038181000Om forceps te steriliseren
CellPro 1x PBSVWR104027-280Verdunnen tot 0,9x met steriel water
Propidium JodideInvitrogenP1304MMPLive/dode celdiscriminatie voor flow/FACS
Cut Goods Misc-Pn; Grootte: 12 x 12 IN. 35um filterpapier
Lab Pak 03-35/16		SefarVoor celsortering
Referentie: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isoleren van kwaadaardige en niet-kwaadaardige b-cellen uit lck:Egfp-zebravissen. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019).
Alternatief voor filterpapier: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-OneGreiner89508-342Voor celsortering
Eppendorf® Flex-Tubes® Microtubes, 1,5 mlEppendorf®20901-551Microcentrifugebuisje voor celsortering
UltiCare VetRx U-100 Insuline-spuiten 3/10cc 31G x 5/16" Half Unit MarkeringUltiCare9436Voor schaalbiopsieën
100 x 25 mm Diepe Petri-schaalUSA Scientific8609-0625Voor schaalbiopsieën
Bel-Art® WegwerpmortelsBel-Art® BAF199230001Voor schaaldissociatie
E-Z Pik 6-delige pincetsetAven18480EZVoor schaalbiopsieën
Corning® microscoopglazen, aan één kant geëtst, één uiteindeSigma-AldrichCLS294875X25Voor beeldvorming
DekglasjesSigma-AldrichC8181Voor beeldvorming
SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, met DAPIThermoFisherS36920Voor het plaatsen van schalen op een dia
RNeasy Mini Kit Qiagen74104Voor RNA-extractie
Apparatuur:
Nikon AZ100 microscoop en DS-Qi1MC cameraNikonFluorescentiemicroscoop & camera
CFX96 Touch-PCR SysteemBio-Rad3600037
CytoFLEXBeckman-CoulterFlowcytometrie-analyses
Leica SP8LeicaConfocale microscoop
Software:
Kaluza Analysis software versie 2.1Beckman-CoulterFlowcytometrie-analyses
Referentie: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads
LAS-X software versie 3.7.4.23463LeicaConfocale microscoop
Referentie: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/

Referenties

  1. Egawa G, Kabashima K. Skin as a peripheral lymphoid organ: revisiting the concept of skin-associated lymphoid tissues. J Invest Dermatol. 2011;131(11):2178–85.
  2. Matejuk A. Skin immunity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2018;66(1):45–54.
  3. Zhang C, Merana GR, Harris-Tryon T, Scharschmidt TC. Skin immunity: dissecting the complex biology of our body's outer barrier. Mucosal Immunol. 2022;15(4):551–61.
  4. Kupper TS, Fuhlbrigge RC. Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):211–22.
  5. Lafouresse F, Groom JR. A task force against local inflammation and cancer: lymphocyte trafficking to and within the skin. Front Immunol. 2018;9:2454. doi:10.3389/fimmu.2018.02454
  6. Danilova N, Bussmann J, Jekosch K, Steiner LA. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nat Immunol. 2005;6(3):295–302.
  7. Hansen JD, Landis ED, Phillips RB. Discovery of a unique Ig heavy-chain isotype (IgT) in rainbow trout: implications for a distinctive B cell developmental pathway in teleost fish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(19):6919–24.
  8. Page DM, et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 2013;122(8)–e11.
  9. Sunyer JO. Evolutionary and functional relationships of B cells from fish and mammals: insights into their novel roles in phagocytosis and presentation of particulate antigen. Infect Disord Drug Targets. 2012;12(3):200–12.
  10. Park G, et al. Diverse epithelial lymphocytes in zebrafish revealed using a novel scale biopsy method. J Immunol. 2024;213(12):1902–14.
  11. Zhou Q, et al. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023;42(7):112793. doi:10.1016/j.celrep.2023.112793
  12. Robertson TF, et al. A tessellated lymphoid network provides whole-body T cell surveillance in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(20). doi:10.1073/pnas.2301137120
  13. Park G, et al. Zebrafish B cell acute lymphoblastic leukemia: new findings in an old model. Oncotarget. 2020;11(15):1292–305.
  14. Ferrero G, et al. The macrophage-expressed gene (mpeg) 1 identifies a subpopulation of B cells in the adult zebrafish. J Leukoc Biol. 2020;107(3):431–43.
  15. Borga C, et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 2019;33(2):333–47.
  16. Tian Y, et al. The first wave of T lymphopoiesis in zebrafish arises from aorta endothelium independent of hematopoietic stem cells. J Exp Med. 2017;214(11):3347–60.
  17. Liu X, et al. Zebrafish B cell development without a pre-B cell stage, revealed by CD79 fluorescence reporter transgenes. J Immunol. 2017;199(5):1706–15.
  18. Wan F, et al. Characterization of gamma delta T cells from zebrafish provides insights into their important role in adaptive humoral immunity. Front Immunol. 2016;7:675. doi:10.3389/fimmu.2016.00675
  19. Moore FE, et al. Single-cell transcriptional analysis of normal, aberrant, and malignant hematopoiesis in zebrafish. J Exp Med. 2016;213(6):979–92.
  20. Langenau DM, et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(19):7369–74.
  21. Burroughs-Garcia J, et al. Isolating malignant and non-malignant B cells from lck zebrafish. J Vis Exp. 2019;(144):59191. https://www.jove.com/t/59191/isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish
  22. Borga C, et al. Molecularly distinct models of zebrafish Myc-induced B cell leukemia. Leukemia. 2019;33(2):559–62.
  23. Pugach EK, Li P, White R, Zon L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. 2009;(34):1645. https://www.jove.com/t/1645/retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish
  24. Iwasaki M, Kuroda J, Kawakami K, Wada H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 2018;437(2):105–19.
  25. Traver D, et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 2003;4(12):1238–46.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

KankeronderzoekEditie 234Editie 234Lege waardeEditielymfocytALLepithelialeukemieepidermis
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.