Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Cellulaire modellen voor het bestuderen van de ziekte van Alexander: functionele analyse van primaire astrocyten van ratten

108 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72930

⸱

8 september 2026

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University, 2School of Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

In dit artikel

Samenvatting

We ontwikkelen een primair ratastrocytmodel dat een fysiologisch relevant systeem biedt voor het bestuderen van de ziekte van Alexander (AxD), waardoor onderzoek naar GFAP-aggregatie, pathologische modificatie en astrocytdysfunctie mogelijk wordt. Dit systeem slaat een brug tussen in vitro en in vivo studies en biedt een robuust platform om de AxD-pathologie te onderzoeken en therapeutische doelwitten voor neurodegeneratieve ziekten te identificeren.

Samenvatting

Astrocyten spelen een essentiële rol bij het handhaven van de homeostase van het centrale zenuwstelsel, het ondersteunen van de neuronale functie en het reageren op letsel of ziekte. Disfunctie in de astrocytenactiviteit wordt in toenemende mate erkend als een belangrijke bijdrage aan neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder de ziekte van Alexander (AxD), een zeldzame en fatale aandoening veroorzaakt door mutaties in het gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP). Deze mutaties leiden tot GFAP-aggregatie, de vorming van Rosenthal-vezels en progressieve astrocyten-dysfunctie. Hoewel in vivo diermodellen een complexe cellulaire omgeving bieden, kampen zowel de huidige in vitro als in vivo modellen met beperkingen bij het nauwkeurig repliceren van de complexe cellulaire context en functies van astrocyten. Om dit aan te pakken, hebben we een cellulair model ontwikkeld met primaire rattenastrocyten afgeleid van wild-type (WT) en AxD-modelratten om de functionele effecten van GFAP-mutaties te bestuderen. Dit fysiologisch relevante systeem maakt gedetailleerd onderzoek mogelijk naar astrocyten-specifieke mechanismen, waaronder GFAP-aggregatie, reacties op oxidatieve stress en pathologische modificaties. Voor onderzoekers zonder toegang tot AxD-modelratten biedt lentivirale transductie een alternatieve methode om AxD-geassocieerde GFAP-mutaties te introduceren in astrocyten afgeleid van normale ratten, waardoor de toepasbaarheid van deze aanpak wordt vergroot. In vergelijking met geïmmortaliseerde astrocyten-cellijnen of in vitro studies met recombinant eiwit, behouden primaire astrocyten de natuurlijke cellulaire architectuur en moleculaire profielen beter, wat een robuust platform biedt voor het bestuderen van GFAP-dynamiek, oplosbaarheid en astrocytaire reacties op stressoren zoals oxidatieve schade en pathologische modificaties. Dit cellulaire model slaat de brug tussen moleculaire en systemische studies en biedt een gecontroleerd experimenteel kader om astrocyten-dysfunctie bij AxD te onderzoeken. Door bestaande methodologieën aan te vullen, verbeteren primaire astrocytenkweken ons begrip van de AxD-pathologie en vormen ze een waardevol instrument voor het identificeren van potentiële therapeutische targets voor neurodegeneratieve ziekten.

Inleiding

Astrocyten zijn gespecialiseerde gliacellen die zich door het gehele centrale zenuwstelsel (CZS) uitstrekken en een cruciale rol spelen bij het handhaven van de homeostase in de hersenen, het reguleren van de neuronale activiteit en het reageren op letsel of ziekte1. Hun functies omvatten de klaring en recycling van neurotransmitters, de extracellulaire ionen- en waterhomeostase en ondersteuning van de functie van neurale circuits. Door astrocyten uitgescheiden moleculen zijn essentieel voor de ontwikkeling van synapsen en synaptische plasticiteit in de volwassen hersenen2. Als reactie op letsel of ziekte in het CZS ondergaan astrocyten reactieve veranderingen die pro- of anti-inflammatoire signalering kunnen mediëren, wat neuroprotectieve functies mogelijk maakt, maar afhankelijk van de context potentieel kan bijdragen aan CZS-pathologieën3. Dysregulatie van de astrocytenfunctie wordt in toenemende mate erkend als een sleutelfactor bij de gezondheid en ziekte van het CZS4,5.

Gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP), een type III intermediair filament (IF) proteïne, is een belangrijk cytoskeletcomponent van astrocyten en wordt tot expressie gebracht door de meeste, maar niet alle astrocyten. GFAP wordt opgereguleerd als reactie op letsel aan het centraal zenuwstelsel (CZS) en dient als marker voor de ernst van weefselschade6. Hoewel GFAP traditioneel wordt geassocieerd met structurele rollen7, blijven de functionele implicaties hiervan onderbelicht. Mutaties in GFAP veroorzaken de ziekte van Alexander (AxD)8, een zeldzame neurodegeneratieve aandoening die wordt gekenmerkt door GFAP-aggregatie, de vorming van Rosenthal-fibers en progressieve astrocytenfunctiestoornissen. Hoewel in vitro biochemische studies9,10,11 en in vivo diermodellen12,13 inzicht hebben gegeven in de pathologie van AxD, slagen zij er niet in om de complexe cellulaire context van de astrocytenfunctie vast te leggen14.

Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een cellulair model ontwikkeld met primaire ratastrocyten afgeleid van wild-type (WT) en AxD-modelratten13. Dit systeem behoudt de oorspronkelijke cellulaire architectuur en moleculaire profielen van astrocyten, waardoor de studie van GFAP-aggregatie, oxidatieve stressreacties en pathologische modificaties geassocieerd met AxD mogelijk wordt. Voor onderzoekers zonder toegang tot AxD-modelratten biedt lentivirale transductie een alternatieve methode om AxD-geassocieerde GFAP-mutaties te introduceren in astrocyten afgeleid van normale ratten10.

In vergelijking met geïmmortaliseerde cellijnen behouden primaire astrocyten de heterogeniteit en complexiteit van astrocytenpopulaties in vivo, waardoor ze een fysiologisch relevant platform bieden voor het onderzoeken van astrocytspecifieke mechanismen15. In tegenstelling tot in vitro studies met recombinant eiwit9, brengen primaire astrocyten van nature GFAP en andere astrocytspecifieke markers tot expressie, wat de studie van ziekte-geassocieerde varianten binnen een natuurlijke cellulaire omgeving mogelijk maakt10,16,17. Bovendien faciliteren primaire astrocyten onderzoek naar functionele reacties op stressstimuli, zoals oxidatieve schade18 en ontsteking19, die moeilijk te reproduceren zijn in vereenvoudigde in vitro systemen.

In AxD-onderzoek vullen primaire astrocyten biochemische en in vivo benaderingen aan door de kloof tussen moleculaire en systemische studies te overbruggen. Hoewel biochemische assays zich richten op de moleculaire eigenschappen van GFAP-mutaties, ontbreekt het hen aan cellulaire complexiteit, terwijl in vivo modellen systemische effecten vastleggen maar minder geschikt zijn voor mechanistische cellulaire studies. Primaire astrocyten bieden een intermediair systeem met cellulaire complexiteit en experimentele controle, wat aansluit bij huidige trends in onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten die de nadruk leggen op cellulaire modellen om ziekte 않은mechanismen te begrijpen en therapeutische doelwitten te identificeren20.

Dit manuscript presenteert de ontwikkeling en toepassing van primaire ratastrocyten als cellulair model voor AxD-onderzoek. Door een directe vergelijking tussen WT- en AxD-astrocyten mogelijk te maken, pakt deze aanpak belangrijke beperkingen van alternatieve technieken aan en vergroot het de toegankelijkheid via lentivirale transductie. Deze bevindingen dragen bij aan een dieper begrip van astrocytdysfunctie bij AxD en bieden een waardevolle tool voor het bevorderen van therapeutische ontdekkingen bij neurodegeneratieve ziekten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De dieren die in dit protocol zijn gebruikt, werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het College of Life Sciences and Medicine aan de National Tsing Hua University (NTHU IACUC goedkeuringsnr. 109088 en 111060) en in overeenstemming met de richtlijnen van de Agriculture Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Voorbereiding van media, dekglasjes, schaaltjes en platen 

  1. Zorg ervoor dat de volgende oplossingen (Tabel 1) zijn voorbereid en klaar voor gebruik voordat u begint.
  2. Steriliseer scharen en pincetten door middel van autoclaveren voor gebruik om steriliteit te garanderen.
  3. Bereid een poly-L-lysine (PLL)-oplossing voor met een concentratie van 0,02 mg/mL in boorzuurbuffer.
  4. Voeg voldoende PLL-oplossing toe om het oppervlak van het dekglas of de bodem van de kweekschaal/plaat volledig te bedekken. Zorg dat de coating gelijkmatig is.
  5. Laat de met PLL gecoate dekglazen en schalen een nacht incuberen bij kamertemperatuur in een laminaire flowkast.  
  6. Verwijder de volgende dag voorzichtig de PLL-oplossing. Spoel de gecoate dekglazen of schaal/plaat drie keer met vers steriel water om alle resterende PLL te verwijderen.
    OPMERKING: Het is essentieel om de met PLL gecoate kolf/plaat of de dekglazen grondig te spoelen om resterende PLL te verwijderen, aangezien dit de levensvatbaarheid van de cellen negatief kan beïnvloeden. 

2. Voorbereiding van de primaire astrocytenkweek

OPMERKING: Een schematisch overzicht wordt getoond in Figuur 1.

  1. Decapiteer de ratpup van postnatal dag 1–3 na het induceren van hypothermie door de pups op ijs te plaatsen en scheid de kop van het lichaam.
  2. Plaats de kop in een schaal van 60 mm en zet de zijkanten vast met een pincet. Disseceer voorzichtig de huid op de bovenkant van de kop met een fijne schaar.
  3. Maak met een fijne schaar een incisie bij de vertex van de kop om de schedel voorzichtig te openen. Scheid en verwijder voorzichtig de twee helften van de schedel.
  4. Knijp de hersenen met een pincet los van de basis en breng ze over naar een schaal van 60 mm met dissectiemedium.
  5. Plaats elke hemisfeer met het mediale oppervlak naar boven om de midline-structuren bloot te leggen.
  6. Verwijder onder een dissectiemicroscoop voorzichtig de weefsels van de middenhersenen en de hersenstam, zodat de hemisferen met de cortex en hippocampus intact blijven.
  7. Pel de meninges voorzichtig af met een fijn pincet, bij voorkeur als één geheel. Controleer zorgvuldig of er nog meninges in fissuren verborgen zijn en verwijder deze volledig.
  8. Verplaats het gedisseceerde hersenweefsel naar een laminaire flowkast. Aspireer het dissectiemedium met een 1 mL pipette en voeg vers dissectiemedium toe.
  9. Hak het weefsel fijn met een steriel scalpelmesje.
  10. Breng het fijngehakte weefsel over naar 5 mL dissociatiemedium in een 15 mL buis. Incubeer de buis 15 min in een waterbad van 37ºC en schud de buis elke 5 min voorzichtig om een goede interactie tussen enzym en weefsel te waarborgen.
  11. Laat het weefsel na incubatie bezinken op de bodem van de buis. Aspireer het supernatant en voeg 5 mL dissectiemedium toe.
  12. Keer de buis 5 keer om om het weefsel te wassen. Laat de buis 3 min staan zodat het weefsel kan bezinken en herhaal het wasproces vervolgens drie keer met vers dissectiemedium.
  13. Verwijder na de laatste wasbeurt het supernatant en voeg 2,5 mL dissectiemedium en 2,5 mL onderhoudsmedium toe.
  14. Tritureer het weefsel door de oplossing 10–15 keer op en neer te pipetteren met een 10-mL pipette.
  15. Laat de buis 3 min staan zodat het weefsel kan bezinken. Breng het supernatant (bevattend de cellen) over naar een nieuwe conische buis van 50 mL.
  16. Voeg 5 mL MEM-medium toe aan de oorspronkelijke buis met het bezonken weefsel. Tritureer nogmaals 10–15 keer met een 10-mL pipette totdat de meeste klontjes verdwenen zijn.
  17. Filter de celsuspensie door een steriele cellenze van 40 µm in een schone conische buis van 50 mL met 5 mL onderhoudsmedium.
  18. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie 5 min bij 200 × g bij kamertemperatuur.
  19. Verwijder het supernatant en maak de celpellet vervolgens voorzichtig los door tegen de buis te tikken. 
  20. Voeg 5 mL MEM-medium toe en pipetteer 10 keer op en neer om de pellet te resuspenderen. Houd de celsuspensie in een waterbad van 37ºC tijdens het tellen van de cellen.
  21. Verdun 10 μL van de celsuspensie met 90 µL MEM-medium. Meng dit goed met een 200 µL pipetpunt.
  22. Voeg 20 μL van de verdunde celsuspensie toe aan 20 µL trypaanblauw. Tel de cellen met een hemocytometer.
  23. Zaai de cellen als volgt uit in kweekvaten: voor een 24-wells plaat 2 × 10⁵ cellen per well; voor een 6-wells plaat 5 × 10⁵ cellen per well; voor een schaal van 6 cm 1 × 10⁶ cellen per schaal.
  24. Plaats de platen of schalen in een weefselkweekincubator. Vermijd dat de cellen gedurende langere perioden bij kamertemperatuur blijven.
  25. Inspecteer de cellen 4 u na het uitzaaien onder een microscoop om te controleren of ze aan het substraat zijn gehecht.
  26. Vervang 24 u na het uitzaaien het kweekmedium door vers onderhoudsmedium.
  27. Voed de cultuur elke 2–3 dagen door de helft van het medium te vervangen door vers onderhoudsmedium.
  28. Na 7 dagen moeten de cellen een confluentie van ongeveer 80% hebben bereikt en zijn ze klaar voor experimenten.
    OPMERKING: Om optimale condities voor astrocytenkweken te waarborgen, moeten alle stappen in een steriele omgeving worden uitgevoerd, bij voorkeur in een laminaire flowkast, om contaminatie te voorkomen. Zorg er daarnaast voor dat alle reagentia, waar van toepassing, zijn voorverwarmd tot 37°C. Wees nauwkeurig bij het verwijderen van de meninges, aangezien elk overgebleven meningeaal weefsel de kweken kan beïnvloeden. Vermijd bovendien dat de cellen tijdens het uitzaaien en tellen gedurende langere perioden bij kamertemperatuur blijven om de levensvatbaarheid en integriteit van de cellen te behouden.

3. Productie van lentivirale particles en transductie 

OPMERKING: Een schematisch overzicht wordt getoond in Figuur 2.

  1. Zaai HEK293T-cellen uit in een petrischaal van 10 cm2 met vers kweekmedium (Tabel 1).
  2. Kweek de cellen overnacht in een incubator bij 37ºC tot een confluentie van 50%–60% is bereikt.
  3. Voeg aan 1 mL Opti-MEM 20 µg lentiviraal plasmide dat GFAP of varianten daarvan codeert, 5,6 µg packaging-vector en 1,8 µg envelope-vector toe. 
  4. Voeg 45 µL transfectiereagens toe aan de DNA-houdende oplossing.
  5. Meng voorzichtig en incubeer 15 min bij kamertemperatuur.
  6. Voeg de transfectie-oplossing direct toe aan de HEK293T-cellen en incubeer 4 u in een celkweekincubator bij 37°C.
  7. Aspireer de transfectie-oplossing en vervang deze door vers kweekmedium.  
  8. Kweek de cellen nog 2 dagen verder.
  9. Verzamel het supernatant van de celkweek en vervang dit door vers kweekmedium.
  10. Verzamel de volgende dag het supernatant van de celkweek opnieuw en vervang dit door vers kweekmedium.
  11. Verzamel de volgende dag het laatste supernatant van de celkweek.
  12. Combineer de supernatanten uit stappen 3.9–3.11 in een conische buis van 50 mL.
  13. Filtreer het gecombineerde supernatant door een 0,45 µm filter met een spuit van 60 mL om debris te verwijderen.  
  14. Centrifugeer het gefiltreerde supernatant 5 min bij 1.400 × g bij kamertemperatuur om dode cellen te verwijderen.
  15. Breng het geklaarde supernatant over in ultracentrifugebuizen.
  16. Centrifugeer 70 min bij 100.000 × g bij 4°C om de lentivirale deeltjes te pelletteren.
  17. Verwijder voorzichtig het supernatant zonder de pellet onderin de buis te verstoren.
  18. Resuspendeer de pellet in 600 µL Opti-MEM-medium door voorzichtig met een pipet op en neer te zuigen.
  19. Verdeel de geresuspendeerde lentivirale deeltjes in aliquoten van 50 μL en bewaar deze bij -80°C tot gebruik. 
  20. Zaai primaire astrocyten uit in een 6-wells plaat en laat ze een confluentie van 50%–70% bereiken (Sectie 2).
  21. Ontdooi de benodigde hoeveelheden lentivirale deeltjes op ijs.
  22. Voeg 50 µL lentivirale deeltjes toe aan elke well, aangevuld met 8 µg/mL Polybrene.
  23. Schud de plaat voorzichtig rond om een gelijkmatige distributie van het virus en Polybrene te garanderen. Incubeer de cellen 4–8 u in een celkweekincubator bij 37ºC.
  24. Aspireer het virus-houdende medium voorzichtig om te voorkomen dat de cellen worden verstoord.
  25. Vervang het medium door vers kweekmedium en kweek de cellen nog 2–3 dagen verder.
  26. Voer downstream-analyses uit op de getransduceerde cellen met behulp van immunofluorescentiemicroscopie om de vorming van het netwerk van intermediaire filamenten te visualiseren, of immunoblotting om de GFAP-expressie te bepalen.
    OPMERKING: Bij het werken met lentivirale deeltjes is het essentieel om geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) te gebruiken om de veiligheid te waarborgen. Vermijd daarnaast herhaalde vries-dooi-cycli om de integriteit van de virale deeltjes te behouden.

4. Immunofluorescentiemicroscopie 

  1. Aspire voorzichtig het kweekmedium uit de wells die dekglasjes bevatten met geplaatste cellen. Vermijd het verstoren van de cellen.
  2. Fixeer de cellen door een van de volgende fixeeroplossingen toe te voegen: gebruik voor primaire astrocyten 3,2% (wt/vol) paraformaldehyde; gebruik voor astrocyten-neuronenkweken 3,2% (wt/vol) paraformaldehyde en 4% (wt/vol) sucrose.
  3. Incubeer de dekglasjes 15 min in het fixeer middel bij kamertemperatuur. Tenzij anders vermeld, worden alle volgende stappen bij kamertemperatuur uitgevoerd. 
  4. Spoel de gefixeerde cellen drie keer af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om het fixeer middel te verwijderen.
  5. Permeabiliseer de cellen door ze 15 min te incuberen in 0,2% (vol/vol) Triton X-100 bereid in blokkeringsbuffer (5% (vol/vol) normaal geiten serum in PBS). 
  6. Spoel de permeabiliseerde cellen drie keer af met PBS.
  7. Bereid de primaire antilichaamoplossing door het antilichaam te verdunnen in blokkeringsbuffer volgens de door de fabrikant aanbevolen concentratie.
  8. Incubeer de dekglasjes gedurende ten minste 1 h bij kamertemperatuur in de primaire antilichaamoplossing.
  9. Spoel de dekglasjes drie keer af met PBS om ongebonden primair antilichaam te verwijderen.
  10. Bereid de secundaire antilichaamoplossing door geiten anti-muis en geiten anti-konijn secundaire antilichamen geconjugeerd aan fluoroforen in blokkeringsbuffer te verdunnen in een verdunning van 1:500.  
  11. Incubeer de dekglasjes 1 h bij kamertemperatuur in de secundaire antilichaamoplossing.
  12. Spoel de dekglasjes drie keer af met PBS om ongebonden secundair antilichaam te verwijderen.
  13. Breng de dekglasjes voorzichtig met een pincet over op objectglazen.
  14. Monteer de dekglasjes met een monteermedium om de fluorescentie te behouden.
  15. Verzegel voorzichtig de randen van het dekglasje met transparante nagellak om verschuiving en verdamping te voorkomen.
  16. Laat de nagellak volledig drogen voordat u overgaat tot beeldvorming.
  17. De bereide preparaten zijn klaar voor beeldvorming met een immunofluorescentie- of confocale microscoop.
    OPMERKING: Om het succes van de experimenten te garanderen, moeten alle reagentia, zoals PBS, blokkeringsbuffer en antilichamen, vers worden bereid en moet de steriliteit worden bewaard. Behandel de dekglasjes zorgvuldig om beschadiging van de cellen of krassen op het glasoppervlak te voorkomen. Bescherm de monsters tegen licht tijdens de incubatie van antilichamen en na de montage om fotobleaching van fluorescentiesignalen te voorkomen. Optimaliseer daarnaast de antilichaamconcentraties en incubatietijden volgens de specifieke experimentele opzet.

5. Immunoblotting

  1. Spoel de astrocyten twee keer met PBS om resterend medium en debris te verwijderen.
  2. Plaats de plaat of schaal op ijs om proteïnedegradatie te minimaliseren. Aspireer de PBS volledig, waarbij één well per keer wordt behandeld.
  3. Voeg ijskoud radioimmunoprecipitatie-assay (RIPA) buffer toe die protease- en fosfataseremmers bevat. Voeg voor een 6-wells plaat 250 µL per well toe; voor een schaal van 6 cm 500 µL per schaal.
  4. Gebruik een celschraper om alle astrocyten grondig in de RIPA buffer te schrapen (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (wt/vol) NP-40, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0,5% (wt/vol) natriumdeoxycholaat en 0,1% (wt/vol) SDS, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride [PMSF]).
  5. Breng de geschrapte cellen over naar een 1-mL Dounce homogenisator die op ijs is geplaatst. Homogeniseer de cellen door ze voorzichtig met de stamper te vermalen.
  6. Incubeer de gehomogeniseerde cellysaten 10 min op ijs om volledige lyse te garanderen. Bewaar 20 µL van de totale lysaten om de proteïneconcentratie te bepalen via een bicinchoninezuur (BCA) assay.
  7. Centrifugeer de cellysaten bij 13.500 × g bij 4ºC gedurende 10 min om onoplosbare proteïnen te pelletteren.
  8. Breng het supernatant voorzichtig over naar een schone buis. Bewaar 20 µL supernatant om de proteïneconcentratie via de BCA assay te bepalen.
  9. Concentreer het supernatant door middel van methanol/chloroform-precipitatie.
  10. Resuspendeer het resulterende precipitaat in 0,1 mL Laemmli monsterbuffer (25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 1% (w/v) SDS, 12,5% (v/v) glycerol, 0,01% (w/v) bromfenolblauw, 355 mM β-mercaptoethanol).
  11. Resuspendeer de pellet in Laemmli monsterbuffer en dispergeer deze door sonicatie. 
  12. Voer drie cycli sonicatie uit met pulsen van 0,5 s bij 10% vermogen. Houd de tip van de probe naar de bodem van de buis gericht om schuimvorming te voorkomen.
  13. Voer een bicinchoninezuur (BCA) proteïne-assay uit op zowel het RIPA-supernatant als de totale cellysaten. 
  14. Laad de proteínemonsters op een 12% of 15% natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) gel. Run de gel bij een constant voltage van 200 V gedurende 45 min.
  15. Transfer de proteïnen van de gel naar een nitrocellulosemembraan met gebruik van een wet transfer systeem. Volg de instructies van de fabrikant en transfer bij 100 V gedurende 70 min.
  16. Plaats het membraan in 5% (wt/vol) runderseerumeiwit (BSA) opgelost in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% (wt/vol) Tween-20 (TBST). Block gedurende ten minste 1 u bij kamertemperatuur onder voorzichtig schudden.
  17. Verdun de primaire antilichamen in TBST volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer het membraan in de primaire antilichaamoplossing overnight bij 4ºC onder voorzichtig schudden.
  18. Spoel het membraan drie keer met TBST, waarbij elke wasbeurt 5 min duurt.
  19. Verdun fluorofoor- of mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen in TBST in een verdunning van 1:500 (of zoals gespecificeerd door de fabrikant).
  20. Incubeer het membraan in de secundaire antilichaamoplossing gedurende 1 u bij kamertemperatuur onder voorzichtig schudden.
  21. Spoel het membraan drie keer met TBST, waarbij elke wasbeurt 5 min duurt.
  22. Ontwikkel het membraan met fluorescentie of verbeterde chemiluminescentie (ECL) volgens de instructies van de fabrikant.
  23. Visualiseer de proteïnebanden met een imaging-systeem.
    OPMERKING: Om proteïnedegradatie te voorkomen, moeten alle stappen op ijs of bij 4ºC worden uitgevoerd, behalve de antilichaamincubatie en de blocking-stappen. Zorg ervoor dat alle buffers, reagentia en apparatuur vooraf zijn gekoeld om lage temperaturen tijdens het gehele proces te behouden. Voorkom overbelading van de gel om vegen (smearing) te vermijden, en optimaliseer de antilichaamconcentraties en incubatietijden passend bij het specifieke experiment.

6. Preparatie van primaire neuronen voor cocultuur

  1. Euthanaseer de drachtige rat met koolstofdioxide als inhalatieanesthesie. Dissekeer de uterus en plaats deze in een steriele Petrischaal.
  2. Verwijder de hersenen uit de foetussen en plaats deze in een schaal van 6 cm met dissectie-oplossing. Zorg ervoor dat het weefsel te allen tijde ondergedompeld blijft in de oplossing om uitdroging te voorkomen.
  3. Dissekeer de cortices en verwijder de meninges zoals beschreven (stap 2.7).
  4. Verplaats het gedissecteerde weefsel naar een laminaire flowkast.
  5. Aspireer de dissectie-oplossing met een 1 mL pipette en voeg verse dissectie-oplossing toe aan de schaal.  
  6. Snijd het hersenweefsel in kleine stukjes met een steriel scalpelmesje.
  7. Overbreng het fijngehakte weefsel naar 5 mL neuronale dissociatiemedium (Tabel 1), voorverwarmd tot 37 ºC in een 15 mL buis.
  8. Incubeer de buis bij 37°C ºC waterbad gedurende 30 min, waarbij de buis elke 5 min voorzichtig wordt geschud om een goede interactie tussen enzym en weefsel te waarborgen. 
  9. Haal de buis uit het waterbad en laat het weefsel naar de bodem van de buis zakken. Aspireer voorzichtig het supernatant met een 1 mL pipetpunt zonder het weefsel te verstoren.
  10. Voeg 5 mL voorverwarmde dissectieoplossing toe aan de buis en keer deze 5 keer om om het weefsel te spoelen. Laat de buis 3 min staan zodat het weefsel kan bezinken en herhaal het wasproces vervolgens drie keer, waarbij elke keer verse dissectieoplossing wordt gebruikt.
  11. Verwijder na de laatste wasbeurt het supernatant en voeg 2,5 mL dissectie-oplossing en 2,5 mL platingmedium toe.
  12. Tritureer het weefsel door de oplossing 10–15 keer op en neer te pipetteren met een 10-ml pipette.
  13. Laat de buis 3 minuten staan zodat het weefsel kan bezinken. Breng het supernatant (bevattende cellen) over naar een nieuwe conische buis van 50 mL.
  14. Voeg 5 mL platingmedium toe aan de oorspronkelijke buis met het bezonken weefsel. 
  15. Tritureer het weefsel opnieuw 10–15 keer met een 10-ml pipet totdat de meeste klompen zijn verdwenen.
  16. Filter de celсусpensie door een steriele 40 µm celzeef in een schone 50 mL conische buis met 5 mL kweekmedium.
  17. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie bij 200 × gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  18. Verwijder het supernatant en maak het celpellet vervolgens voorzichtig los door op de buis te tikken. Voeg 5 mL voorverwarmd plaatmedium toe en pipetteer dit 10 keer op en neer om het pellet te resuspenderen.
  19. Tel de cellen zoals eerder beschreven (stappen 2.21 en 2.22). Bewaar de celsuspensie in een 37°C waterbad tijdens het tellen van cellen.
  20. Zaai de neuronen als volgt direct bovenop de primaire astrocyten in de kweekvaten: voor een 24-wells plaat, zaai 1,45 × 105 cellen per putje; zaai voor een 6-wells plaat 5 × 105 cellen per well; zaai voor een schaal van 6 cm 1 × 106 cellen per putje.
  21. Plaats de platen of schalen in een weefselkweekincubator die is ingesteld op 37°C.ºC met 5% CO₂Vermijd het langdurig laten staan van de cellen bij kamertemperatuur om de levensvatbaarheid te behouden.
  22. Vervang het uitzaaimedium 4 uur na het uitzaaien door neuronaal onderhoudsmedium.
  23. Vervang elke 3–4 dagen de helft van het medium door vers onderhoudsmedium voor neuronen.
    OPMERKING: De gecocultureerde neuronen zullen klaar zijn voor experimenten op 7–10 dagen in vitro (DIV).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een morfologisch overzicht van primaire astrocytenkweken op verschillende tijdstippen na isolatie wordt gepresenteerd in Figuur 3. Na het uitplaten van de corticale celsuspensie hechten sommige astrocyten binnen de eerste 24 u aan het oppervlak van de kweekschaal (Figuur 3A). Gedurende de eerste 3 tot 5 dagen bevatten de kweken celresten en stervende neuronen (Figuur 3B), aangezien het kweekmedium is geoptimaliseerd om het overleven...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Primaire astrocytenkweken hebben ons begrip van de rol van astrocyten bij gezondheid en ziekte aanzienlijk vergroot. Voortbouwend op het fundamentele werk van McCarthy en de Vellis21, zijn deze kweken essentieel voor het bestuderen van AxD, omdat ze een gedetailleerde exploratie van astrocytenspecifieke processen mogelijk maken, in het bijzonder de effecten van AxD-mutaties op de assemblage van GFAP en de vorming van aggregaten.

De succesvolle isolatie en kweek van prim...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te melden.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. Tracy Hagemann (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) voor het leveren van de R237H knock-in ratten. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science and Technology Council (111-2320-B-007-008 en 112-2320-B-007-006 aan N.-H. L. en M.-D.P.). De auteurs zijn dankbaar voor de ondersteuning van de confocal imaging core aan de National Tsing Hua University, Taiwan, die wordt gefinancierd door de National Science and Technology Council (NSTC-114-2740-M-007-001). Wij danken tevens het Instrument Center van de National Tsing Hua University voor de toegang tot de elektronenmicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 M HEPES, pH 7.4 Gibco15630-080
100× penicilline-streptomycine  Gibco15140-122
10× Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14180-046
2,5% TrypsineGibco15090046
30% Acrylamide/Bis-oplossing 37,5:1Biorad1610158
anti-GFAP-antilichaamCell Signaling Technology12389
anti-human GFAP-antilichaamBiolegend837202Kloon SMI21
anti-panGFAP-antilichaamAgilentGA524
anti-ubiquitine-antilichaamMilliporeST 1200Kloon FK2
anti-vimentine-antilichaamSigma-AldrichV6389Kloon V9
anti-β III tubuline-antilichaamBiolegend801201
B27-supplementGibco17504044
Calciumchloride (CaCl2)Arcos34961
Reagentia voor celkweek
ChemiDoc Imaging SystemBioRadNA
Coomassie blauwe kleurstofUSB32826
CysteïneSigma-AldrichC1276
Dithiothreitol (DTT)URDTT
DNase I Sigma-AldrichD5025
Dounce-homogenisatorWheaton
Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-013-CM
Endotoxine-vrije plasmid DNA-preparatiekit Qiagen12943
Enhanced chemiluminescent (ECL) reagensPerkinElmerNEL 105001
Ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA)USB15699
Foetaal runderserum  GibcoA5209401
GlucoseSigma-AldrichG8270
GlutaMaxGibco35050-061
Minimal essential medium (MEM)Corning10-010-CVR
NaClHoneywell31434S
Neurobasal-mediumGibco21103049
Optima XE-90 ultracentrifugeBeckmanNA
PapaïneWorthingtonLS003126
Fenylmethylesulfonylfluoride (PMSF)ACROS ORGANICS215740050
PolyethyleenimineSigma-AldrichP3143
Poly-L-lysineSigma-AldrichP6516
Kaliumchloride (KCl)Honeywell12636
Rhodamine anti-actine-antilichaamBioRad12004164
Natriumdodecylsulfaat (SDS)USB75819
NatriumpyruvaatGibco11360070
StarBright Blue 520 geit anti-muis IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 geit anti-konijn IgG BioRad12004161
SucroseSigma-AldrichS5391
SW-28 rotorBeckmanNA
TansIT-LT1 transfectiereagensMirusMR-MIR-2300
TEMEDUSB76320
Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)USB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148

Referenties

  1. Verkhratsky A, Nedergaard M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 2018;98(1):239-389.
  2. Eroglu C, Barres BA. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 2010;468(7321):223-31.
  3. Sofroniew MV. Astrogliosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2014;7(2):a020420.
  4. Sofroniew MV, Vinters HV. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 2010;119(1):7-35.
  5. Brandebura AN, Paumier A, Onur TS, Allen NJ. Astrocyte contribution to dysfunction, risk and progression in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurosci. 2023;24(1):23-39.
  6. Sofroniew MV. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 2009;32(12):638-47.
  7. Hol EM, Pekny M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 2015;32:121-30.
  8. Brenner M, et al. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nat Genet. 2001;27(1):117-20.
  9. Lin NH, Jian WS, Perng MD. Deletions in glial fibrillary acidic protein leading to alterations in intermediate filament assembly and network formation. Int J Mol Sci. 2025;26(5):1913.
  10. Yang AW, et al. Effects of Alexander disease-associated mutations on the assembly and organization of GFAP intermediate filaments. Mol Biol Cell. 2022;33(8):ar69.
  11. Lin NH, Perng MD. Experimental approaches for biochemical analysis of glial fibrillary acidic protein and its disease-associated variants. J Vis Exp. 2025;(225).
  12. Hagemann TL, Connor JX, Messing A. Alexander disease-associated glial fibrillary acidic protein mutations in mice induce Rosenthal fiber formation and a white matter stress response. J Neurosci. 2006;26(43):11162-73.
  13. Hagemann TL, et al. Antisense therapy in a rat model of Alexander disease reverses GFAP pathology, white matter deficits, and motor impairment. Sci Transl Med. 2021;13(620):eabg4711.
  14. Hagemann TL. Alexander disease: models, mechanisms, and medicine. Curr Opin Neurobiol. 2022;72:140-7.
  15. Lange SC, et al. Primary cultures of astrocytes: their value in understanding astrocytes in health and disease. Neurochem Res. 2012;37(11):2569-88.
  16. Lin NH, Yang AW, Chang CH, Perng MD. Elevated GFAP isoform expression promotes protein aggregation and compromises astrocyte function. FASEB J. 2021;35(5):e21614.
  17. Lin NH, Jian WS, Snider N, Perng MD. Glial fibrillary acidic protein is pathologically modified in Alexander disease. J Biol Chem. 2024;300(7):107402.
  18. Goya-Iglesias N, et al. Alexander disease mutations differentially sensitize glial fibrillary acidic protein (GFAP) to posttranslational modifications and network disruption by oxidants. Redox Biol. 2026;92:104103.
  19. Olabarria M, Putilina M, Riemer EC, Goldman JE. Astrocyte pathology in Alexander disease causes a marked inflammatory environment. Acta Neuropathol. 2015;130(4):469-86.
  20. Lee HG, Wheeler MA, Quintana FJ. Function and therapeutic value of astrocytes in neurological diseases. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(5):339-58.
  21. McCarthy KD, de Vellis J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 1980;85(3):890-902.
  22. Olsen ML, et al. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 2006;53(5):516-28.
  23. Strack A, et al. Chemokines are differentially expressed by astrocytes, microglia and inflammatory leukocytes in Toxoplasma encephalitis and critically regulated by interferon-gamma. Acta Neuropathol. 2002;103(5):458-68.
  24. East E, Golding JP, Phillips JB. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. J Tissue Eng Regen Med. 2009;3(8):634-46.
  25. Zhang Y, Barres BA. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 2010;20(5):588-94.
  26. Oberheim NA, Goldman SA, Nedergaard M. Heterogeneity of astrocytic form and function. Methods Mol Biol. 2012;814:23-45.
  27. Vasile F, Dossi E, Rouach N. Human astrocytes: structure and functions in the healthy brain. Brain Struct Funct. 2017;222(5):2017-29.
  28. Oberheim NA, et al. Uniquely hominid features of adult human astrocytes. J Neurosci. 2009;29(10):3276-87.
  29. Peterson IL, et al. Isolation and monoculture of functional primary astrocytes from the adult mouse spinal cord. Front Neurosci. 2024;18:1367473.
  30. Agalave NM, et al. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 2020;340:108742.
  31. Du F, et al. Purity, cell viability, expression of GFAP and bystin in astrocytes cultured by different procedures. J Cell Biochem. 2010;109(1):30-7.
  32. Lin NH, et al. The role of gigaxonin in the degradation of the glial-specific intermediate filament protein GFAP. Mol Biol Cell. 2016;27(25):3980-90.
  33. Lin NH, Perng MD. Synergistic effects of glial fibrillary acidic protein mutation and overexpression in the pathogenesis of Alexander disease. Int J Mol Sci. 2026;27(10).
  34. Perng M, et al. The Alexander disease-causing glial fibrillary acidic protein mutant, R416W, accumulates into Rosenthal fibers by a pathway that involves filament aggregation and the association of alpha B-crystallin and HSP27. Am J Hum Genet. 2006;79(2):197-213.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

GFAP-mutatiesastrocyten-dysfunctieoxidatieve stressRosenthal-vezelslentivirale transductieastrocytenkweekneurodegeneratieve ziekte

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.