Methodenartikel

Neutrofielen Isolatie Protocol

DOI:

10.3791/745

⸱

23 juli 2008

 ,  , 
1Institute for Medicine and Engineering, University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofielen behoren tot de eerste cellen aan te komen op de site van inflammatoire immuunrespons, en hun functies en mechanismen zijn uitgebreid bestudeerd in vitro. Demonstreren we een standaard dichtheidsgradiënt scheidingsmethode voor de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met in de handel verkrijgbaar scheiding media.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofiele granulocyten polymorfonucleaire (PMN) zijn de meest voorkomende leukocyten bij mensen en bij de eerste cellen aan te komen op de site van inflammatoire immuunrespons. Vanwege hun belangrijke rol in ontstekingen, zijn neutrofielen functies zoals motoriek, cytokine productie, fagocytose, en de tumorcel te bestrijden uitgebreid bestudeerd. Te bepalen wat de specifieke functies van neutrofielen, een schone, snelle en betrouwbare methode om ze te scheiden van andere bloedcellen is wenselijk voor in-vitro-studies, vooral omdat neutrofielen zijn van korte duur en moet worden gebruikt binnen 2-4 uur van de collectie. Hier tonen we een standaard dichtheidsgradiënt scheidingsmethode voor de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met in de handel verkrijgbaar scheiding media dat is een mengsel van natrium-metrizoate en Dextran 500. De procedure bestaat uit lagen volbloed op de dichtheidsgradiënt medium, centrifugeren, scheiding van neutrofielen laag, en lysis van erytrocyten rest. Cellen worden vervolgens gewassen, geteld, en opnieuw gesuspendeerd in buffer tot de gewenste concentratie. Bij het correct wordt uitgevoerd, is deze methode is aangetoond dat monsters van> 95% neutrofielen met> 95% levensvatbaarheid opbrengst.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofielen Isolatie Protocol

  1. Breng alle reagentia op kamertemperatuur.
  2. Verzamel 5,0 ml van neutrofielen isolatie media in centrifugebuis. Voorzichtig laagje 5,0 ml bloed over de scheiding media. Voer deze stap langzaam en voorzichtig, en met de pipet tip dicht bij de oppervlakte van de media om te voorkomen dat het mengen van het bloed en de media.
  3. Centrifugeer op 500 RCF gedurende 35 min bij 20-25 ° C. Het bloed op moet scheiden in 6 verschillende bands: plasma, monocyten, isolatie media, neutrofielen, meer isolatie media, en de rode bloedcellen pellet (figuur 1). Als deze banden niet duidelijk zijn, was het scheidingsproces niet schoon en zal moeten worden herhaald.
  4. Verwijder voorzichtig de bovenste drie lagen (plasma, monocyten en isolatie media) met een pipet. Bied deze lagen.
  5. Voorzichtig pipet de laag van neutrofielen en alle media de isolatie onder de neutrofielen. Plaats de oplossing in een schone centrifugebuis.
  6. Verdun de neutrofiel oplossing tot 10 ml met HBSS zonder Ca 2 + / Mg 2 +. Omkeren van de buis een paar keer om de cellen te schorten.
  7. Centrifugeer de neutrofiele oplossing bij 350 RCF gedurende 10 minuten. Een rode pellet moet aanwezig zijn bij de bodem van de buis, met neutrofielen en resterende rode bloedcellen (RBC). Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet voorzichtig, zodat de pellet niet wordt verstoord.
  8. Om lyse de resterende rode bloedcellen, voeg 2 ml Red Cell Lysis Buffer naar de buis. Om resuspendeer de pellet, vortex de flacon in een instelling van 3-4. Voorkomen dat de vortex instelling boven de 4, omdat dit kan leiden tot de neutrofielen te activeren. Het kan nodig zijn om vortex te zijn voor enkele seconden, of naar "Pulse" van de vortex naar de pellet te ontbinden.
  9. Centrifugeer de buis bij 250 RCF gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet. Herhaal het lyserende proces indien nodig.
  10. Voeg 500 ul HBSS zonder Ca 2 + / Mg 2 + aan elke buis. Nogmaals, vortex naar de pellet opnieuw in suspensie in een instelling van 3-4. Verdunnen tot 10 ml met HBSS zonder Ca 2 + / Mg 2 +.
  11. Centrifugeer de buizen op 250 RCF gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant af en gooi.
  12. Resuspendeer de pellet in 250 ul HBSS / HSA Oplossing (2% HSA). Cellen kunnen dan worden geteld en aangepast aan de gewenste concentratie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dichtheid gradiënt scheiding methode wordt gebruikt om de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met een mengsel van natrium-metrizoate en Dextran 500. Deze methode is gebaseerd op de mononucleaire leukocyten scheiding methode Boyum (1968), die was voor neutrofielen scheiding gewijzigd door Ferrante en Thong (1980).

Na het verzamelen van een donor, kan volledig bloed worden antistolling met EDTA, citraat of heparine. Omdat ze van korte duur, moet neutrofielen worden gebruikt binnen 2-4 uur van de collectie. De procedure be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De financiering van NIH R01 HL56621.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Lymphocyte Poly(R)ReagensCedarlane LabsPolymorphprepTM kan als alternatief worden gebruikt
Hank’s gebalanceerde zoutoplossing zonder calciumchlorideReagensInvitrogen
Humaan serumalbumineReagensZLB Bioplasma
Rode bloedcel lysisbufferReagensRoche Group
CentrifugeInstrument
VortexmixerInstrument
Pasteurpipetten en zuigballonInstrument
PolymorphprepTMReagensAxis-ShieldAlternatief reagens voor Lymphocyte-Poly (R)
SpuitfilterOverigEMD MilliporeSLGV033RSMillex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-steriliseerbaar
Hank’s gebalanceerde zoutoplossing met calciumchlorideReagensInvitrogen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dichtheidsgradi ntscheidingCentrifugatie van volbloedLyse van rode bloedcellenBereiding van HBSS oplossingHumaan serumalbumineBeoordeling van de levensvatbaarheid van neutrofielenProtocol voor het wassen van cellenBediening van de centrifugeVerwerking van bloedmonsters

Gerelateerde artikelen