Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen door toepassing van fluor-Gold op het oppervlak van Superior colliculus

Samenvatting

Deze video beschrijft de methode van retrograde etikettering van RGC door het toepassen van fluoro-goud (FG) op het oppervlak van superieure colliculus (SC). Techniek omvat het boren van de schedel, opzuigen van de cortex, en het toepassen van gelatine spons over de gehele dorsale oppervlak van de SC.

Samenvatting

Retinale ganglion cel (RGC) tellen is essentieel om retinadegeneratie evalueren vooral in glaucoom. Betrouwbare RGC etikettering is fundamenteel voor het evalueren van de effecten van een eventuele behandeling. In de rat, is ongeveer 98% van RGC waarvan bekend is dat het project aan de contralaterale superieure colliculus (SC) (Forrester en Peters, 1967). Het toepassen van fluoro-goud (FG) op het oppervlak van SC kan label bijna alle RGC, zodat we kunnen op deze meest kwetsbare netvlies neuron focus in glaucoom. FG wordt ingenomen door het axon terminals van retinale ganglioncellen en bilateraal retrogradely getransporteerd naar de SOMA in het netvlies. Vergelijk met retrograde etikettering van RGC Door FG op stronk van doorsneden oogzenuw voor 2 dagen, is de interferentie van RGC overleven geminimaliseerd. Vergelijk met cresyl violet vlekken die vlekken RGC, amacrine cellen en endotheel van het bloedvat in de retinale ganglion cel laag, deze labeling methode is meer specifiek voor de RGC. Deze video beschrijft de methode van retrograde etikettering van RGC door het toepassen van FG op het oppervlak van SC. De chirurgische procedures omvatten het boren van de schedel, aspiratie van de cortex naar de SC bloot te leggen en het toepassen van gelatine spons over de gehele dorsale oppervlak van SC worden getoond. Nuttige tips voor het vermijden van grote intracraniële bloeden en aspiratie van de SC zijn gegeven.

Protocol

1. Verdoof de rat door intraperitoneale injectie van ketamine (80mg/kg) en xylazine (8mg/kg) (volume ratio 2:1). Breng een steriel glijmiddel oog zalf om uitdroging te voorkomen van het hoornvlies tijdens de operatie.
2. Scheer het hoofd bont (van oog tot het oor-niveau) en bevestig de kop op de kop stadium door een hoofd klem en zijn snijtanden in de snijtand bar.
3. Gedesinfecteerd de operatie gebied met 10% povidonjood-oplossing, gevolgd door 70% alcohol.
4. Snijd de huid en de spieren om de schedel en de hechtingen (sagittale, coronale en dwarse naden) (Figuur 1) bloot te leggen. Van toepassing zijn pijnstillende, bupivicaine als een splash om incisiegebied (niet tot 2 mg / kg bedraagt).
5. Boor een gat schedel (ø 2x2 mm, 0,5 mm van zowel de sagittale en transversale hechtingen) aan elke kant van pijlnaad. Vermijd breuk van hersenvliezen en de sinus ligt onder de hechtingen.
   
   
   Figuur 1. Kenmerken van levend rat schedel.
   
   
6. Opengesneden de hersenvliezen in het voorjaar een schaar, niet scheurt.
7. Zuig het cerebrale inhoud die ligt over het dorsale oppervlak van de superieure colliculus zorgvuldig door de vacuümpomp en drie check-points kan worden waargenomen:
   1. de kleur van hersenweefsel verandert van grijs naar wit naar grijs
   2. stop opzuigen als de kleurloze hersenvocht naar buiten komen
   3. zorgvuldig vergroten van de laagste zuigkracht horizontaal naar de geelachtige superieure colliculus gedekt door de dura bloot
8. Aspireren de hersenen inhoud via SC tot vier randen van SC kan worden waargenomen direct onder de microscoop. Het deel van de verwijderde hersenschors moet worden beperkt tot minimum aan ongewenste neveneffecten (bijv., motorische stoornissen) te vermijden. Wees voorzichtig dat u de sinus te raken.
9. Absorberen de vloeistof in het gat met fijne steriele katoenen streep om het oppervlak van de SC zo droog mogelijk. Plaats dan een dun laagje gelatine spons pre-doorweekt met 6% Fluoro-Gold aan het oppervlak van SC (FG wordt ingenomen door het axon terminals van retinale ganglioncellen en bilateraal retrogradely getransporteerd naar de SOMA in het netvlies).
10. Vul het gat met gelfoam en sluit de huid wond met hechtdraad clips.
11. De dieren werden toegelaten om te herstellen onder gloeilamp warm te houden. Pijnstillende, buprenorfine (100mcg/kg), wordt oraal toegepast in het drinkwater gedurende 5 dagen na SC etikettering.

Discussie

1. Waarom gebruik maken van deze chirurgische methode om retinale ganglion cellen?
   
   In de rat ongeveer 98% van retinale ganglioncellen (RGC) is bekend dat het project aan de contralaterale superieure colliculus (SC). Toepassing van fluor-goud op het oppervlak van SC kan bijna alle label van het RGC, zodat we kunnen op deze meest kwetsbare netvlies neuron focus in glaucoom. Vergelijk met retrograde etikettering van RGC Door FG op stronk van doorsneden oogzenuw voor 2 dagen, is de interferentie van RGC overleven geminimaliseerd....