Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Samenvatting

Deze video demonstreert de techniek van micro-injectie in de gonaden van C. elegans om transgene dieren te creëren.

Samenvatting

Transgene Caenorhabditis elegans gemakkelijk kan worden aangemaakt via micro-injectie van een DNA-plasmide oplossing in de gonaden ^1. Het plasmide DNA herschikt te vormen extrachromosomaal concatameren die stabiel zijn geërfd echter niet met dezelfde efficiëntie als de werkelijke chromosomen ^2. Een gen van belang is co-geïnjecteerd met een duidelijke fenotypische marker, zoals rol-6 of GFP, om de selectie van transgene dieren mogelijk maken onder een microscoop dissectie. De exogene gen kan worden uitgedrukt van zijn eigen promotor voor cellulaire lokalisatie studies. Als alternatief kan het transgen worden aangedreven door een ander weefsel-specifieke promotor om de rol van het gen product in die bepaalde cel of weefsel te beoordelen. Deze techniek drijft efficiënte genexpressie in alle weefsels van C. elegans, behalve voor de geslachtscellen of vroege embryo ^3. Creatie van transgene dieren wordt op grote schaal gebruikt voor een scala aan experimentele paradigma's. Deze video toont de micro-injectie procedure om transgene wormen genereren. Bovendien is selectie en het behoud van stabiele transgene C. elegans lijnen beschreven.

Protocol

Expressieplasmide Bouw

Twee plasmiden zijn nodig: een voor weefsel-specifieke expressie van het gen van interesse en een tweede als selecteerbare transformatie marker.

Experimentele Plasmide

1. Selecteer een promotor die wordt uitgedrukt in de weefsels / cellen soort belang, bijvoorbeeld, een zenuw of spier-specifieke promoter. Als men is om meerdere genen tot expressie in hetzelfde weefsel, kan een promotor cassette plasmide in het Gateway-systeem (Invitrogen) worden gebruikt. Deze aanpak maakt het inbrengen van een gen van belang stroomafwaarts van de promotor door recombinationele klonen ^{4. In het} algemeen, 2-5 kb van de upstream-sequenties voldoende is om correcte en nauwkeurige uitdrukking hebben.
   
   
2. Het cDNA van het gen van belang gekloond kunnen worden op twee manieren:
   1. Conventionele klonen met behulp van restrictie-enzymen.
   2. Voor het klonen van Gateway, is het PCR geamplificeerd met behulp van primers die de gateway att B recombinationele volgorde bevatten. De versterkte cDNA wordt eerst gerecombineerd in de donor vector pDONR201 om de invoer vector te maken en daarna getransformeerd in E. coli stam DH5a. Volgende selectie van succesvolle recombinanten en mini-prep isolatie van DNA, wordt het item vector gerecombineerde in de promotor-bevattende bestemming vector het maken van de expressieplasmide. Details over recombinationele klonen zijn verkrijgbaar bij zowel de Invitrogen Gateway handleiding of in Caldwell et al.. ^5.

Selecteerbare Marker Plasmide

Voorbeelden van transgene marker plasmiden zijn rol-6 of het gebruik van het lichaam muur spier promotor unc-54 tot en met fluorescerende eiwit expressie rijden. Deze marker plasmiden zijn meestal beschikbaar vanuit de onderzoeksgemeenschap op aanvraag.

Micro-injectie van C. elegans

Voorbereiding

1. Een DNA-isolatie van de twee plasmiden die moeten worden geïnjecteerd. Kwantificeren en meng ze samen in een 1:1 verhouding van 50 ng / ul per stuk.
   
   
2. Bereid agar pads:
   1. Maak een 2% agarose-oplossing in water, hitte of in de magnetron totdat het is opgelost.
   2. Aangegeven een aantal 22 x 50 mm bestrijken glazen op een benchtop.
   3. Met behulp van een Pasteur pipet, plaats een daling van de gesmolten agarose op een dekking van glas en meteen een seconde afdekglas plaats over de daling bij een 90 hoek ten opzichte van de eerste. Herhaal dit voor verschillende andere dekglaasjes. De diameter van de afgeplatte schijf van agarose moet tussen de 15-20 mm.
   4. Nadat de agarose is gestold (dit duurt maar even), verwijder dan de dekking van glas en laat het pad volledig aan de lucht drogen (enkele uren tot 's nachts).
   5. Bewaar de pads in een deksel glazen doos op kamertemperatuur.
      
      
3. Maak naald laders voor DNA-oplossing:
   
   Naald laders zijn gemaakt van 100 ul capillaire buisjes die in het midden verwarmd boven een open vuur en snel getrokken om ongeveer twee keer hun lengte. De twee helften uit elkaar geklikt zodra de capillair afkoelt. Voorraad 10-20 naald laders voor injectie. Rechtop bewaren in een microcentrifugebuis rek. Wees voorzichtig om niet zichzelf te spiesen op de punten.
   
   
4. Maak micro-injectie naalden:
   
   De naald is gemaakt van een speciale capillaire buis dat een interne glas gloeidraad bevat; dit filament dient als een lont voor de DNA-oplossing. Deze zijn getrokken op een naald-trekker machine. We maken gebruik van een Narishige PP-830 trekker met een warmte-instelling van 24,8. Meerdere naalden zijn getrokken op een moment en worden opgeslagen in een klein plastic doosje. Meerdere naalden kunnen gemakkelijk worden "gemount" op een strip van boetseerklei voor langdurige opslag.
   
   
5. Punt van de naald "branding":
   
   De tip van de micro-injectie naald wordt getrokken zo fijn dat het eigenlijk is gesloten op het einde en moet worden opengebroken met behulp van kleine scherven van de dekking glas. Deze worden bereid door wikkelen een 18 x 18 mm dekglas in een papieren handdoek en voorzichtig druk uit te oefenen totdat het breekt in stukken. Scherven van een bruikbare afmetingen zijn ongeveer 3 x 4 mm.
   
   
6. Grow wild type (N2) wormen aan het begin van de volwassen stadium voor injectie met behulp van standaardprocedures ^6. Bereid ongeveer 100 goed geënsceneerd wormen / bouwen geïnjecteerd.

Procedure

1. Open de hoofdkraan op een helium tank die is aangesloten op een micro-injectie naald arm en houder. Sluit de regelventiel zodat het gas naar de regel in te voeren, waardoor de druk om 35 psi. Merk op dat het gas kan worden vrijgegeven met behulp van een voetpedaal.
   
   
2. Steek een naald lader in een standaard mond pipetter slangen (te vinden in verpakkingen van glas capillaire buizen) en het opstellen van een kleine hoeveelheid van het plasmide mengsel (~ 1 pi).
   
   
3. De naald lader wordt zorgvuldig geplaatst in de back-end van een injectienaald ingebracht en voorzichtig de weg door de lengte vande naald totdat u weerstand voelt. Verdrijf de DNA-oplossing door zachtjes te blazen, dan verwijdert u de lader.
   
   
4. Steek de naald in de micro-injectie arm, en let te plaatsen binnen de kleine interne rubberen pakking.
   
   
5. Plaats een naald-brekende scherf van de dekking glas op een rand van een agar pad. Dek de scherf, evenals het gehele oppervlak van de agar pad, met halogene olie. Plaats de agar pad op het podium van een omgekeerde microscoop.
   
   
6. Plaats de naald in het midden van het veld met behulp van het bekijken van de 4x objectieve en heldere gebied van verlichting, maar nog niet laten zakken in de olie. Ook de binnenkant van de scherf van de dekking glas in het midden, dan richten op het (nog steeds met behulp 4X doelstelling). Laat de naald in de olie, waardoor het in dezelfde focal plane als de scherf van de dekking glas. Verhoog de vergroting door over te schakelen naar de 40X doelstelling. Richten op de rand van de scherf en de positie van de punt van de naald, indien nodig.
   
   
7. Het openstellen van de punt van de injectienaald, zacht duwtje de naald tegen de rand van het deksel glas scherf, terwijl tegelijkertijd de toepassing van een korte puls van gas via het voetpedaal. De naald zal voldoende opengebroken wanneer kleine druppeltjes vloeistof ontsnappen aan de uiteinde van de naald. Overtollige vloeistof stromen als gevolg van een te grote opening is niet wenselijk, omdat het doden van de dieren.
   
   
8. Haal de agar pad vanaf het podium door het verhogen van de naald op, maar veranderen niets aan de X-of Y-as positie. Schuif de stage uit onder de naald, verwijder de agar pad en plaats deze op een dissectie microscoop. Overdracht van een worm op het pad, onder het oppervlak van de olie. Als de worm kronkelt voorzichtig aaien tot hij contact maakt met de agar pad. De vochtige worm dient te houden aan de droge agarose.
   
   
9. Injectie
   1. Plaats snel de agar pad weer op het podium, het centreren van de worm in het gezichtsveld.
   2. Laat de naald in hetzelfde vlak van focus als de worm.
   3. Zet de filters om Hoffman Verlichting (een soort contrast filter). Dit maakt morfologische detail van de worm om zichtbaar te worden. Als Nomarski / DIC optiek zijn beschikbaar op de omgekeerde ruimte die zo goed zal werken. Met behulp van de 40X doel, focus op de "korrelig" syncytieel midden van de worm gonaden, onder de "honingraat" patroon van de kiem kernen (kiezen welke gonaden is gepositioneerd aan de kant van de worm naar de naald).
   4. Fijnafstemming van de positie van de naald totdat de tip ook in focus (hetzelfde vlak als de gonaden "korreligheid").
   5. Steek de naald in het midden van de gonaden en breng een korte puls van gas druk om een ​​druppel of twee van DNA te verdrijven in de gonaden arm. U moet zich aan een golf van vloeistof verspreid over de distale gonade. Denk niet dat meer vloeibaar is beter, want te veel vloeistof kan stromen in de proximale bocht van de gonaden arm, die kan stilgelegd eicel productie. Indien mogelijk, afhankelijk van de positie van de worm, injecteren de andere gonaden arm op dezelfde manier.
   6. Het is belangrijk om snel te werken, terwijl het injecteren van een worm, omdat het gemakkelijk kan uitdrogen. De beslissing om de tweede gonaden arm injecteren is afhankelijk van hoe snel je kunt opnieuw de positie van de naald en worm. Het hele proces idealiter minder dan 1-2 minuten.
      
      
10. Verwijder het deksel glas van het podium en plaats het op een dissectie reikwijdte. Van toepassing zijn 1μl van M9 buffer (22mm KH ₂ PO _4, 42mm Na ₂ HPO _4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO ₄₎ direct op de ingespoten worm (dit kan leiden tot onder te dompelen de pipetpunt onder het oppervlak van de halogene olie). De buffer moet hydrateren de worm, en wordt dan drijven uit de agarose pad oppervlak. Overdracht van de worm een ​​gewone plaat met behulp van een worm te kiezen. De agarose pad kan worden hergebruikt nog een aantal keren totdat het is geworden te verzadigd met buffer en de wormen niet meer houden.

Transgene selectie

1. Geïnjecteerd wormen, de _P-0 generatie, worden overgebracht naar de individuele verse, bacterieel geplaatste platen (60 mm) en mag zich voort te planten. Typisch, worden geïnjecteerd dieren geïncubeerd bij 20 ° C gedurende 2-3 dagen totdat de nakomelingen verschijnen.
   
   
2. De F ₁ nakomelingen zijn waargenomen voor het bewijs van de transgene marker (zoals fluorescentie) met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop. Elke tl-licht, drager F _1, is dier afzonderlijk gekloond op een nieuwe plaat (sinds nakomelingen van elk F ₁ zijn een duidelijke lijn beschouwd). De F ₁ hermafrodieten mogen reproduceren. Nogmaals, is dit typisch uitgevoerd bij bij 20 ° C gedurende 2-3 dagen totdat de nakomelingen verschijnen.
   
   
3. De _F-2 generatie is waargenomen voor transgene dieren. F ₂ dieren die hebben geërfd en die de transgene array worden beschouwd als een "stabiel" lijn.
   
   OPMERKING: Bij de F ₁ eleeftijd kunnen er tal van transgene dieren, maar ze zijn niet stabiel. De meerderheid van de F ₁ transgene dieren zullen niet worden doorgegeven in de F ₂ stabiele lijnen.
   
   OPMERKING: Om te bepalen voor de variabiliteit in het gen kopie-aantal, het genereren van een minimum van drie onafhankelijke stabiele lijnen per construeren geïnjecteerd.
   
   
4. Iedere onafhankelijke stabiele lijn moet worden gehandhaafd als een aparte lijn van de wormen. Elke lijn kan worden gepropageerd door de overdracht van verschillende transgene dieren om een ​​nieuwe plaat bij elke generatie, dit moet worden uitgevoerd met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop als de selecteerbare merker is fluorescerend.

Discussie

Bij het doen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden:
- Injecteren direct in het centrum van de gonaden
- Injecteer niet te veel vloeistof
- Snel werken om uitdroging te voorkomen.

Als je in de problemen met de naald, zoals het is gebroken te groot is, is het het beste om remake een verse naald, in plaats van te proberen te injecteren met een minder dan ideale naald.

De generatie van transgene wormen kent vele toepassingen, zoals:
- Identificatie van gemuteerde genen, in de methode g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Coverglass 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 ul Capillary		VWR international	53432-921
Glass Capillary for Needles	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Needle Puller	Tool	Narishige International	Model PP-830
microINJECTOR System		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645