Toepassing van een C. elegans Dopamine neuron degeneratie Assay voor de validatie van Potentieel de ziekte van Parkinson Genen

Samenvatting

Deze video laat zien hoe C. elegans te gebruiken om dopaminerge neuron neurodegeneratie te beoordelen als een model voor de ziekte van Parkinson. Verder worden genetische screens gebruikt om de factoren die een verbetering van degeneratie of neuroprotectieve identificeren.

Samenvatting

Verbeteringen aan de diagnose en behandeling van de ziekte van Parkinson (PD) zijn afhankelijk van de kennis over de gevoeligheid factoren die de bevolking maakt in gevaar. In het proces van een poging om nieuwe genetische factoren die samenhangen met ziekte van Parkinson te identificeren, hebben wetenschappers gegenereerd vele lijsten van kandidaat-genen, polymorfismen, en eiwitten die belangrijke vorderingen te vertegenwoordigen, maar deze leidt blijven mechanistisch undefined. Ons werk is erop gericht in de richting van aanzienlijk vernauwing deze lijsten door gebruik te maken van de voordelen van een eenvoudig dier modelsysteem. Terwijl de mensen hebben miljarden neuronen, de microscopische rondworm Caenorhabditis elegans is precies 302, waarvan er slechts acht produceren dopamine (DA) in hemaphrodites. Expressie van een menselijk gen dat codeert voor het PD-geassocieerd eiwit, alfa-synucleïne, in C. elegans DA neuronen resulteert in een dosering en leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie.

Wormen die humaan alfa-synucleïne in DA neuronen isogene en express zowel GFP en het menselijk alfa-synucleïne onder de DA-transporter promotor (Pdat-1). De aanwezigheid van GFP dient als een gemakkelijk gevisualiseerd marker voor de volgende DA neurodegeneratie bij deze dieren. We in eerste instantie aangetoond dat alfa-synucleïne-geïnduceerde DA neurodegeneratie zouden kunnen worden gered bij deze dieren door torsinA, een eiwit met moleculaire chaperone activiteit ^1. Verder, de kandidaat-PD-gerelateerde genen geïdentificeerd in ons lab via grote schaal RNAi screening inspanningen met behulp van een alfa-synucleïne misfolding test werden vervolgens over-uitgedrukt in C. elegans DA neuronen. We hebben vastgesteld dat vijf van de zeven genen vertegenwoordigd belangrijke kandidaat-modulatoren van PD getest als ze gered alfa-synucleïne-geïnduceerde DA neurodegeneratie ^2. Daarnaast heeft de Lindquist Lab (dit nummer van Jove) uitgevoerd gist schermen, waarbij alfa-synucleïne-afhankelijke toxiciteit wordt gebruikt als een uitlezing voor de genen die kunnen versterken of onderdrukken cytotoxiciteit. We vervolgens de gist kandidaat genen onderzocht in onze C. elegans alfa-synucleïne-geïnduceerde neurodegeneratie assay en met succes gevalideerd veel van deze doelstellingen ^{3, 4.}

Onze methodologie bestaat genereren van een C. elegans DA neuron-specifieke expressie vector met behulp van recombinationele klonen van kandidaat-gen cDNA onder controle van de Pdat-1 promotor. Deze plasmiden worden dan gemicroinjecteerd in wild-type (N2) wormen, samen met een selecteerbare merker voor succesvolle transformatie. Meerdere stabiele transgene lijnen de productie van de kandidaat-eiwit in DA neuronen worden verkregen en vervolgens onafhankelijk van elkaar gekruist in de alfa-synucleïne degeneratieve stam en beoordeeld voor neurodegeneratie, zowel op het dier en de individuele neuron-niveau, in de loop van het ouder worden.

Protocol

A. expressieplasmide Bouw

Twee plasmiden zijn nodig: een voor weefsel-specifieke expressie van het gen van interesse en een tweede als selecteerbare marker transformatie (hoewel de marker plasmide meestal beschikbaar is vanuit de onderzoekswereld).

Experimentele Plasmide

1. Selecteer een promotor die wordt uitgedrukt in de weefsels / cellen type van belang, in dit geval, de DA transporter (Pdat-1) promotor wordt gebruikt. Deze uitdrukking plasmide werd opgericht als een Invitrogen Gateway systeem-compatibele bestemming vector (pDEST-DAT-1) tot het inbrengen van een gen van belang stroomafwaarts van de promotor door recombinationele het klonen van ^een mogelijk te maken.
2. Het cDNA van het gen van belang is PCR geamplificeerd met behulp van primers die de gateway att B recombinationele volgorde bevatten. De versterkte cDNA wordt eerst gerecombineerd in de donor vector pDONR201 om de invoer vector te maken en daarna getransformeerd in E. coli-stam DH5a. Volgende selectie van succesvolle recombinanten en mini-prep isolatie van DNA, wordt het item vector gerecombineerde in de pDEST-DAT-1 bestemming vector het maken van de expressieplasmide. Details over recombinationele klonen zijn verkrijgbaar bij zowel de Invitrogen Gateway handleiding of in Caldwell et al.. ^5.

Selecteerbare Marker Plasmide

Een transgeen marker plasmide bestaat uit een vector met een promotor het besturen van de expressie van een fluorescerend eiwit in een voor de hand liggende weefsel. In dit specifieke procedure, de unc-54 promotor drives cherry eiwit expressie in het lichaam van wand-spier (Punc-54:: kers).

B. Generatie van transgene C. elegans via micro-injectie

Zie gerelateerde Jove artikel: https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. Genetische kruisjes voor DA neurodegeneratie Analyse

1. Wormen worden gekweekt met behulp van standaardprocedures ^6.
2. Plaats 10 Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP reuen ^{1, 2} op een paring bord met 3-4 L4 stadium transgene hermafrodieten (uitdrukken Pdat-1:: gen X en Punc-54:: kersen) . Dit moet individueel worden uitgevoerd voor elk van de drie afzonderlijke, stabiele lijnen. Na twee dagen, verwijdert u de mannetjes.
3. Inspecteer de F1-generatie, als er verschillende mannelijke nakomelingen, de paring is gelukt.
4. Kloon van 5 hermafrodiet L4 dieren uit elke kruis dat vertonen zowel de Pdat-1:: GFP fluorescente marker (overgenomen van de mannelijke ouder) en de Punc-54:: kersen fluorescerende lichaamswand spier marker (overgenomen van de hermafrodiet ouder). De gekloonde dieren moeten worden in het L4 stadium te verzekeren dat zij nog niet gepaard met mannelijke dieren aanwezig zijn op de plaat. Laat ze zelf-cross en produceren F2 nakomelingen.
5. F2 dieren die in stap 3 zijn gekloond uit. In het bijzonder, overdracht ~ 50-10 dieren die zowel fluorescerende markers vertonen om hun eigen individuele borden. Het scherm van de F3 generatie voor platen waar 100% van de dieren te drukken GFP in DA neuronen en een aantal van de dieren te drukken kers in het lichaam muur spiercellen. Deze dieren zullen worden homozygoot voor de Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP-gen, terwijl stabiel de nieuw gecreëerde transgene (gen X) uitzenden.

D. Dopaminerge Neuron Analyse

1. Bereid een nieuwe plaat voor elk van de drie lijnen die hierboven is gecreeërd, evenals de Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP alleen stam. Laat hen groeien naar volwassenheid.
2. Overdracht 30-40 transgene volwassenen van elke regel op een verse plaat. Laat ze embryo's leggen voor 4 uur bij 20 º C.
3. Verwijder de volwassenen. Laat de embryo's te ontwikkelen voor 3-4 dagen bij 20 º C tot ze bij de L4 stadium.
4. Pick ~ 100 transgene L4 dieren om een ​​plaat met 0,04 mg / ml 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR). Dit nucleotide analoog blokkeert de ontwikkeling van de volgende generatie via remming van DNA-synthese, waardoor het voorkomen van de nakomelingen van overweldigende de proefdieren ^7. Bescherm de FUDR platen van het licht, omdat het is licht gevoelig.
5. Volwassen dieren worden geanalyseerd op verschillende dagen na de leg. De juiste dag van de analyse worden empirisch vastgesteld. Zo hebben we vastgesteld dat 77%, 87% en 90% van de Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP dieren vertonen ontaard DA neuronen op dag 6, 7 en 10 na de ontwikkeling, respectievelijk. Daarom, als we voorspellen dat het transgen van belang kunnen neurodegeneratie te vergroten, zullen we analyseren op dag 6 en / of 7. Evenzo zal transgenen die kunnen onderdrukken neurodegeneratie worden geanalyseerd op dag 7 en 10.
6. Maak 4 verse agarose pads (in tegenstelling tot de micro-injectie agar pads, deze zijn vers gebruikt en mogen niet uitdrogen). Uiteengezet twee microscoop dia's die een stukje tape over hen, de tape dient als spacer voor gelijkwaardig dikke voetzolen. Leg een derdeschuiven tussen hen op de bank (ze zijn geplaatst drie-hoogte). Breng een druppel gesmolten agarose in het midden schuiven en snel te leggen een andere dia op de top van de agarose, loodrecht op en in alle drie dia's. Maak een aantal extra pads, waardoor de twee dia's samen tot het pad is klaar voor gebruik.
7. Voor het analyseren van worm DA neuronen, plaats een 6 pl daling van 3 mm levamisole (een verdoving) op een 22 x 30 mm dekglas. Pick 40 volwassen dieren (10 extra buiten de 30 gescoord worden) in de drop, keer dan de dekking van glas op de agarose pad. Herhaal dit voor elk van de andere lijnen.
8. Score 30 dieren per lijn voor de aanwezigheid van elk CEP en ADE neuron het gebruik van een samengestelde microscoop met epifluorescentie en een filter kubus die visualisatie van FITC of GFP mogelijk maakt. We maken gebruik van een Begiftig GFP HYQ filter kubus (Chroma Technology). Registreren gegevens op het bijgevoegde scoreblad. Wild-type dieren, behoudt volledig GFP fluorescentie in alle 4 de CEP en 2 ADE neuronen. Individuele dieren tentoonstellen verlies van DA neuronen worden gescoord als niet-WT of "ontaarden". Ook kan de mate van degeneratie gescoord worden door het tellen van de totale neuronen verloren gaan in ieder dier als de bevolking.
9. Herhaal de analyse nog 2 keer (30 meer dieren per lijn per proef). Het totaal aantal wormen vertonen wild-type DA neuronen van de drie rondes van de analyses is gemiddeld. Statistische analyse voor neuroprotectie wordt vervolgens uitgevoerd met behulp van de student t-test (p <0,05) om de controle wormen (Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP) te vergelijken met stammen die meer dan-express kandidaat genen in DA neuronen .

Discussie

De leeftijd-afhankelijke verlies van dopamine neuronen is een klinisch kenmerk van de ziekte van Parkinson en is in verband gebracht met de accumulatie of misfolding van een eiwit genaamd alfa-synucleïne. Hier laten we zien hoe een label, via een fluorescerende transgen, de dopaminerge neuronen van C. elegans en bootsen de neurodegeneratie gezien bij de ziekte van Parkinson door coexpressing menselijk alfa-synucleïne in deze cellen.

Deze video toont de methodologie voor de groei, de genetische kruising, montage, en scoren v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose	Ultrapuur	Invitrogen	15510-027
Dekglas 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Microscoopglasplaatjes	Klaar, 3x1"	Fisher Scientific	12-549
Dissectiemicroscoop met fluorescentie	Microscoop	Nikon Instruments	SMZ800
Dissectiemicroscoop	Microscoop	Nikon Instruments	SMZ645
Epifluorescentiemicroscoop	Microscoop	Nikon Instruments	Model E-800
Filterkubus, GFP HYQ	Endow Bandpass	Chroma Technology Corp.