De volledige tekst protocol voor deze experimentele aanpak is beschikbaar in <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract ">Current Protocols in Cellular Biology</a> .

De auteurs hebben niets te melden.

in vitro nuclear assembly met behulp van gefractioneerde xenopus egg extracten

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Kernmembraan assemblage is een essentiële stap in de celdeling-cyclus, dit proces kan worden gerepliceerd in de proefbuis door het combineren van Xenopus sperma chromatine, cytosol, en licht membraan fracties. Compleet kernen worden gevormd, met inbegrip van nucleaire membranen met poriën complexen, en deze gereconstitueerde kernen zijn in staat van normale nucleaire processen.

In Vitro Nuclear Assembly Met behulp van Gefractioneerde Xenopus Egg Extracten

De assemblage van de kernmembraan is een essentiële stap in de celdelingscyclus; dit proces kan in een reageerbuis worden gereproduceerd door Xenopus-sperma te combineren met...

Xenopus labus-ei-extracten zijn nuttig als cytoplasmatisch en organelmateriaal voor de in vitro reconstitutie van cellulaire processen, zoals kernassemblage en import van kernproteïnen. Wanneer spermachromatine-DNA wordt toegevoegd aan ruwe of gefractioneerde XUS-ei-extracten, binden membraanvesikels die in het extract aanwezig zijn zich aan het oppervlak van het chromatinen, fuseren zij en incorporeren zij componenten van de kernporie om volledig functionele synthetische kernen te vormen. De karakterisering van de moleculaire basis van deze processen is vervolgens mogelijk door immunodepletie van extracten en door proteïne-editie.Hoi, mijn naam is Marie Cross en ik ben een promovendus in het laboratorium van Dr. Maureen Power van de afdeling Celbiologie aan de Emory University in Atlanta, Georgia. Vandaag laten we u zien hoe u in vitro kernen kunt vormen met behulp van gefractioneerde xenopus-eiextracten. Deze procedure omvat de volgende stappen: het uitvoeren van de reactie voor kernassemblage en het beoordelen van de kernvorming.Laten we beginnen. Om de nucleaire assemblage te starten, neemt u een aliquot gefractioneerd cytosol en voegt u fosfocreatine uit een 0,2 molar voorraadoplossing toe tot een eindconcentratie van 20 millimolar. Voeg vervolgens creatinekinase uit een voorraadoplossing van vijf milligram per milliliter toe tot een eindconcentratie van 50 microgram per ml.Voeg ten slotte 20 micromolaire A TP toe met behulp van een 0,2 molaire voorraadoplossing. Voeg vervolgens lichte membranen toe aan het cytosol in een verdunning van één op 10. Dit benadert de hoeveelheid membraan die aanwezig is in het oorspronkelijke ruwe extract.Meng alle componenten door herhaaldelijk op en neer te pipetteren om de membranen in het extract te dispergeren. Dit moet gebeuren voordat het spermachromatine wordt toegevoegd. Voeg vervolgens spermachromatine in de gewenste concentratie toe aan het gefractioneerde extract en meng het extract en het sperma onmiddellijk door voorzichtig op en neer te pipetteren met een afgeknotte tip.Wanneer het spermachromatine aan het extract wordt toegevoegd, begint het onmiddellijk te decomprimeren, te condenseren en gevoelig te worden voor afschering. Over het algemeen worden deze reacties uitgevoerd in centrifugebuisjes van 500 microliter met een totaal volume van minder dan honderd microliters. De eiextracten ondersteunen de vorming van maximaal 8.000 tot 9.000.Kernen per microliter: incubeer het mengsel gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur om de kernen te laten vormen. Kernen worden gevisualiseerd met behulp van kleuring. Na ongeveer 30 minuten zullen de nieuw gevormde kernen klein zijn en een ovale vorm hebben.Het DNA is nog vrij gecondenseerd en de nucleus moet eruitzien als een solide lichtblauw vlak tijdens het spinnen van de hook wanneer dit in het UV-kanaal wordt geobserveerd terwijl het DNA condenseert. Bovendien zal de blauwe kleuring minder homogeen worden, waarbij uiteindelijk zwarte openingen verschijnen. De vorming van het kernmembraan kan worden gevisualiseerd door één microgram per mannelijk exemplaar van 3,3-diaminocyclohexancarboxamide of DHCC aan het fixatief toe te voegen.DHCC is een fluorescerende lipofiele kleurstof die wordt gevisualiseerd in het fluoresceïnekanaal. In de vroege stadia van de kernassemblage zijn membraanvesikels gebonden aan het chromatineoppervlak en beginnen deze in clusters te fuseren. Dit resulteert in een ongelijkmatig en discontinu uiterlijk van de vormende membraan.Zodra het membraan voltooid is, vlakt het uit over het nucleaire oppervlak en verschijnt het als een gelijkmatige, ononderbroken rand rond het DNA. Er zal een aanzienlijke hoeveelheid achtergrondfluorescentie in het omringende cytosol zijn door membraanvesikels die niet in de kernen zijn opgenomen. We hebben u zojuist in vitro nucleaire reconstitutie gedemonstreerd met behulp van oplosbare en lichte membraanfracties uit xenopus-eiextract.Het is belangrijk om te onthouden dat ruw extract gebruikt kan worden voor nucleaire assemblage, maar niet na invriezen en ontdooien. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

in-vitro-nuclear-assembly-using-fractionated-xenopus-egg-extracts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Emory University.  Kernmembraan assemblage is een essentiële stap in de celdeling-cyclus, dit proces kan worden gerepliceerd in de proefbuis door het combineren van Xenopus sperma chromatine, cytosol, en licht membraan fracties. Compleet kernen worden gevormd, met inbegrip van nucleaire membranen met poriën complexen, en deze gereconstitueerde kernen zijn in staat van normale nucleaire processen.

In Vitro Nuclear Assembly Met behulp van Gefractioneerde Xenopus Egg Extracten

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Protocol

Openbaarmakingen

Herprints en machtigingen

Tags