$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
I. Schematisch overzicht:
Deze video toont de verschillende stappen in het ganse berg immunohistochemie in kippenembryo. Eerst wordt het embryo vastgesteld in PFA [IHC1]. Vervolgens wordt de endogene peroxidase activiteit uitgeblust [IHC2]. Het embryo wordt vervolgens geïncubeerd in primaire antilichaam [IHC3]. Na een aantal wasbeurten, het embryo wordt geïncubeerd in secundaire antilichaam [IHC4]; Kleur reactie wordt geopenbaard via DAB [IHC5] en antilichaam vlekken lijkt oranje [IHC6].
Deel 1: Het bevestigen van de embryo's
- Voor het uitvoeren van ganse berg immunohistochemie op kippenembryo's, opent u eerst een ei door te tikken op de schaal met een tang en het verwijderen van delen van de schelp.
- Verwijder de dikke albumine met een tang, en kantel de dooierzak met grof tang, zodat de embryo naar boven wijst.
- Met behulp van fijne schaar, knip een vierkant van dooierzak rond het embryo. Verwijder het embryo uit de dooier met een lepel, en plaats in een schotel met PBS.
- Onder een microscoop dissectie, verwijder voorzichtig de membranen en de dooier en de embryo transfer naar een nieuwe schotel met PBS.
- Pin het embryo naar beneden met een tang en insecten pinnen, en zuig het PBS. Vervang deze met 4% PFA in PBS, en laat het embryo tot 1u vast te stellen op RT.
Deel 2: Voorbereiding van embryo's voor antilichaam stap
- Te minimaliseren mogelijke bacteriële besmetting, het gebruik DDH 2 O in alle volgende stappen.
- Nadat het embryo is vastgesteld, zuigen het fixeermiddel oplossing en afvoeren goed als chemisch afval. Vul de schotel met PBS.
- volgende, met behulp van een microdissectie mes, snijd een vierkant rond embryo tot extra-embryonale membranen te verwijderen. Verwijder insect pinnen met een pincet.
- Na het pinnen zijn verwijderd, gebruik dan een stomp uiteinde Pasteur pipet om de embryo transfer naar een scintillatieflesje die naast PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X).
- Was de embryo met PBT, 3 keer voor 10 minuten elk.
- Verwijder PBT uit de scintillatieflesje, en te vervangen door PBTx met 0,3% H 2 O 2 om potentiële endogene peroxidase inactiveren.
- Incubeer 2 uur bij RT op nutator.
- Was embryo met PBT, 3 keer voor 10 minuten elk, dan 3 keer voor 30 minuten elk.
Deel 3: Antibody incubatie
- Om vlekken op de embryo met antilichaam, begin dan met het wassen van de embryo's gedurende een uur in het blokkeren van buffer of 1% BSA / 1% NGS / PBT (we gebruiken NGS, omdat het secundaire antilichaam wordt verhoogd bij geiten). Incubeer op nutator gedurende een uur bij RT.
- Verdun het primaire antilichaam 01u01 in het blokkeren buffer, en incubeer embryo in deze oplossing gedurende 2 dagen bij 4 ° C op nutator. Primaire antilichaam verdunningsfactor afhankelijk van de keuze van de primaire antilichaam. Hier gebruiken we een antilichaam van de Ontwikkelings Studies Hybridoma Bank, die wordt verstrekt als supernatent. We verdunnen 1:1 in het blokkeren van buffer.
- volgende, voert drie 10-minuten wast in PBT, gevolgd door 3 1-uur wast in PBT.
- Na het wassen, verdunnen het secundaire antilichaam 1:2500 in het blokkeren van buffer (in dit geval peroxidase geconjugeerd geit-anti-muis IgG (H + L), en incubeer embryo in deze oplossing O / N bij 4 ° C op nutator.
- Voer drie 10-minuten wast in PBT, gevolgd door 3 1-uur wast in PBT.
Deel 3: Kleur reactie
- De ontwikkeling van de kleurreactie van de gebrandschilderde embryo, voert u eerst twee 20-minuten wasbeurten in Tris buffer (100mm Tris HCl, pH 7,4).
- Ondertussen ontbinden DAB substraat (3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride) in Tris buffer bij 500μg/ml onder zuurkast, houd-oplossing in het donker, op het ijs.
- Verwijder de laatste Tris-buffer wassen van de flacon met embryo en te vervangen door 5 ml DAB-oplossing van stap 3.2. Te houden in het donker op nutator voor 20 minuten. Gooi Eppendorf tip in een emmer met 10% bleekmiddel oplossing om DAB saneren.
- Ondertussen bereiden een 0,3% aandelen H 2 O 2 in dH 2 O op het ijs.
- Voeg 50μl voorraad H 2 O 2 tot en met flesje met embryo's in DAB. Te houden in het donker. Na 1-2 minuten, monitor reactie onder de microscoop.
Deel 4: Embryo verwerking voor fotografie en histologie
- Bij de kleurreactie is voltooid, beschikken over DAB in bleekwater emmer. Vervangen met 5 ml leidingwater.
- Uitvoeren van twee 10-minuten wassingen in PBS.
- Te verwerken voor fotografie en wax snijden, drogen in een ethanol-serie (25%, 50%, 75% en 100%) gedurende 10 minuten elk.
- Vervang de ethanol met 0,5 - 1 ml cederhout olie (dit zal het embryo doorzichtig te maken). Proces voor fotografie in cederhout olie.
- Na de fotografie, terug naar embryo flacon en vervanging van de cederhout olie met 100% ethanol. Herhaal stap ethanol.
- Vervang ethanol met 5% Fast groene FCF in 100% ethanol, en incubeer gedurende 3 minuten (deze stap zal maken embryo's zichtbaar voor histologie). Vervang Snel groen FCF oplossing met 100% ethanol en proces voor histologie.
Representatieve resultaten:
In de voorbeelden hieronder wordt weergegeven, worden embryo's ontleed in fasen HH 10 (A), 12 (B) en 11 (C); Embryo's tonen uitdrukking van PAX 7 in de opkomende neurale Crestas ook in somieten en neurale buis (A, B); In (C), is notochord gelabeld met 15.3B9 (Niet-1) (Antilichamen verstrekt door Developmental Studies Hybridoma Bank).