Bloedafname van de Amerikaanse Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

Samenvatting

De Amerikaanse degenkrab, Limulus polyphemus, is misschien wel de meest handige bron voor grote hoeveelheden bloed van een ongewervelde. Het bloed is eenvoudig in samenstelling, met slechts een cel-type in de algemene circulatie, de granulaire Amebocyte, en slechts drie overvloedige eiwitten in het plasma, hemocyanine, de C-reactieve proteïnen en α2-macroglobuline. Bloed wordt verzameld vanuit het hart en het bloed cellen en plasma worden gescheiden door centrifugeren.

Samenvatting

Het hoefijzer krab is de best gekarakteriseerd immuunsysteem van een langlevende ongewervelde. De studie van de immuniteit in degenkrabben werd vergemakkelijkt door het gemak in het verzamelen van grote hoeveelheden bloed en uit de eenvoud van het bloed. Hoefijzer krabben laten slechts een enkele cel type in de algemene circulatie, het korrelige Amebocyte. Het plasma heeft het zoutgehalte van zeewater en slechts drie overvloedige eiwitten, hemocyanine, de luchtwegen eiwit, de C-reactieve eiwitten, die functioneren in de cytolytische vernietiging van vreemde cellen, waaronder bacteriële cellen en α2-macroglobuline, die de proteasen remt van de binnendringende ziekteverwekkers. Het bloed wordt verzameld door directe cardiale lekke band, onder de voorwaarden dat de besmetting te minimaliseren door lipopolysaccharide (aka, endotoxine, LPS), een product van de Gram-negatieve bacteriën. Een groot dier kan opleveren 200 tot 400 ml bloed. Voor de studie van het plasma, zijn bloedcellen onmiddellijk verwijderd uit het plasma door centrifugeren en het plasma kan vervolgens worden gefractioneerd in de samenstellende eiwitten. De bloedcellen zijn overzichtelijk microscopisch onderzocht door het verzamelen van kleine hoeveelheden bloed in de LPS-vrij isotone zoutoplossing (0,5 M NaCl) onder omstandigheden die rechtstreeks microscopisch onderzoek mogelijk te maken door het plaatsen van een of meer LPS-vrij coverglasses op de cultuur schotel oppervlak, dan montage die coverglasses in eenvoudige observatie kamers na celhechting. Een tweede voorbereiding op de directe observatie is om 3 te verzamelen - 5 ml bloed in een LPS-vrij embryo schotel en vervolgens explanting fragmenten van geaggregeerde amebocytes naar een kamer die sandwiches het weefsel tussen een glijbaan en een dekglaasje. In deze voorbereiding, de beweeglijke amebocytes migreren naar het dekglaasje oppervlak, waar ze gemakkelijk kunnen worden waargenomen. De bloedstolling systeem omvat aggregatie van amebocytes en de vorming van een stolsel extracellulaire van een eiwit, coagulin, dat vrijkomt uit de secretoire korrels van de bloedcellen. Biochemische analyse van de gewassen bloedcellen vereist dat aggregatie en degranulatie doet zich niet voor, die kan worden bereikt door het verzamelen van bloed in 0,1 volumes van 2% Tween-20, 0,5 M LPS-vrij NaCl, gevolgd door centrifugeren van de cellen en wassen met 0,5 M NaCl.

Protocol

Anatomische eigenschappen van het hoefijzer krab die relevant zijn voor bloeden (fig. 1)

Figuur 1

1. De drie belangrijkste divisies van het lichaam, van anterior naar posterior, zijn de prosoma (P), de opisthosoma (O), en het telson (T) ^1.
2. De voorste en laterale vrije randen van de prosoma is de flens.
3. De achterste meest inspringen van de opisthosoma, waar de telson articuleert, is de terminal baai.
4. De gezamenlijke waar de prosoma en de opisthosoma verwoorden is het scharnier (H).
5. Het hart is gelegen langs de dorsale middellijn, net onder het schild van de prostoma en opisthosoma ² (afb. 2).
   
   
   
   
   Figuur 2
   
   

Algemene beschouwingen, steriliteit en bescherming tegen blootstelling aan lipopolysaccharide (endotoxine)

1. De belangrijkste vijand van de succesvolle afloop is cel klonteren, exocytose, en de vorming van de coagulin stolsel. Cel aggregatie en exocytose worden gestimuleerd door lipopolysaccharide (aka, endotoxine, LPS), een product van de Gram-negatieve bacteriën. De drempel concentratie van LPS voor exocytose voor gewassen cellen is 0,1 - 1 mg / ml, maar cellen gesuspendeerd in plasma worden geactiveerd door beduidend lagere concentraties ^3. Endotoxine wordt niet geïnactiveerd door eenvoudige autoclaaf en mag worden verondersteld aanwezig te zijn op oppervlakken en in oplossingen en reagentia die niet zijn gecertificeerd te worden endotoxine-vrij.
2. Ter vermindering van de kans op stolling tijdens het verzamelen van bloed, selecteert u alleen perfect, onbeschadigde dieren voor bloeden. De dieren 1-2 uur pre-chill in de 4 ° C kamer. Praktijk steriele techniek. Vermijd besmetting met endotoxine.
3. LPS-vrij 3% zoutoplossing wordt gebruikt in de klinische geneeskunde en kunnen worden gekocht uit medische leveranciers (zie tabel van gespecialiseerde reagentia en leveringen). LPS kan worden verwijderd uit glaswerk en metalen door incubatie bij 180 ° C gedurende 4 uur. Steriele eenmalig gebruik injectienaalden, Petri-stijl cultuur gerechten, en schroefdop centrifuge buizen zijn alle LPS-vrij en kan gebruikt worden zonder aanpassing, zolang de juiste steriele techniek wordt beoefend.
4. De stabiliteit van de bloedcellen van verschillende dieren verschilt, met de cellen van enkele individuele dieren ondergaan spontane degranulatie, wat resulteert in de vorming van het stolsel coagulin, zelfs wanneer het dier is ontlucht met de grootste zorg. De bloedcellen van andere individuele degenkrabben zijn beduidend stabieler en, wanneer de juiste procedures worden gevolgd, blijven volledig korrelige tijdens het bloeden en de scheiding van cellen uit het plasma.
5. Verschillende agenten zijn gerapporteerd aan de bloedcellen volgende bloeden, inclusief cafeïne (bleed in 0.25 volumes van 10 mM cafeïne in LPS-vrij 3% NaCl) ^4, propranolol (1 mM eindconcentratie) ^5, dimethylsulfoxide ^6, tweewaardig kation chelatie stabiliseren ( bloeden in een gelijk volume van 0,1 M dextrose, 0,03 M natriumcitraat, 0,026 M citroenzuur, 10 mM dinatrium ethyleendiaminetetraazijnzuur (Na ₂ EDTA), pH 4,6) ^7, remmers van de G-eiwit en fosfolipase-C paden (cholera en pertussus toxines, U73122) ^8, substitutie van chloride met isethionaat anion ^9, chloride kanaal blokkers ^9, cyclisch AMP-antagonisten ^9, sulfhydryl reagentia (5 mM N-ethyl maleïmide, NEM) ^5, en de membraan-actieve detergent Tween-20 ( bloedingen in 0,1 volume 2% Tween-20 in LPS-vrij 0,5 M NaCl).

Supplies en reagentia voor bloeden de degenkrab: verzamelen van grote hoeveelheden bloed

1. een of meer grote, onbeschadigd hoefijzer krab
2. squirt fles met 70% ethanol
3. Kimwipes
4. 14 gauge naald
5. stevige tang
6. ijsemmer met ijs
7. 50 ml schroefdop plastic wegwerp centrifugebuizen
8. rack tot de 50 ml buizen te houden
9. contra-top centrifuge
10. steriele 50 ml serologische pipetten
11. bulb-type pipet filler
12. disposable steriele filter apparaat
13. vacuümpomp
14. LPS-vrij 3% NaCl-oplossing (voor de verzameling van bloedcellen)
15. Tween-20 (voor de inzameling van bloedcellen)

De voorbereidingen voor grote volumes bloeden

1. Voor het bloeden, gebruik van grote, onbeschadigde dieren. Chill het dier gedurende 1 uur in een koude kamer voor bloeden.
2. Stel een comfortabele regeling met een stabiele ondersteuning voor een ijs-emmer die is ongeveer 0,3 meter hoog (het besteedbare piepschuim container voor het verzenden van koude of bevroren reagentia is van toepassing) en een lage stoel voor de bestuurder. De ijsemmer is geplaatst op de draagstructuur en de stoel wordt getrokkentot en met dit apparaat. U moet comfortabel zitten gedurende een langere periode in de stoel met je ellebogen op je dijen, en met de linkerhand houden van een worstelende degenkrab gepositioneerd boven de bloedafnamebuisjes rechtop gepropt in een bed van ijs in de ijsemmer.
3. Pre-chill 4 - 6 van de 50 ml plastic wegwerp centrifugeerbuisjes met schroef sluitingen in het ijsbad. De buizen zijn rechtop in het ijs lag rond de perimeter van het ijsbad container. Net voordat het bloeden werking, verwijdert u de doppen van de buizen en plaats doppen op aangrenzende tafel, vast te houden aan steriele techniek.
4. Verwijder de dop van een 14 ga naald en gebruik de stevige tang om de naald in zijn mouw los te maken, maar niet de naald uit de mouw. Handhaven van de steriele. Raak geen deel van de naald met de vingers. Leg de mouw met naald op een aangrenzend teller met de blootgestelde uiteinde van de naald verhoogd van contact met een oppervlak om de steriliteit te behouden.
5. Bevochtig een Kimwipe met 70% ethanol.

Bloeden het dier (speciaal voor de rechtshandige operator)

1. Houd het dier voor bloeden: begrijpen van dieren in de linker hand met de vier vingers in contact met de voorste flens van de prosoma en de duim grijpen het achterste deel van de opisthosma aan de basis van de staart (de terminal baai). Het ventrale oppervlak van het dier wordt geconfronteerd met de palm van je hand. Het telson ligt aan de basis van de duim en projecten in de pols. Flex het dier zachtjes, zodat prosoma en opisthosoma zijn loodrecht op elkaar (figuur 3a).
   
   
   
   Figuur 3
   
   
2. Reinig de blootgestelde scharnier gewricht verbinden prosoma en opisthosoma met 70% ethanol toegepast met een ethanol-bevochtigd Kimwipe (figuur 3b).
3. Draai de linkerhand zodanig dat vingers 2 - 4 bovenste en de dorsale oppervlak van het dier naar boven. Met de rechterhand, plaats de 14 GA naald, nog steeds in de beschermende hoes, tussen de vingers 2 en 3 van de linkerhand. Neem de tang in de rechterhand en verwijder de naald uit de beschermende hoes Pak de kont met de pincet (figuur 3c). Draai de linker hand zodat dorsale oppervlak van de hand gezichten aan uw linkerhand, duim en wijsvinger zijn up, en het dier is ondersteboven, met de dorsale zijde in de rechterhand. Plaats de kolf van de naald boven de eerste van de 50 ml collectie buizen en oriënteren het dier, zodat de scherpe uiteinde van de naald is gericht op het scharnier gewricht en zodat de naald as is parallel aan de dorsale middellijn (figuur 3d). Steek het scherpe uiteinde van de naald door het scharnier gewricht in het lumen van het hart, het bijhouden van de naald evenwijdig aan de dorsale middellijn en ingevoegd op de middenlijn en met de kolf van de naald nog steeds boven de opening van de collectie buis. De naald wordt ingebracht ongeveer 1 - 2 cm diep in het gedeelte van het hart in de prosoma. Zodra het hart doorboord is, zal het bloed snel flow (figuur 4a, pijl), dus het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de levering uiteinde van de naald zich boven de mond van de collectie buis aan die eerste golf van het bloed te verzamelen.
4. Bloed verlaat het hart in eerste instantie in een continue stroom die, na ongeveer 30 - 50 ml bloed zijn verzameld, zal vertragen om individuele druppels (figuur 4b). Ter verbetering van de doorbloeding, kan het goed beleid te heroriënteren de punt van de naald een beetje. Kantel de naald omhoog of omlaag, naar links of naar rechts, schuif de punt dieper in het hart of er aan trekken om dichter bij het scharnier gewricht het standpunt dat optimaliseert de doorbloeding te vinden. Niet overmatig te comprimeren het dier, omdat dit risico's beschadiging van het dier en kan ertoe leiden dat de geëxtravaseerd bloed te starten bloedstolling.
   
   
   
   Figuur 4
   
   
5. Aangezien elke collectie buis vult met bloed, draai het ijsbad naar de volgende lege buis te brengen onder de levering uiteinde van de naald.
6. Als bloeden vertraagt, loopt u het risico van het hebben van de luchtstroom in een retrograde richting in de naald en in het hart. Dit kan gebeuren wanneer het dier straightens uit, waardoor de bloeddruk. Probeer dit te voorkomen door het handhaven van het dier in de gebogen positie of doordat strekken slechts langzaam optreden.
7. Als het dier stopt met het geven van bloed, verwijdert u het bloeden naald uit het hart. Re-cap de verzameling buizen en onmiddellijk in de table-top centrifuge, 1000 RPM, 5 min. centrifuge. Het bloed cellen zullen vormen compacte korrels op de bodem van de collectie buizen. Omdat alle componenten voor de bloedstolling zijn vervat in secretorische vesikels van de bloedcellen, zodra plasma gescheiden is van cellen,het risico van stolling van het plasma wordt geëlimineerd.
8. Het is noodzakelijk om te voorkomen dat stolling van het bloed geëxtravaseerd. Onmiddellijk centrifugatie van het bloed; Pre-koeling van het dier en het onderhoud van de collectie buisjes in een ijsbad, voorzichtige behandeling van het dier; vermindering van de snelheid waarmee het bloed uit stroomt van de naald: de volgende maatregelen verminderen het risico van stolling na inzameling, het vermijden van verontreiniging van de naalden en het verzamelen buisjes met endotoxine, het onderhoud van steriele procedure. Zoals hierboven vermeld, een aantal individuele dieren hebben in het bijzonder prikkelbaar bloedcellen die exocytose initiëren, zelfs wanneer deze voorzorgsmaatregelen worden gevolgd.
9. Na het centrifugeren, controleert de buizen voor de tekenen van de bloedstolling - strengen van cellen en gelatineachtig stolsel materiaal aan de wanden van de buis, geleiachtig materiaal aan de bovenkant van het stolsel, of, erger nog, grote hoeveelheden stolsel met ingesloten bloedcellen in het vloeistofkolom (Figuur 4c, pijl). Het materiaal van deze buisjes wordt serum, plasma niet, en bevat de uitgescheiden producten van de bloedcellen.
10. Breng de plasma om steriele buizen met de 50 ml steriele serologische pipet. Wees voorzichtig bij het pipetteren om te voorkomen dat aspiratie een van de cellen van de cel pellet op de bodem van de buis. Het beste is om een ​​paar ml plasma boven de pellet te verlaten om te voorkomen dat verstoring van de cel pellet.
11. De hierboven beschreven procedure is ontworpen om grote hoeveelheden plasma niet besmet door de secretoire producten van de bloedcellen te verzamelen. Voor het verzamelen van grote hoeveelheden van gewassen bloedcellen, het verzamelen van het bloed in 0,1 volumes van 2% Tween-20 opgelost in 3% LPS-vrij NaCl-oplossing. Voorzichtig Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten tot een losse cel pellet vast te stellen, dan was de cellen met een aantal wijzigingen van de LPS-vrij 3% NaCl. Een uittreksel van de cellen die de secretoire producten van de bloedcellen bevat kan worden bereid door het lyseren van de gewassen cellen in LPS-vrij gedistilleerd water. Dit lysaat bevat een uiteenlopende reeks van eiwitten en peptiden die werken in anti-microbiële immuunsysteem ^10,11 en bevat ook coagulogen, de zymogeen vorm van het structurele eiwit van de extracellulaire bloedstolsel, en de collectie van proteasen die coagulogen converteren naar coagulin, in de vorm van het eiwit dat polymeriseert in de fibrillen van het stolsel ^12. Dit extract is vergelijkbaar met de handel verkrijgbare product, Limulus Amebocyte lysaat of LAL, dat wil assay gebruikt voor de aanwezigheid van lipopolysaccharide ^13. De protease cascade die verantwoordelijk is voor proteolytische modificatie van coagulogen om coagulin wordt geactiveerd door LPS ^14.
12. Dispositie van dieren na bloeden. Bloeden onder leiding van de methoden hierboven beschreven wordt goed verdragen door het dier. Bij het werken in het Marine Biological Laboratory in Woods Hole, keer ik terug naar de oceaan dieren na het bloeden met de verwachting dat ze zullen overleven. Als de dieren worden gehouden in aquaria ver van het normale bereik van hoefijzer krabben, kunnen ze herhaaldelijk worden ontlucht of twee keer per maand. Zoals hieronder beschreven, dieren in gevangenschap gehouden vereisen een hoge kwaliteit water en frequent voeren om hun gezondheid te behouden. Euthanasie kan worden bereikt door vernietiging van het dorsale ganglion, dat gelegen is in de dorsale middellijn tussen de ogen.

Verwerking en opslag van de plasma

1. Bescherming tegen proteasen. Als het plasma wordt gebruikt voor eiwit zuivering, moet het behandeld worden met protease-remmers onmiddellijk na het ophalen. Voeg phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM. PMSF wordt gehouden als een 0,1 M voorraadoplossing in DMSO of ethanol. Het is nogal onstabiel in het water ^15, kan dus niet worden gebruikt voor duurzame bescherming, maar bovendien onmiddellijk na de scheiding van plasma van bloedcellen zal inactiveren de kleine hoeveelheden van de proteasen die zou kunnen zijn vrijgelaten uit de cellen.
2. Steriele filtratie: steriliseren het plasma door ultrafiltratie onder vacuüm met behulp van een disposable het midden-filtratie apparaat uitgerust met een 0,22 mm porie filter. Deze filters hebben de neiging om verstoppen. Het is raadzaam om de plasma-centrifuge voor het filteren om dit probleem te verminderen. Als grote hoeveelheden plasma zijn verwerkt, is het raadzaam om pre-filter van de plasma eerste gebruik van een Millipore filter met een 1 mm poriegrootte, dan met een 0,45 mm poriegrootte Millipore filter.
3. Plasma kan worden beschermd tegen bacteriële besmetting, hetzij door het toevoegen van NaN ₃ tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 mg / ml of door steriele filtratie. Niet-steriel plasma mag nooit worden opgeslagen voor perioden langer dan 2 dagen zonder de ene of de andere van deze anti-bacteriële maatregelen worden genomen.
4. Bloedstolling. In tegenstelling tot de zoogdieren stolling systeem, de Limulus plasma bevat geen van de elementen voor de bloedstolling. In plaats daarvan de hele machines voor stolselvorming, de structurele eiwit van het stolsel (coagulogen) en het systeem van proteasen dat proces coagulogen te maken dat in staat is polymeriseren in de onoplosbare stolsel, is te vinden in de secretoire korrels van de bloedcellen ^16. Dus als de bloedcellen worden verwijderd voordat ze een kans hebben om exocytose ondergaan, het plasma is geheel vrij van de eiwitten voor de bloedstolling en blijft voor onbepaalde tijd vloeistof.
5. Eiwit zuivering. Hemocyanine is aanwezig op 40 mg / mL in plasma en is een 48-mer van een 70 kDa subunit. Het kan worden geïsoleerd door ultracentrifugatie (40.000 X g, 8 h) of gel filtratie met een grote poriegrootte uitsluiting hars zoals Biogel A5M ^17. De C-reactieve proteïnen zijn aanwezig bij 1 - 5 mg / ml en kan worden geïsoleerd door affiniteit isolatie op phosphorylethanolamine-Sepharose, met elutie met een calcium chelator ^18. Het brede spectrum protease-remmer, een _{2-macroglogulin,} is gezuiverd door gelfiltratie op Sephacryl S-300 hars na hemocyanine en de C-reactieve proteïnen zijn ¹⁹ verwijderd.

Microscopisch onderzoek van de beweeglijke bloedcellen in cultuur

1. Oprichting van Amebocyte gazons in vitro: LPS-vrij 3% NaCl-oplossing wordt toegevoegd aan steriele plastic Petri-stijl cultuur gerechten (1 ml voor een 35 mm schaal, 2,5 ml voor een 60 mm schaal, 6 ml voor een 90 ml schotel). Het bloed wordt dan verkregen door het hart doorboren met de methode zoals hierboven beschreven, maar met de wijziging dat een 23 gauge, een in steriele naald wordt gebruikt in plaats van de 14 gauge naald. Bloed stroomt drop-door-drop uit de 23 gauge naald en een druppel is verzameld in de 35 mm schaal, 3 druppels in de 60 mm schotel, en 9 druppels in de 100 mm schotel. De bloedcellen worden vervolgens gelijkmatig gemengd in de 3% NaCl-oplossing door zacht zwenken, eerst in een cirkelvormig patroon, dan terug-en-weer. De voorbereiding wordt gedurende 5 min bij kamertemperatuur T om bloedcellen te hechten aan de schotel oppervlak, dan is de eerste zout wordt vervangen door een buffer van keuze ^3.
2. Indien het gewenst is om het substraat-ingeschreven bloedcellen in een undegranulated conditie te houden, is de eerste zout-bloedplasma mengsel vervangen door verse LPS-vrij 3% NaCl. Plasma versnelt de spontane degranulatie van de bloedcellen, zelfs in de afwezigheid van LPS, en de verwijdering stabiliseert de undegranulated toestand van de cellen.
3. Als de eerste zoutoplossing wordt vervangen met steriele plasma, de bloedcellen transformeren van de ovale vorm van de circulerende bloedcellen (Fig. 5) en plat op de ondergrond, en dan starten degranulatie en de vorming van een laag van de coagulin extracellulaire bloedprop boven het gazon van afgeplatte amebocytes ^20.
   
   
   
   Figuur 5
   
   
4. Oprichting van explant culturen van geaggregeerde amebocytes. Als het bloed wordt verzameld onder steriele, LPS-vrije omstandigheden, de bloedcellen uit vestigen van schorsing en geaggregeerde voor een tissue-achtige massa te vormen. Een handige container voor dit is de glazen embryo schotel LPS-vrij gemaakt door incubatie gedurende 4 uur bij 180 ⁰ C. Bloed verzameld in deze container door de cardiale punctie met behulp van een 19 gauge naald is gedurende 1 - 2 h bij kamertemperatuur T, dan stukken 1 mm vierkant zijn gesneden uit de Amebocyte aggregaat met een steriele 18 gauge naald en zijn ingeklemd tussen twee coverglasses of een dekglaasje en een glijbaan van elkaar gescheiden door fragmenten van coverglasses op te treden als afstandhouders. Na ongeveer een half uur, te beginnen amebocytes migratie van de periferie van het explantatie op het dekglaasje (Fig. 6a), waar ze kunnen worden bekeken met fase-contrast-of DIC optiek ^21. In eerste instantie, de migrerende cellen zijn compact met hyaline pseudopods (Fig. 6b (m)), die worden uitgebreid boven de migratie substraat, en die vervolgens worden neergelaten in contact met het oppervlak en voorwaartse beweging gaat de stroom van de granulaire cytoplasma in de pseudopod ²² . Later, de cellen plat (Fig. 6b (f)) en start degranulatie (Fig. 6b (d)) en ophouden motoriek ^23. De cultuur kamer hier beschreven kan de doorbloeding van verschillende experimentele agenten in de cultuur kamer om te onderzoeken hun effecten op celbeweeglijkheid en granulaat exocytose ^9. Een uitgebreide methodologische toetsing van Amebocyte cultuur voor microscopisch onderzoek kan worden gevonden in ^24.
   
   
   
   Figuur 6
   
   

Het onderhoud van de volwassen hoefijzer krabben in het aquarium

Degenkrabben vereisen een hoge kwaliteit zeewater en kan worden gehandhaafd in aquaria voorzien van een water zuiveringssysteem dat deeltje filtratie, beluchting, en denitrificatie van het water ^{25 landen} biedt. Dieren moeten worden gevoederd 2 of 3 keer per week op garnalen, kreeft, vis of inktvis. Voeren wordt bereikt door het verwijderen van het dier uit het aquarium, plaCing hem op zijn rug, en het plaatsen van het voedsel op de mond. Indien honger, zal het dier binnenkort beginnen slikken het eten. Afhankelijk van de verfijning van het zeewater systeem, moet het dier worden gehandhaafd voor een uur of zo tot het ontlasting in een aparte container van het zeewater of het kan worden teruggebracht naar het aquarium na het voeren is begonnen. Voor de lange termijn onderhoud, moet het dier weg worden gehouden van het licht aan de groei van groen of blauw-groene algen te voorkomen dat op het oppervlak van de schaal. Algen eroderen het schild en omdat de volwassene niet vervellen, dit zal de dood veroorzaken aan het dier ^26. In het wild, de dieren een groot deel van de tijd gedeeltelijk ingegraven in het zand, maar zand of grind in het aquarium presenteert een moeilijkheid bij het handhaven van het niveau van de reinheid van belang voor de lange termijn onderhoud.

Discussie

Er zijn vier soorten hoefijzer krab, Limulus polyphemus van de oostkust van Noord-Amerika en drie soorten die variëren van Japan naar de Golf van Bengalen. Het dier wordt geïdentificeerd als een 'levend fossiel', omdat anatomisch soortgelijke vormen zijn gevonden als fossielen van 445 miljoen jaar geleden ^27. Het hoefijzer krab is een langlevende dieren, die 10 tot 13 ​​jaar om volwassen te worden en leven minstens 20 jaar ^28. Hoewel het is onderworpen aan een uitgebreide oogsten als aas voor de paling...