Druk polijsten pipetten voor verbeterde patch-clamp opnemen

Samenvatting

Dit is een gids voor het wijzigen van de vorm van glas micropipetten. In het bijzonder door gebruik te maken van warmte en luchtdruk van de taper is verbreed zonder verhoging van de tip opening, wat leidt tot een lagere weerstand pipet. Dit is essentieel voor het lage geluidsniveau opnamen van kleine cellen te verkrijgen, maar is nuttig in tal van toepassingen.

Samenvatting

Druk-polijsten is een methode voor het vormgeven van glazen pipetten voor de patch-clamp opname. We hebben eerst ontwikkelde deze methode voor het vervaardigen van pipetten geschikt voor het opnemen van kleine (<3 m) neuronale cellichamen. Het basisprincipe is vergelijkbaar met glasblazen en combineert de luchtdruk en warmte te wijzigen de vorm van de patch pipetten voorbereid door een conventionele micropipet trekker. Het kan worden toegepast op de zogenaamde soft (soda lime) en hard (borosilicaat) bril. In het algemeen, de druk polijsten kan verminderen pipet weerstand met 25% zonder het verminderen van de diameter van de tip opening (Goodman en Lockery, 2000). Het kan worden toegepast op vrijwel elk type van glas en vereist slechts de toevoeging van een hoge druk ventiel en passend bij een microforge. Deze techniek is essentieel voor het opnemen van ultrakleine cellen (<5 m) en kan single-channel recording ook verbeteren door het minimaliseren van pipet weerstand. De stompe vorm is ook nuttig voor geperforeerde-patch clamp opnamen, omdat deze tip vorm resulteert in een groter membraan blaar beschikbaar voor perforatie.

Protocol

Pulling pipetten

Met behulp van een gloeidraad trekker, zoals een Sutter P-97 Flaming / Brown micro-elektrode Puller, trek een set van ongeveer 10-20 pipetten.

1. Kies uw glas. We maken gebruik van borosilicaat (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Zorgvuldig op te slaan, zodat het glas blijft schoon en stofvrij.
2. Ontwerp een programma te trekken. Het primaire doel is een tip opening van ongeveer de gewenste grootte, dat zal afhangen van de toepassing. Sutter's P-97 Pipetteer Cookbook ² is een uitstekende referentie.
3. Observeer uw pipetten onder een microscoop om de opening met een diameter en gladheid te bepalen. Gooi ruw, oneffen of onregelmatig tips. Voor standaard patch-clamp-opname, een tip opening die is 2-4 um over is het beste. Een stompe punt leidt tot een weerstand lager voor dezelfde opening diameter, die de voorkeur heeft. Vorm en grootte kan worden gewijzigd tijdens het polijsten, hieronder.

Druk polijsten pipetten

1. Bevestig een pipet houder een schone, gecomprimeerde lucht lijn. Met behulp van een regulator, die de samengeperste lucht de druk op de ~ 40 PSI. Sluit de perslucht lijn naar een 4-weg regelklep die het mogelijk maken de pipet houder druk om in-en uitgeschakeld. Sluit een pipet houder de regelklep met een lengte van ⅛ in Tygon ® buizen.
2. Gebruik een polijsten rig (microforge) met een hoge druk pipet houder, een polijst spoel bestuurd door een voet-pedaal, een microscoop is uitgerust met een lage en hoge vergroting, lange werkdagen afstand (ideaal, 10x en 100x) lucht doelstellingen. Het is cruciaal om te kunnen de pipet opening observeren tijdens het protocol.
3. Optioneel: Coat de pipet met een hydrofoob isolatiemateriaal om de capaciteit te verminderen en verbeteren van geluid kenmerken (zie "Pulling pipetten" voor deze techniek).
4. Controleer of de druk klep in de uit-stand. Plaats een pipet in de pipet houder en draai de fitting tot handvast.
   
   Veiligheid opmerking: Als de pipet wordt strak gehouden in de pipet houder, de luchtdruk zorgt ervoor dat de pipet worden uitgeworpen uit de pipet houder.
   
   
5. Plaats de pipet en houder in de microforge. Plaats de pipet houder op de microscoop podium, zodat zowel de tip en het polijsten spoel zichtbaar bij lage (10x) macht op het microforge. Breng de tip ~ 75 micron uit de gloeidraad. Houd er rekening mee dat de gloeidraad zal uitbreiden bij verhitting.
6. Schakel over naar het hoge vermogen (100x) doelstelling. Zowel de pipetpunt en het polijsten spoel moet in focus en op het gebied van weergave. Zo niet, stel de hoogte van het polijsten spoel. (De pipet positie kan niet worden aangepast). De pipet tip en polijsten coil moet dicht bij tegenoverliggende zijden van het gezichtsveld. Vermijd het plaatsen van de spoel te dicht bij de pipetpunt want het zal zich uitbreiden naarmate deze warmer en bump in je pipet.
7. Draai de afsluiter onder druk lucht direct in de pipet, en verwarm de pipetpunt totdat de conus achter de punt begint te ballon naar buiten.
8. Stop het verwarmen voordat de tip ballonnen ook uitgebreid. Experimenteren is nodig om de juiste afstand, warmte, en de tijd te bepalen voor de gewenste vorm.
9. Optioneel: Verminder de tip opening met een diameter van polijsten van de tip in de afwezigheid van druk. Stap 7 en 8 kan herhaald om fine-tunen zowel de vorm en afmetingen van de pipetpunt.
10. Schakel de druk en ingedrukt terwijl u de pipetpunt in een veilige richting, verwijder de pipet en plaats het in een schone bewaardoos waar het zal worden beschermd tegen stof.
    
    Veiligheid opmerking: Als de luchtdruk is niet uitgeschakeld, de pipet kan worden uitgeworpen uit de pipet houder tijdens het verwijderen.

Opmerkingen over de microforge

We maken gebruik van een microforge samengesteld uit off-the-shelf commercieel verkrijgbare onderdelen. (U kunt een druk polijsten kit ook kopen van een paar bedrijven, bijvoorbeeld, ALA Science, GlassWorx). Ongeacht de microforge, is het essentieel om zijn optiek die goed genoeg is om de tip opening, die vaak slechts een paar micrometer in diameter te zien. We maken gebruik van een lange-werkafstand 100x lens voor dit doel. Ook vacht het polijsten spoel met hoge smelttemperatuur glas te minimaliseren storten verdampte metaal op de pipetten.

Deel 3: de verwachte resultaten

Matige druk polijsten kan verminderen de weerstand van een pipet, zonder een merkbare verandering in de opening diameter. Indien gewenst kan dit protocol worden gebruikt om de pipetten te maken met sub-micron openingen en weerstanden tussen de 5-10MΩ.

Discussie

We oorspronkelijk ontwikkelde deze methode om pipetten nuttig voor patch-clamp opnamen 2-3 um neuronen in C. elegans ^1. Het is in routine gebruik in het laboratorium Goodman. Wij druk polijsten pipetten niet alleen voor het opnemen van de kleine C. elegans neuronen, maar ook voor het verkrijgen van macropatch en single-channel opnames van ionenkanalen, uitgedrukt in Xenopus oöcyten. Voor een gegeven tip-opening met een diameter, de stompe vorm zorgt voor een lagere weerstand pipet. Lagere pipet weerstand leidt t...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glazen capillairen	Verbruiksartikel	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (of vergelijkbaar)	De methode werkt met elk type capillair, behalve die gemaakt van kwarts. We raden echter aan om capillairen met een filament te gebruiken.
Inverteerde microscoop	Microscoop	Leica Microsystems	DM IL (of vergelijkbaar)	Elke eenvoudige geïnverteerde microscoop is voldoende. Het is echter essentieel om voldoende vergroting te hebben om de pipetten tijdens het polijsten te kunnen zien. Wij gebruiken hiervoor een metallurgische 100x lens met een grote werkafstand.
Microforge-set	Instrument	ALA Science	CPM-2	Bevat polijstspoel, controller en voetpedaal.
Luchtdrukbron	Instrument	ALA Science	PR-60	Accessoire voor het leveren van hoge druk, inclusief een geschikte klep. Alternatief kan perslucht uit het gebouw worden gebruikt in combinatie met een filter/regelaar (ingesteld op 40 PSI) en een 4-wegkraan (zie hieronder).
4-wegkraan	Instrument	Cole-Parmer	A-98150-01	Koppelstukken zijn nodig om de kraan aan de slang aan te sluiten.
Pipethouder met Luer-connector	Instrument	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Gebruik een mannelijke luer-naar-knikfitting om de pipethouder aan de hogedrukslang te koppelen.
Tygon® slang	Instrument	Cole-Parmer	06408-62	Gebruik deze slang om de pipethouder aan de 4-wegkraan te koppelen.