Hier presenteren wij een methode om te isoleren en cultuur cerebellaire granule neuron progenitor cellen en cerebellaire korrel neuronen van postnatale muis.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en Cultuur van Post-Natal Mouse Cerebellaire Korrel Neuron progenitor cellen en Neuronen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De cerebellaire cortex is een goed beschreven structuur die unieke kansen voor het bestuderen van neuronale eigenschappen en ontwikkeling 1,2 biedt. Van de cerebellaire neuronale types (granule cellen, Purkinje cellen en remmende interneuronen), granulaat neuronen zijn veruit de meest talrijke en zijn de meest voorkomende vorm van neuronen in de hersenen van zoogdieren. Bij knaagdieren, zijn de kleine hersenen korrel neuronen die tijdens de eerste twee postnatale week van progenitor cellen in de buitenste laag van de cerebellaire cortex, de externe korrel laag (EGL). Het protocol beschrijft hier gepresenteerde technieken te verrijken en cultuur korrel neuronen en hun stamcellen uit post-natale muis cerebellum. We beschrijven de procedures aan culturen van toenemende zuiverheid 3,4, die kan worden gebruikt om de differentiatie van prolifererende progenitorcellen in de granule neuronen 5,6 studie te verkrijgen. Zodra de progenitor cellen differentiëren, de culturen ook een homogene populatie van korrel neuronen zorgen voor experimentele manipulatie en karakterisering van fenomenen zoals synaptogenese, glutamaat receptor functie 7, interactie met andere gezuiverde cerebellaire cellen 8,9 of celdood 7.
Protocol
Deel 1: Het opzetten van (1-2 dagen vóór versnijding) (niet getoond op de video)
- VOORBEREIDEN CULTUUR OPLOSSINGEN EN MEDIA:
- 4X CMF-PBS-EDTA (calcium en magnesium vrij-fosfaat gebufferde zoutoplossing-EDTA voor Percoll verdunningen): per liter, voeg 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g glucose, 2 g NaH 2 PO 4, 1 g KH 2 PO 4, 8 ml 2% NaHCO 3 voorraad, 10 ml 1 M EDTA (pH 8,0) om gedestilleerd / gedemineraliseerd water. Zet het volume op 1 liter en de pH op 7,4. Filter steriliseren.
- HBSS-GLUCOSE: Voeg glucose (6 gram / liter) voor calcium en magnesium vrij Hank's Balance Salt Solution (HBSS) en ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol is gebaseerd op de wijzigingen van de procedures die zijn beschreven in het verleden 3,7,11. Er zijn een aantal belangrijke punten om op te merken, zoals hieronder besproken.
De korrel neuronen en progenitor cellen zich binnen 2 uur in de platen. Gezonde cellen hebben een ronde morfologie onder de fase-contrast microscoop 4. Binnen 24 uur na plating, zullen gezonde cellen verspreid over heel de dekglaasjes of het plastic goed en vormt processen. Op het moment van het eerste medium te veranderen, na.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Wij danken Barbara Carletti en Anna Marie Kenney voor waardevolle suggesties. HYL wordt ondersteund door de Training Grant "Hormonen: Biochemie en Moleculaire Biologie ', DK07328. Mede ondersteund door NIH subsidie 5R01 NS16951 (CAM).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Celzeef met 70μm maaswijdte | BD Biosciences | 352350 | |
| Spinale naald | BD Biosciences | 405182 | 20G x 3-1/2 inches |
| Poly-D-Lysine molgew. >300,000 | Sigma-Aldrich | P1024 | Elke nieuwe batch Poly-D-Lysine moet worden getest. |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P-1644 | |
| Penicilline-Streptomycine (100X) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Moet calcium- en magnesiumvrij zijn. |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | |
| B-27 serumvrij supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| 12-mm ronde dekglasjes | Carolina Biological | 63-3029 | Deze worden in Duitsland gemaakt door Deckgluder. |
| 25-mm ronde dekglasjes | Carolina Biological | 63-3037 | Deze worden in Duitsland gemaakt door Deckgluder. |
| Papain dissociatiesysteem | Worthington Biochemical | LK 003150 | Kit is geschikt voor vijf isolaties. |
| Permaset scharen | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6782 | |
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4978 | |
| 4-wells kweekplaat | Nalge Nunc international | 176740 | |
| 6-wells kweekplaat | Nalge Nunc international | 140685 |
Referenties
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton. (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. in Culturing Nerve Cells<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
