Analyse van de Fysiologische E-selectine-Mediated Leukocyte Rolling op microvasculaire endotheel

Deze video demonstreert de analyse met een parallelle plaatstroomkamer om de factoren te onderzoeken die het rollen van leukocyten op endotheliale celoppervlakken triggeren. Endotheliale cellagen worden gestimuleerd met het pro-inflammatoire cytokine IL one beta om de expressie van S selectine op te reguleren. De parallelle plaatstroomkamer wordt vervolgens over de endotheliale cellen geplaatst en S selectine-positieve leukocyten worden over de cellaag geïnfuseerd.

De cellulaire interacties in de kamer worden zodoende blootgesteld aan schuifspanning die vergelijkbaar is met die bij leukocyte-adhesie in postcapillaire venen. Rolbewegingen worden vastgelegd en geteld met behulp van NIS-elementen en een assay voor E-selectine-onafhankelijkheid. Hallo, ik ben George Weis uit het laboratorium van dr. Charles de Nitro van de afdeling Dermatologie van het Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Vandaag tonen we u een procedure voor het analyseren van de rol van e-selectine en E-selectine-liganden bij de adhesie van humane leukocyten aan humane endotheelcellen uit het beenmerg onder fysiologische bloedstroomcondities. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de rol te bestuderen van celoppervlaktemoleculen die de adhesie van witte bloedcellen of metastatische kankercellen aan endotheelcellen, die het binnenoppervlak van bloedvaten bekleden, initiëren. Deze adhesiegebeurtenis wordt gekenmerkt door een rollend gedrag, vergelijkbaar met een bowlingbal die over een baan rolt.

Laten we beginnen. De eerste stap in deze procedure is het voorbereiden van de endotheelcellen die de flowkamer zullen bekleden. In dit protocol worden H-B-M-E-C 60-cellen gebruikt, afgeleid van menselijk beenmerg.

Kweekschalen voor microvasculatuur moeten vooraf worden gecoat met fibronectine; bereid deze door 35 milliliter weefselkweekschalen te incuberen met PBS dat 20 micrograms per mil fibronectine bevat. Deze kunnen overnacht worden geïncubeerd bij vier degrees Celsius of gedurende drie uur bij 37 degrees Celsius. Suspendeer H-B-M-E-C 60 cellen in medium 1 99 en zaai deze uit op 10 to the fifth cellen per schaal, en laat de culturen groeien tot over 90% confluentie.

Dit proces duurt ongeveer twee dagen om de expressie van E-selectine op te reguleren. Aspireer het groeimedium en voeg vers medium toe met 50 ng/ml IL-1β; incubeer dit gedurende vier tot zes uur. De cellagen zijn nu gereed voor de flow chamber assay. Aanvullende platen met HBMEC-60-cellen kunnen worden gestimuleerd met IL-1β en behandeld worden met een neutraliserend anti-humaan E-selectine-antilichaam in een concentratie van 20 µg/ml gedurende één uur bij 37 °C.

Dit dient ter controle voor de functionele expressie van e-selectine. Bereid vervolgens de e-selectine-positieve leukocyten voor. Dit zijn KG-1A menselijke hematopoëtische progenitorcellen.

Deze worden in suspensie gekweekt tot confluentie of tot een concentratie van 10⁶ cellen per ml in RPMI 1640. De KG-1A-cellen kunnen direct uit de kweek gepipetteerd en geteld worden met een hemocytometer. Resuspendeer de cellen tot 10⁶ cellen per ml in HBSS met 10 mM HEPES of HH-buffer die 2 mM calciumchloride bevat.

Bewaar de cellen op ijs totdat ze worden geanalyseerd. De volgende stappen omvatten het voorbereiden van de microscoop, de parallelle plaatstroomkamer en de spuitenpomp. Zet voor de analyse de microscoop en de spuitenpomp aan.

Selecteer het 10x-objectief op de microscoop. Plaats een conische buis van 50 milliliter in de houder en vul deze met HH-buffer met twee millimolar calciumchloride. Plaats vervolgens plastic reageerbuisjes van vijf milliliter in de houder eronder.

Plaats vervolgens een spuit van 60 milliliter in de spuitpomp. Controleer of zowel de zuiger als het lichaam van de spuit stevig vastzitten. Bevestig een driewegkraan aan het uiteinde van de 60 mil spuit en sluit vervolgens een spuit van vijf mil aan op de driewegkraan.

Plaats de parallelle stroomkamerapparatuur op de microscooptafel met de inlaatbuis aan de rechterkant, de uitlaatbuis aan de linkerkant en de vacuümbuis aan de achterzijde. Nadat de slang aan het vacuüm is aangesloten, opent u het luchtventiel zodat de parallelle plaatapparatuur aan de tafel hecht. Hiermee wordt getest of de vacuümmans van de stroomkamer luchtdicht is.

Wanneer de afdichting is bevestigd, sluit u het luchtventiel. Bevestig nu de uitlaatslang aan de driewegkraan die al met de spuit is verbonden. De apparatus is nu klaar om over de H-B-M-E-C 60 cellen te worden geplaatst.

Zet het vacuüm aan, laat de stroomkamerapparatuur voorzichtig op de plaat zakken en laat de apparatuur aanzuigen. Er mogen geen geluiden van ontsnappende lucht hoorbaar zijn; op dit punt is het mogelijk nodig om druk op de kamer uit te oefenen om de rubberen pakking samen te persen. Zodra het vacuüm is gevestigd, plaatst u de toevoerbuis in de 50 milliliter conische buis.

Open de driewegkraan naar de spuit van 60 µL en zet de pomp in de pompmodus om lucht uit de leidingen te verwijderen zonder de cellen op de plaat op te tillen. Gebruik de spuitenpomp, ingesteld op twee µL per minuut, om de inlaatslang te vullen. Zet deze vervolgens snel op 0,5 µL per minuut.

Vlak voordat de vloeistof het apparaat bereikt, is het van cruciaal belang om de opstelling zorgvuldig te primen en luchtbellen te vermijden, omdat deze de monolayer van de plaat kunnen tillen. Zodra de vloeistof in de 60 mil spuit stroomt, zijn de stroomkamer en de spuitpomp geprimed. Bevestig vervolgens de stroomkamer aan de tafel door een stuk plakband over elk van de inlaat-, uitlaat- en vacuümlinies te plakken.

Dit zorgt ervoor dat het gezichtsveld constant blijft bij het visualiseren en verzamelen van de gegevens. De doorstroomkamer is nu gereed voor gebruik. Deze stappen moeten worden herhaald voor elke run van celinput en voor elke nieuwe plaat.

Om Lucas site rolling-gebeurtenissen vast te leggen, opent u NIS elements op het bureaublad en klikt u op het afspeelpictogram voor een live-beeld. De automatische belichting stelt u in staat om de plaat te zien en het beeld scherp te stellen. Zorg ervoor dat de microscoop correct is gefocust op de cellaag door de focus handmatig op de microscoop aan te passen.

Zodra het beeld scherp is gesteld, zet u de belichting terug naar één frame per seconde en stelt u het licht op de microscoop in. Het beeld moet op de computer verschijnen en mag niet langer zichtbaar zijn in de microscoop. Het lichthistogram kan vervolgens worden aangepast. Om achtergrondbelichting te verwijderen of de helderheid van de cellen te verbeteren, klikt u op "two by two bin" of "live bin" om een beeld te verkrijgen dat ideaal is voor videopopname.

Klik op macro in de menubalk en selecteer right to port, selecteer poort com drie en open. Hiermee wordt de poort geopend om te coördineren met de spuitpomp. De stroomkamer is nu klaar voor infusie met KG1-A-cellen; pipetteer 1 ml KG1-A-suspensie in de reageerbuis van 5 ml nabij de toevoerleiding.

Plaats vervolgens de invoerlijn onderin de reageerbuis. Ga naar de menubalk en klik op capture en time lapse acquisition. Selecteer het protocol met een duur van 210 seconden.

Dit is de lengte van het programma voor het rollen op H-B-M-E-C 60-cellen. Elke fase is geprogrammeerd om elke seconde een foto te maken gedurende de duur van het pompprotocol. Het is ook zo ingesteld dat er een commando via de comm drie-poort wordt verzonden om de pomp te starten.

Zet de spuitpomp in de programmamodus, waarmee handmatige programmering van specifieke stroomsnelheden mogelijk is. Dit bepaalt de schuifspanningsniveaus in de kamer en dicteert de interacties van KG one A-cellen over de H-B-M-E-C 60-cellen. De instellingen voor deze interacties zijn 4,2 dines per centimeter squared gedurende 45 seconden.

Drie dyne per vierkante centimeter gedurende 60 seconden, waarbij de stappen elke 15 seconden toenemen tot een maximum van 4,2 dyne per vierkante centimeter. De microscoop en computer zijn nu klaar voor het maken van time-lapsefotografie. Druk op 'start run' op de computer om te beginnen met het verzamelen van gegevens terwijl het programma wordt uitgevoerd.

Zorg ervoor dat er medium wordt toegevoegd aan de buis met KG one A-cellen om de in- en uitlaatslangen gevuld te houden met medium en te voorkomen dat er luchtbellen in het systeem terechtkomen. Als de time-lapse wordt onderbroken, stopt de pomp niet automatisch en moet deze opnieuw worden ingesteld. Druk op annuleren om terug te keren naar het live-beeld.

Een niet-gestimuleerde endotheelcellaag dient als negatieve controle voor dit experiment. Hiervoor worden KG-1A leukocyten in de flowkamer geïnfuseerd over onbehandelde HBMEC-60 cellen om te controleren op E-selectine-onafhankelijkheid; stimuleer de endotheelcellaag met IL-1β en infuseer de leukocyten over deze cellen om verder te controleren op effect-onafhankelijkheid. Behandel HBMEC-60 cellen met IL-1β en vervolgens met een anti-humaan S-selectine-antilichaam.

Analyse vervolgens de rollende leukocyten op deze cellen. Het rollen van cellen wordt niet alleen bepaald door S-selectine, maar ook door sialinezuurresiduen op het celoppervlak van de leukocyt. Om dit aan te tonen, worden de KG one A-cellen gedurende één uur bij 37 °C behandeld met 0,1 units per ml neuraminidase.

Analyse vervolgens de rolling-gebeurtenissen over gestimuleerde H-B-M-E-C 60-cellen. Glycoproteïnen op het leukocytenoppervlak zijn eveneens belangrijk voor celrolling. Dit kan worden aangetoond door de KG-1A-cellen gedurende één uur bij 37 °C te behandelen met 0,2 units per ml bromelaine, om ze vervolgens in de flowkamer te infuseren.

Nadat de tijdreeks is verkregen, zijn de gegevens klaar voor analyse. Sla de gegevens op, ga naar het tabblad 'measure' in de menubalk en selecteer 'defined threshold'. Verschuif de balken zodanig dat de gewenste cellen rood gekleurd worden, selecteer alle afbeeldingen en klik vervolgens op oké; de volledige time-lapse-reeks moet nu zijn aangepast, waarbij de rollende cellen rood zichtbaar zijn.

Ga naar 'measure' en selecteer 'restrictions'. Hiermee kan de gebruiker drempelwaarden voor objecten uitsluiten die geen rollende cellen representeren. Dit betreft voornamelijk achtergrondruis veroorzaakt door de H-B-M-E-C 60 monolaag; selecteer het gebied en voer de minimum- en maximumwaarden in die optimaal zijn voor de rollende leukocyten.

Herhaal deze stap voor elongatie en circulariteit. Selecteer measure en selecteer vervolgens create binary using restrictions. Dezelfde restrictiewaarden, die in de vorige stap zijn ingesteld, worden nu gebruikt om de NIS elements-software te optimaliseren voor het herkennen van rollende leukocyten op de monolaag van endotheelcellen. Ga terug naar measure, selecteer field data en selecteer vervolgens reset data.

Sluit het menu, keer terug naar 'measure' en selecteer 'scan field', open 'measure field data' en selecteer 'number or objects'. Selecteer vervolgens alle velden en exporteer de gegevens naar Microsoft Excel. Selecteer tot slot 'clear data'.

De NIS-elementen zijn nu klaar voor verdere gegevensverzameling. Deze representatieve gegevens laten zien hoe interacties tussen leukocyten en endotheelcellen reageren op fysiologische schuifspanning, waarbij specifiek de rol van het adhesieve ligand E-selectine wordt getest.

Robuust rollen van leukocyten vindt plaats wanneer endotheelcellen vooraf zijn gestimuleerd met IL-1β. Wanneer dit resultaat wordt vergeleken met de ongestimuleerde controle, is duidelijk dat het rollen van cellen afhankelijk is van cytokine-stimulatie. Door de HBMEC-cellen te behandelen met IL-1β en vervolgens met een anti-humane E-selectine-antilichaam, wordt duidelijk dat het rollen van de cellen specifiek afhankelijk is van E-selectine.

Deze assay kan ook worden gebruikt om andere parameters te testen. Wanneer gestimuleerde cellen bijvoorbeeld vooraf worden behandeld met een sase of met brolin, zijn de resultaten minder robuust. Deze gegevens benadrukken het belang van terminale sialinezuurresiduen evenals glycoproteïnen op het celoppervlak.

Wat betreft de ligandactiviteit van S-selectine: we hebben zojuist aangetoond hoe u adhesieve interacties op basis van E-selectine tussen leukocyten en endotheelcellen kunt analyseren onder omstandigheden die de krachten nabootsen die aanwezig zijn in een postcapillaire venule, de regio van het circulatiesysteem waar leukocyten het bloed verlaten en de weefsels binnendringen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de juiste blokkerende antilichamen of enzymatische behandelingscontroles moeten worden gebruikt om de noodzaak van de betreffende selectine en het ligand in dit assaysysteem te valideren. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.