Analyse van de Fysiologische E-selectine-Mediated Leukocyte Rolling op microvasculaire endotheel
February 11th, 2009
Dit rapport geeft een visuele voorstelling van de parallelle plaat stroom kamer analyse voor het bestuderen van leukocyten endotheliale interacties onder fysiologische shear stress. Deze methode is vooral nuttig voor het onderzoeken van de rol van het endotheel (E)-selectine en leukocyten E-selectine liganden die leiden tot leukocyten rollen op de endotheliale cellen oppervlakken.
Deze video demonstreert de analyse van parallelle plaat-flowkamer voor het onderzoeken van de factoren die leukocytenrollen op endotheelceloppervlakken activeren. Endotheelcelmonolagen worden gestimuleerd met de pro-inflammatoire cytokine IL één bèta om S-selectine-expressie te verhogen. De parallelle plaat-flowkamer wordt vervolgens over de endotheelcellen geplaatst en S-selectine-positieve leukocyten worden over de monolaag geïnfuseerd.
De cellulaire interacties in de kamer worden dus geïmpregneerd met een zuivere stress die vergelijkbaar is met die in postcapillair leukocyt-adhesie. Rolling-gebeurtenissen worden vastgelegd en genummerd met behulp van NIS-elementen en een assay voor E-selectine-onafhankelijkheid. Hallo, ik ben George Weis in het laboratorium van Dr. Charles de Nitro in de afdeling Dermatologie van Brigman Women's Hospital, Harvard Medical School.
Vandaag laten we u een procedure zien voor het analyseren van de rol van e-selectine, E-selectine-liganden in de adhesie van humane leukocyten aan humane beenmerg-endotheelcellen onder fysiologische bloedstroomomstandigheden. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de rol van celoppervlaktemoleculen die de adhesie van witte bloedcellen of uitgezaaide kankercellen aan endotheelcellen, die de binnenoppervlakte van bloedvaten bekleden, bestuderen. Dit kleefgebeurtenis wordt gekenmerkt door een rollend gedrag zoals een bowlingbal die een baan af rolt.
Dus laten we beginnen. De eerste stap in deze procedure is het voorbereiden van de endotheelcellen die de flowkamer zullen bekleden. Dit protocol gebruikt H-B-M-E-C 60-cellen afgeleid van menselijk beenmerg.
Microvatencultuurschotels moeten worden voorgecoat met fibronectine om deze voor te bereiden. Behandel 35 milliliter weefselcultuurschotels met PBS dat 20 microgram per duizend van fibronectine bevat. Deze kunnen worden bewaard overnacht bij vier graden Celsius of drie uur bij 37 graden Celsius. Suspendeer H-B-M-E-C 60-cellen in medium 1 99 en zaai bij 10 tot de vijfde cellen per schaal, laat de culturen groeien tot meer dan 90% confluentie.
Dit duurt ongeveer twee dagen om e-selectine-expressie te verhogen, aspireer het groeimedium en voeg vers medium toe met 50 nanogram per duizend van IL één bèta en bewaar het gedurende vier tot zes uur. Celmonolagen zijn nu klaar voor de flowkamertest. Aanvullende platen van H-B-M-E-C 60-cellen kunnen worden gestimuleerd met IL één bèta en behandeld met neutraliserend anti-mens e-selectine-antilichaam bij 20 microgram per duizend gedurende één uur bij 37 graden Celsius.
Dit zal de functionele expressie van e-selectine controleren. Bereid vervolgens de e-selectine-positieve leukocyten voor. Dit zijn KG één a humane hematopoëtische voorlopercellen.
Deze worden gekweekt in suspensie tot confluentie of tot de zes cellen per duizend in RPMI 1640. De KG één A-cellen kunnen direct vanuit de cultuur worden gepipetteerd en geteld op een hemo-cytometer. Resuspensie de cellen bij 10 tot de zes cellen per duizend in HBSS met 10 millimolair hep of HH-buffer dat twee millimolair calciumchloride bevat.
Bewaar de cellen op ijs tot ze worden geanalyseerd. De volgende stappen omvatten het voorbereiden van de microscoop, de parallelle plaat-flowkamer en de spuitpomp. Zet voor de test de microscoop en de spuitpomp aan.
Selecteer het 10 x objectief op de microscoop. Plaats een 50 milliliter conische buis in de houder en vul deze met HH-buffer met twee millimolair calciumchloride. Plaats vervolgens vijf milliliter plastic testbuisjes in de houder eronder.
Plaats vervolgens een 60 milliliter spuit in de spuitpomp. Zorg ervoor dat zowel de zuiger als het lichaam van de spuit veilig zitten. Bevestig een driewegstopkraan aan het uiteinde van de 60 ml-spuit en vervolgens een vijf ml-spuit aan de driewegstopkraan.
Plaats de parallelle flowkamer-inrichting op de microscoopstandaard met invoerbuis aan de rechterkant, uitvoerbuis aan de linkerkant en vacuümbuis aan de achterkant. Nadat de slangen zijn aangesloten op het vacuüm, opent u de luchtklep om de parallelle plaatinrichting aan de standaard te laten hechten. Dit zal testen of de vacuümrok op de flowkamer luchtdicht is.
Wanneer de verzegeling is bevestigd, zet u de luchtklep uit. Bevestig nu de uitvoerbuislijn aan de driewegstopkraan die al met de spuit is verbonden. De inrichting is nu klaar om over de H-B-M-E-C 60-cellen te plaatsen.
Schakel de vacuüm in, laat de flowkamerinrichting voorzichtig op de plaat zakken en laat de inrichting zuigen. Er mogen geen geluiden van ontsnapte lucht zijn en op dit punt moet u mogelijk druk op de kamer uitoefenen om de rubberen afdichting te comprimeren. Zodra het vacuüm is vastgesteld, plaatst u de invoerbuis in de 50 milliliter conische buis.
Open de driewegstopkraan naar de 60 ml-spuit en plaats de pomp in de pompmodus om lucht uit de leidingen te verwijderen zonder de cellen op de plaat op te tillen. Gebruik de spuitpomp ingesteld op twee milliliter per minuut om de invoerbuis te vullen. Stel vervolgens snel in op 0,5 milliliter per minuut.
Net voordat de vloeistof de inrichting bereikt, is het van cruciaal belang om de setup zorgvuldig te primen en luchtbellen te vermijden, die de monolaag van de plaat zullen tillen. Zodra de vloeistof in de 60 ml-spuit beweegt, zijn de flowkamer en de spuitpomp voorbereid. Bevestig nu de flow in de kamer aan de standaard met een stukje tape over elk van de invoer-, uitvoer- en vacuümlijnen.
Dit zorgt ervoor dat het gezichtsveld constant blijft bij het visualiseren en verzamelen van de gegevens. De flowkamer is nu klaar voor gebruik. Deze stappen moeten worden herhaald voor elke celinputrun en voor elke nieuwe plaat.
Om Lucas-site-rolgebeurtenissen vast te leggen, opent u NIS-elementen op het bureaublad, drukt u op het afspeelpictogram voor een live-afbeelding. Automatische be
Overzicht
Dit rapport biedt een visuele weergave van de analyse van parallel-plate flow chambers voor het bestuderen van leukocyte endotheliale interacties onder fysiologische afschuifspanning. Deze methode is bijzonder nuttig voor het onderzoeken van de rol van endotheliale (E)-selectine en leukocyte E-selectine liganden die leukocyte rolling op endotheliale celoppervlakken veroorzaken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Leukocyte rolling is een cruciale stap in de immuunrespons.
- Endotheelcellen spelen een sleutelrol bij het mediëren van leukocyte adhesie.
- Het begrijpen van deze interacties kan inzicht geven in ontstekingsziekten.
- Parallel-plate flow chambers simuleren fysiologische omstandigheden voor het bestuderen van deze processen.
Doel van het onderzoek
- Om de rol van E-selectine in leukocyte adhesie te analyseren.
- Om de interacties tussen leukocyten en endotheelcellen onder afschuifspanning te onderzoeken.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het uitvoeren van parallel-plate flow chamber assays.
Gebruikte methoden
- Bereiding van endotheelcelmonolagen met behulp van H-B-M-E-C 60 cellen.
- Stimulatie van cellen met IL-1 beta om E-selectine expressie op te reguleren.
- Infusie van E-selectine positieve leukocyten in de flow chamber.
- Capture en enumeratie van rolling gebeurtenissen met behulp van beeldverwerkingssoftware.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van leukocyte rolling op endotheelcellen.
- Demonstratie van de impact van E-selectine op leukocyte adhesie.
- Een betrouwbare methode vaststellen voor het bestuderen van leukocyte-endotheel interacties.
- Inzichten in de mechanismen van leukocyte rolling onder fysiologische omstandigheden.
Conclusies
- De parallel-plate flow chamber is een effectief hulpmiddel voor het bestuderen van leukocyte dynamica.
- E-selectine speelt een significante rol bij het mediëren van leukocyte rolling.
- Deze methode kan worden toegepast op verder onderzoek naar ontsteking en immuunrespons.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding E-selectin-mediated leukocyte rolling provides mechanistic insight into early inflammatory processes, supporting target validation for anti-inflammatory therapeutic development. This physiologic flow-based assay enables quantitative assessment of endothelial-leukocyte interactions under controlled shear stress, improving predictive confidence in target engagement and pathway modulation. The method supports preclinical de-risking by isolating the contribution of specific adhesion molecules in a disease-relevant microvascular context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the functional role of E-selectin in leukocyte recruitment, enabling hypothesis testing of inflammatory pathway involvement.
- Operational Value: Provides a reproducible system to validate target specificity using blocking antibodies or enzymatic treatments.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by quantifying rolling frequency and shear resistance as functional readouts of target modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable outputs including rolling events per field and tethering efficiency under defined shear stress conditions.
- Reproducibility: Uses NIS-Elements software to define thresholds and restrict analysis to rolling leukocytes, minimizing subjectivity in data capture.
- Scalability: Enables repeated runs across cell lines and treatment conditions with consistent priming and vacuum sealing protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models leukocyte trafficking in cutaneous, bone, and inflamed tissues where E-selectin is constitutively or inducibly expressed.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes E-selectin-dependent from independent rolling using IL-1β stimulation and anti-E-selectin antibody controls.
- Translational Continuity: Links in vitro rolling behavior to in vivo extravasation, supporting biomarker alignment for leukocyte-endothelial adhesion pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, providing mechanistic insight into leukocyte-endothelial interactions that inform lead optimization and safety profiling.
- Discovery Biology: Tests the necessity of E-selectin and its ligands in leukocyte adhesion under physiologic shear, clarifying target function in inflammatory cascades.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts (rolling frequency, binding efficiency) that enable comparison across genetic or pharmacological perturbations.
- Analytics: Exports data to Excel for statistical analysis of shear-resistant adhesion, supporting dose-response and inhibitor profiling.
- Translational Research: Uses human bone marrow endothelial cells and hematopoietic progenitor cells to model clinically relevant leukocyte-endothelial interactions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying selectin-mediated adhesion across inflammation, immuno-oncology, and vascular biology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating E-selectin’s contribution to leukocyte rolling through controlled stimulation and inhibition.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized chamber preparation, shear stress profiling, and automated image analysis with NIS-Elements.
- Strategic Value: Improves target confidence by providing direct functional evidence of target-leukocyte interaction under near-physiologic conditions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-adhesion therapeutics based on quantitative inhibition of rolling under defined hemodynamic forces.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, cytokine stimulation, and microfluidic flow dynamics to maintain monolayer integrity and consistent shear stress.
- Depends on specialized instrumentation including parallel-plate flow chamber, syringe pump, and inverted microscope with video capture capability.
- Necessitates cross-team standardization of image analysis parameters (threshold, elongation, circularity) to ensure consistent rolling event quantification.
- Requires adaptation of leukocyte and endothelial cell models to reflect tissue-specific inflammation contexts (e.g., dermal vs. bone microvasculature).
- Limited to analyzing initial adhesion events; does not capture downstream processes like firm adhesion or transmigration without complementary assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:48
Introduction
1:36
Preparation of hBMEC Monolayer on Petri Dishes
3:03
Preparation of Human Hematopoietic Progenitor KG1a Cells
3:44
Preparation of Microscope, Parallel-Plate Flow Chamber and Syringe Pump
6:26
Capturing Leukocyte Rolling Events using NIS Elements
9:21
Dependence of Terminal Sialylation and Surface Glycoprotein for E-selectin-Mediated KG1a Cell Rolling
10:43
Analysis of NIS-Elements-Captured KG1a Cells and Graphing of KG1a Cell Rolling Data
12:27
Representative Results
13:35
Conclusion
