$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Het bepalen van een nauwkeurig aantal omgevingsbacteriën is essentieel voor het beoordelen van de gezondheid van een bodemecosystem. Dit kan worden bereikt door bacteriekolonies te kweken met geschikte verdunningen.
Bodembacteriën zijn een belangrijk onderdeel van een gezond bodemecosystem, waarbij ze een rol spelen in afbraak, stikstofbinding en voedselcycli. Oppervlaktebodems zijn een substraat van organische en anorganische deeltjes dat een complexe matrix vormt rond poriën die zich vullen met lucht of water. Deze omstandigheden creëren een ideaal ecosysteem voor bacteriën, waarbij oppervlaktebodems meestal meer dan een miljoen bacteriën per gram bevatten.
Vanwege deze hoge concentratie bacteriën is verdunning noodzakelijk voordat ze op kweekmedia worden geplaatst. Seriële verdunningen kunnen de concentratie van het oorspronkelijke bodemmonster verlagen tot niveaus die laag genoeg zijn om enkele kolonies op mediaplaten te laten groeien, waardoor de berekening van het aanvankelijke aantal bacteriën in het bodemmonster mogelijk wordt.
Deze video zal illustreren hoe seriële verdunningen van bodemmonsters worden bereid, hoe deze bacteriemonsters worden geplaatst en hoe bodembacterietellingen van de verdunningsplaten worden berekend.
Bacteriën zijn eenvoudige prokaryotische organismen, maar ze zijn zeer divers qua soorten en ecosystemen. Actinomyceten zijn een subset van bacteriën die vaak als een unieke groep worden beschouwd vanwege hun filamenteuze structuur, waarbij ze aan elkaar geregen zijn om hyfen te vormen.
Actinomyceten maken doorgaans 10% uit van de totale bacteriepopulatie in de bodem. Bacteriën en actinomyceten zijn overal op aarde in grote aantallen aanwezig, maar ze worden in ongekende diversiteit en abundantie in de bodem aangetroffen.
Bodembacteriën worden geteld en mogelijk gekweekt en geïdentificeerd door verdunningsplattering. Hierbij wordt een bodemmonster seriëel verdund in water en vervolgens verspreid op agar-kweekplaten. De resulterende kolonies worden vervolgens geteld. Deze waarde, samen met de verdunningsfactor, wordt gebruikt om de aanvankelijke concentratie bacteriën in de bodem te bepalen.
Verdunningsplattering is een veelgebruikte, goedkope en eenvoudige methode voor het tellen van bacteriën, maar het heeft ook enkele nadelen. De bodem mag niet bezinken tijdens verdunning, omdat dit tot bevooroordeelde groei kan leiden. Sommige bodembacteriën zullen niet op de platen kweken of te langzaam groeien om waar te nemen. Bovendien gaat deze methode ervan uit dat kolonies worden gevormd door een enkele bacterie, maar ze kunnen ook ontstaan uit groepjes van meerdere cellen.
Bepaalde bacteriesoorten groeien beter op verschillende kweekmedia. Een veelgebruikt substraat om een breed scala aan bacteriën te kweken, is een agar-pepton-gistplaat. Actinomyceten groeien bij voorkeur op platen op basis van glycerol-caseïne, die beter geschikt zijn voor de groei van deze filamenteuze bacteriën.
Nu u het concept achter het tellen van bacteriën begrijpt, laten we eens kijken hoe dit proces in het laboratorium wordt uitgevoerd.
Om de procedure te beginnen, weegt u 10 g bodemmonster af en voegt u dit toe aan 95 mL gedeïoniseerd water. Schud de suspensie goed en label als "A". Voordat de bodem bezinkt, verwijdert u 1 mL van de suspensie met een steriele pipette en brengt u deze over naar 9 mL gedeïoniseerd water. Vorm een vortex en label als "B".
Herhaal deze verdunningsstap 3 keer, elke keer met 1 mL van de vorige suspensie en 9 mL gedeïoniseerd water. Label deze sequentieel als buisjes C, D en E. Dit resulteert in seriële verdunningen van 10-1 tot 10-5 gram bodem per mL.
Om bacteriekolonies te laten groeien, neemt u 3 vooraf bereide pepton-gistagarplaten en labelt ze als C, D en E. Vorm een vortex van de overeenkomstige monsters en pipet 0,1 mL op elke plaat. Omdat CFU's per mL worden gerapporteerd, verhoogt het gebruik van 0,1 mL de verdunning met een factor tien.
Dompel vervolgens een glazen verspreider in ethanol. Plaats de verspreider enkele seconden in de vlam om het ethanol te ontsteken en af te branden. Dit steriliseert de verspreider.
Houd de verspreider boven de eerste plaat totdat de vlam is gedoofd. Open de plaat snel, met de deksel dichtbij. Raak de verspreider aan de agar aan om af te koelen en verspreid vervolgens de druppel inoculum over het oppervlak totdat er geen vrije vloeistof meer zichtbaar is. Plaats het plaatdeksel terug.
Ontsteek de verspreider opnieuw en herhaal het proces met de volgende plaat, snel werken om de plaat niet te besmetten met organismen in de lucht. Draai de platen om om te voorkomen dat vochtdruppels op de agar vallen en incubeer de platen een week op kamertemperatuur.
Om actinomyceten te kweken, neemt u drie vooraf bereide glycerol-caseïneplaten en labelt ze als B, C en D. Gebruik de eerder getoonde technieken om plaat 0,1 mL van de suspensies B, C en D te verspreiden. De lagere verdunningen worden gebruikt omdat actinomyceten doorgaans 1/10e van de bacteriepopulatie uitmaken.
Keerd deze platen om en bewaar ze twee weken op kamertemperatuur.
Na incubatie onderzoekt u alle bacterieplaten zorgvuldig en noteert u verschillen in koloniegrootte en -vorm. Wanneer ze op agar worden gekweekt, produceren bacteriën slijmige kolonies die variëren van kleurloos tot helder oranje, geel of roze. In tegenstelling daarmee zijn actinomycetische kolonies krijtachtig, stevig, leerachtig en breken ze onder druk, terwijl andere bacteriekolonies uitglijden. Dit maakt het mogelijk om kolonies te onderscheiden door aanraking met een steriele lus.
Tel en noteer het aantal bacteriekolonies, inclusief eventuele actinomyceten. Tel alleen platen met 30-200 kolonies per plaat.
Om culturen van specifieke individuele bacteriën te kweken, selecteert u discrete kolonies van een van de platen en
