Het kweken en tellen van bacteriën uit bodemmonsters

1. Voorbereiding van Bodemverdunningen

1. Weeg om het proces te beginnen 10 g bodemmonster af en voeg toe aan 95 ml gedeïoniseerd water. Schud de suspensie goed en label als “A”.
2. Voordat de bodem bezinkt, verwijder met een steriele pipette 1 mL van de suspensie en breng deze over naar een 9-mL blanco gedeïoniseerd water. Vortex grondig en label als “B”.
3. Herhaal deze verdunningsstap drie keer, elke keer met 1 mL van de vorige suspensie en een 9-mL gedeïoniseerd water blanco. Label deze achtereenvolgens als buisjes C, D en E. Dit resulteert in seriële verdunningen van 10^-1 tot 10^-5 gram bodem per mL

2. Het maken van spreidplaten voor bacteriecultuur

1. Neem voor het kweken van bacteriekolonies drie voorbereide pepton-gist-agar platen en label ze als C, D en E. Vortex monsters C, D en E en pipet 0,1 mL op elke plaat. Dit verhoogt de verdunningswaarde verder, met een factor tien (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
2. Dompel vervolgens een glazen spreider in ethanol. Plaats de spreider enkele seconden in een vlam om te ontsteken en het ethanol te verbranden. Dit zal de spreider steriliseren.
3. Houd de spreider boven de eerste plaat totdat de vlam is gedoofd. Open snel de plaat en houd het deksel dichtbij. Raak de spreider aan de agar aan om af te koelen en verspreid vervolgens de druppel inoculum over het oppervlak van de agar totdat sporen van vrij vocht verdwijnen. Plaats het deksel van de plaat weer terug.
4. Ontsteek de spreider opnieuw en herhaal het proces met de volgende plaat, werk snel om de agar niet te besmetten met in de lucht aanwezige organismen
5. Breng de bacterieplaten 1 week bij kamertemperatuur onder. Zorg ervoor dat de platen tijdens de incubatie omgekeerd zijn om te voorkomen dat druppels vocht door condensatie op het oppervlak van de agar vallen.

3. Het maken van spreidplaten voor actinomyceten

1. Neem om actinomyceten te kweken drie voorbereide glycerol-caseïne platen en label ze als B, C en D. Verspreid met behulp van de eerder getoonde technieken plaat 0,1 mL van de suspensies B, C en D. De lagere verdunningen worden gebruikt omdat actinomyceten typisch aanwezig zijn als 1/10^de van de bacteriepopulatie (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
2. Breng de actinomyceteplaten (omgekeerd) 2 weken bij kamertemperatuur onder.

4. Bacterie- en actinomycetetellingen

1. Na incubatie onderzoek alle bacterieplaten zorgvuldig en noteer verschillen in koloniegrootte en -vorm. Wanneer ze op agar worden gekweekt, produceren bacteriën slijmerige kolonies variërend van kleurloos tot fel oranje, geel of roze. In tegenstelling daarmee zijn actinomycetekolonies krijtachtig, stevig, leerachtig en breken ze onder druk, terwijl andere bacteriekolonies uitvloeien. Dit maakt het mogelijk om kolonies te onderscheiden door ze met een steriele lus aan te raken.
2. Tel en noteer het aantal bacteriekolonies, inclusief eventuele actinomyceten. Tel alleen platen met 30-200 kolonies per plaat.

5. Isolatie van zuivere culturen

1. Selecteer individuele bacteriekolonies van een van de platen. Er kunnen meer kolonies worden geselecteerd als er bijzondere interesse is in de bodem. Gebruik een plaat met hoge verdunning, omdat deze neiging heeft om zuivere kolonies te hebben die goed gescheiden zijn. Kies alleen kolonies die goed gescheiden zijn van naburige kolonies en morfologisch verschillend van elkaar lijken.
2. Steriseer de lus door deze in alcohol te dompelen en te ontsteken. Open snel de belangrijke petrischaal en raak de lus aan een kale plek in de agar om deze af te koelen. Neem vervolgens een kleine hoeveelheid van een interessante kolonie op de lus.
3. Neem een ​​friske pepton-gistplaat, maak een streek van een paar centimeter lang aan één kant. Steriliseer en koel opnieuw, maak vervolgens een streek die de eerste streek alleen kruist bij de eerste passage. Herhaal dit proces nog twee keer op dezelfde manier. Dit strijken als “verdunning” resulteert in cellen op de lus die van elkaar worden gescheiden. Plaats de plaat in een donkere ruimte om bij kamertemperatuur twee weken te incuberen.