Analyse van de bacteriegroeicurve en de toepassingen ervan in het milieu

Het meten van de groeisnelheid van bacteriën is een fundamentele microbiologische techniek, en heeft een brede toepassing in zowel fundamenteel onderzoek als in landbouw- en industriële toepassingen.

Bacteriën behoren tot de meest voorkomende levensvormen op Aarde, aanwezig in elk ecosysteem, inclusief het menselijk lichaam. Bepaalde bacteriesoorten zijn genetisch ook zeer toegankelijk, en zijn geïntegreerd als onderzoeksmodellen of om natuurlijke of synthetische producten op industriële schaal te produceren. Echter, niet alle bacteriesoorten kunnen in het laboratorium worden gekweekt. Voor die wel, is een belangrijke eigenschap de snelheid van vermenigvuldiging, of "groeicinetiek".

Het meten van de groeisnelheid van een bacteriecultuur kan wetenschappers informeren over hun fysiologische en metabolische functies, en is ook nuttig voor het verkrijgen van een nauwkeurig celgetal van de bacteriën voor downstream-toepassingen.

Deze video introduceert de principes achter de analyse van bacteriegroeisnelheid, demonstreert een protocol voor het karakteriseren van groeisnelheid met een "groeifasecurve", en verkent tenslotte verschillende toepassingen in de milieuwetenschappen voor het meten van bacteriegroeicinetiek.

Bacteriën reproduceren over het algemeen aseksueel, vermenigvuldigend door eenvoudige binaire deling waarbij een oudercel zich splitst in twee identieke dochtercellen. Onder gunstige groeiomstandigheden, waar voedingsstoffen in overvloed aanwezig zijn en omgevingsparameters zoals temperatuur allemaal bevorderlijk zijn voor groei, overtreft de vermenigvuldigingssnelheid verreweg de sterftesnelheid. Dit resulteert in exponentiële groei.

Door de hoeveelheid bacteriën in een cultuur als functie van de tijd te meten, kan een groeicurve worden verkregen. Groeiende bacteriën in een vloeibare cultuur onder optimale omstandigheden produceert een groeicurve met een karakteristieke vorm die in verschillende fasen kan worden verdeeld. De curve begint met een "latentiefase", wanneer de groei traag is terwijl de bacteriën zich acclimatiseren aan de cultuurcondities. Vervolgens is er de "log" of "exponentiële fase", wanneer de bacteriën exponentiële groei ervaren. Groei stagneert uiteindelijk wanneer de voedingsstoffen worden uitgeput en afvalproducten zich ophopen, wat resulteert in een "stationaire fase". Ten slotte, wanneer de vermenigvuldigingssnelheid wordt overschreden door de celdoodsnelheid, gaat de cultuur de "doodfase" in.

Om een groeicurve te construeren, worden bacteriegetallen in een flacon met vloeibare cultuur op verschillende tijdstippen gedurende een bepaalde kweekperiode geteld. Bacterietellingen kunnen op verschillende manieren worden verkregen. Een veelgebruikte aanpak is om de optische dichtheid - of "OD" - 600 te meten, wat de absorbantie van licht door de bacterieoplossing is bij een golflengte van 600 nm.

Een andere methode is om de "CFU", of kolonievormende eenheden, per milliliter van de cultuur te bepalen. Vanwege de klonale aard van bacteriegroei kan één bacterie in een cultuur zich theoretisch uitbreiden tot één waarneembare kolonie op een agarplaat. Door een reeks verdunningen van een bacteriecultuur te plateren om een bacterieconcentratie te bereiken waar individuele, discrete kolonies kunnen worden waargenomen, een methode genaamd "serieplatering", kan het kolonietelling worden gebruikt om de bacterieconcentratie terug te berekenen in termen van CFU per mL.

Nu je begrijpt hoe bacteriegroei kan worden geanalyseerd, laten we een protocol doorlopen voor het uitvoeren van groeicurve-analyse op pure culturen van een goed gevestigd bacteriemodel, Escherichia coli, met behulp van de seriële verdunningsplateringsmethode.

Eén dag voor het verzamelen van de tijdstippen, inoculeert u 20 mL voorgesteriliseerde trypticase sojabrood, of TSB, medium in een 50-mL flacon met een enkele kolonie van E. coli.

Incubeer de cultuur een nacht bij 37 °C met schudden. Voor E. coli zou dit resulteren in een stationaire populatie van ongeveer 109 CFU/mL.

De volgende dag, inoculeert u 100 μL van de overnachtelijke cultuur in 250 mL TSB in een 500-mL flacon. Meng goed door. Dit produceert een verdunde cultuur van ongeveer 4 x 105 CFU/mL. Bewaar 5 mL van deze verdunde cultuur in een kweekbuisje. Dit is de aliquot van tijdstip 0, of T0. Koel onmiddellijk bij 4 °C.

Incubeer het resterende volume van de cultuur bij 37 °C met schudden. Elke uur daarna gedurende maximaal 8 uur, verzamel 5-mL aliquots uit de cultuur. Bestem deze monsters T1 tot T8, en bewaar ze allemaal bij 4 °C tot gebruik.

Op de dag van het experiment, verwijdert u de E. coli tijdstip aliquots uit de koelkast en bewaart u ze op ijs. Gebruik steriele microcentrifugebuisjes, elk met 900 μL steriele zoutoplossing, om een verdunningsreeks voor elke aliquot in te stellen volgens de volgende tabel.

Meng de T0 cultuur goed door voorzichtig te vortexen, voeg vervolgens 100 μL toe aan Buis A van de verdunningsreeks, waardoor een 1-op-10, of 10-1 verdunning ontstaat. Vortex Buis A om te mengen, en gebruik een nieuwe pipettepunt om 100 μL van Buis A toe te voegen aan Buis B, waardoor de 1-op-100, of 10-2 verdunning ontstaat.

Herhaal het proces voor elke cultuuraliquot en maak de juiste verdunningsreeks volgens Tabel 2. Zodra de verdunningsreeksen voor alle tijdstipmonsters zijn gemaakt, laat dan het juiste aantal steriele trypticase soja-agarplaten voorbereiden voor het plateren van bacteriën.

3 verdunningsreeksen van elke tijdstipcultuur worden in drievoudig geplateerd volgens de volgende tabel. Label de platen dienovereenkomstig. Pipetteer vervolgens 100 μL van elke geschikt verdunde cultuur op het centrum van de respectieve agarplaat. Steriliseer een "L"-vormige glazen staaf met vlam, koel door de staaf tegen de agar aan te raken weg van het inoculum, en verspreid onmiddellijk de vloeistof over het agaroppervlak. Houd er rekening mee dat een vertraging in het verspreiden kan leiden