Algentelling via cultiveerbare methodologie
Bron: Laboratoria van Dr. Ian Pepper en Dr. Charles Gerba - The University of Arizona
Demonstrerende auteur: Bradley Schmitz
Algen zijn een zeer heter…
- Weeg een 10 g monster grond af dat ofwel vochtig uit het veld is verzameld, of waaraan water is toegevoegd zodat het 2-3 dagen vochtig blijft. Merk op dat de grond vochtig, maar niet verzadigd mag zijn.
- Bereid een 10-voudige verdunningsreeks voor door de 10 g grond toe te voegen aan 95 mL Gemodificeerde Bristol's Oplossing (Figuur 1). Om Gemodificeerde Bristol's Oplossing te maken, lost u het volgende op in 1.000 mL water: 0,25 g NaNO3, 0,025 g CaCl2, 0,075 g MgSO-4 · 7H2O, 0,075 g K2HPO4, 0,018 g KH2PO4, 0,025 g NaCl en 0,5 mg FeCl3.
- Vervolg de verdunningsreeks door 1 mL van Suspensie A toe te voegen aan 9 mL Bristol's Oplossing en aanvullende sequentiële verdunningen.
- Inoculeer 5 replicaatbuizen, elk met 9 mL Gemodificeerde Bristol's Oplossing, met 1 mL van de verdunningen 10-2 tot 10-6 (Tabel 1).
- Incubeer de afgesloten buizen maximaal 4 weken in een gebied dat is blootgesteld aan zonlicht.
- Observeer de buizen op algengroei eens per 7 dagen. Buizen met algengroei zien er groen uit.
Figuur 1. Hoe maak je een 10-voudige verdunningsreeks.
| Buis | Verdunning |
| B | 10-2 |
| C | 10-3 |
| D | 10-4 |
| E | 10-5 |
| F | 10-6 |
Tabel 1. Buisjes en verdunningen.
Algen zijn fotosynthetische organismen die in verschillende omgevingen leven. Bodemalgen kunnen in het laboratorium worden gekweekt en hun concentratie kan worden geteld met behulp van eenvoudige berekeningen.
Algen zijn een zeer heterogene groep organismen die één gemeenschappelijk kenmerk hebben, namelijk het bezit van fotosynthetische pigmenten, meestal chlorofyl.?Het overgrote deel van de algen is microscopisch, echter is de exacte definitie van de groep controversieel en omvat ook zeewier, dat meestal macroscopisch is.
In de omgeving kunnen algen problemen veroorzaken in oppervlaktewateren zoals meren of stuwmeren, door het vormen van algenbloei die de watervoedingsstoffen uitput, licht blokkeren dat verder dan het wateroppervlak passeert en toxines vrijgeven.?Het vermogen om algen in monsters te tellen, stelt wetenschappers in staat om de gezondheid van een ecosysteem te evalueren en het potentiële risico van algenovergroei.
Algenpopulaties in bodems komen vaak voor rond de tienduizend cellen per gram. Deze aantallen zijn typisch lager dan de overeenkomstige concentraties van bacteriën, schimmels of actinomyceten, omdat algen zonlicht nodig hebben voor fotosynthese, dat niet ver onder het bodemoppervlak kan doordringen.
Deze video zal illustreren hoe algen uit grond in het laboratorium kunnen worden gekweekt en hoe de concentratie van algen in het uitgangsmonster van de bodem kan worden geteld.
Algen hebben gunstige effecten op ecosystemen. Blauwgroene algen, of cyanobacteriën, hebben de capaciteit om stikstofgas uit de atmosfeer te fixeren, waardoor ze nuttig zijn voor het verhogen van het stikstof in de bodem in semi-aride omgevingen en ook als een potentieel hulpmiddel voor biobrandstofproductie.
Andere algen zijn eukaryotisch en variëren van eencellig tot complexe meercellige organismen, zoals zeewier. Deze omvatten groene algen, euglenoïden, dinoflagellaten en diatomeeën, bruine algen en rode algen.
Algen zijn fototrof, verkrijgen energie uit fotosynthese en koolstof voor biomassa uit koolstofdioxide. Als gevolg hiervan kunnen ze worden gekweekt in media die volledig uit anorganische voedingsstoffen bestaan, zonder een toegevoegde organische koolstofsubstraat. Dit gebrek aan organische substraat voorkomt de groei van heterotrofe bacteriën, die afhankelijk zijn van externe organische koolstof voor groei.
Om algen te kweken voor telling, worden grondmonsters stap voor stap verdund tot 10-6 g bodem per mL en gekweekt in groeimedia. Voor elke verdunning worden verschillende replica's gemaakt. Ze worden vervolgens maximaal 4 weken in een goed verlicht gebied geïncubeerd om algengroei mogelijk te maken.
De aanwezigheid van algen in een willekeurige verdunning wordt bepaald door een positief teken van groei in het medium, dat doorgaans zal verschijnen als een groene slijm. Ten slotte worden empirisch ontwikkelde MPN-tabellen, ontworpen voor algengroei, geraadpleegd, waardoor de gebruiker de oorspronkelijke algenconcentratie kan bepalen op basis van groei in verdunningsreplica's. De MPN-methode is gebaseerd op de seriële verdunning van monsters, zodat de algen tot uitputting worden verdund, wat betekent dat bij een bepaalde verdunning er geen algengroei meer optreedt.
Nu we bekend zijn met de concepten achter het kweken en tellen van algen uit monsters, laten we eens kijken hoe dit in het laboratorium wordt uitgevoerd.
Om het experiment te beginnen, weegt u eerst 10 gram vochtige grond af die ofwel vochtig uit het veld is verzameld, ofwel is gerehydrateerd en 2 tot 3 dagen vochtig is gebleven. De grond moet?maar niet verzadigd.
Maak vervolgens een tienvoudige verdunningsreeks door de 10 gram grond eerst toe te voegen aan 95 mL van de Gemodificeerde Bristol-oplossing, of MBS. Label dit als suspensie A.
Na krachtig te hebben geschud, gaat u verder met de verdunningsreeks door 1 mL van suspensie A toe te voegen aan 9 mL van MBS in een reageerbuisje. Ga door met deze tienvoudige verdunningsreeks nog 4 keer om verdunningsoplossingen tot 10-6 g per mL te verkrijgen.
Vervolgens worden 5 replicabuisjes geïnoculeerd, elk bevattend 9 mL MBS met 1 mL van elke verdunning 10-1 tot 10-5. Dit resulteert in 5 replicabuisjes voor elke verdunning van 10-2 tot 10-6. Sluit de buisjes losjes af.
Ten slotte worden de buisjes gedurende 4 weken in een gebied blootgesteld aan zonlicht geïncubeerd. Observeer de buisjes om de 7 dagen op algengroei. Buisjes die algengroei vertonen, zullen groen lijken.
De waarschijnlijkste aantallen, of MPN, analyse is een veel gebruikte wiskundige methode om micro-organismen te tellen die zijn gekweekt uit verdunning van een geconcentreerd initieel substraat. Door rekening te houden met de verdunningsfactoren van de oplossingen en het aantal buisjes dat positieve groeitekenen vertoont bij elke verdunning, kan het waarschijnlijkste aantal organismen per gram oorspronkelijk grondmonster worden berekend met behulp van een MPN-tabel en eenvoudige formule.
Om MPN te berekenen, wordt de hoogste verdunning met het hoogste aantal positieve replicabuisjes het label p1 toegekend, in dit geval de replica's van buisje C. In tegenstelling daarmee zijn sommige van de buisjes uit D & E negatief zonder tekenen van algengroei.
Het aantal buisjes in de volgende twee hogere verdunningsgraden die positieve groei vertonen, worden gelabeld als p2 en p3. Hier is p2 = D en p3 = E.
De waarde voor p1 kan worden gevonden door omlaag te kijken in de eerste kolom in de MPN-tabel. Hetzelfde moet worden gedaan met de p2-kolom. Ten slotte wordt de waarde van p3, aan de bovenkant, gebruikt om de twee gedefinieerde door p1 en p2 te kruisen, om een waarde te geven van het waarschijnlijkste aantal organismen per mL.
Vervolgens, om de concentratie van organismen per gram in het oorspronkelijke grondmonster te berekenen, wordt deze waarde gedeeld door de concentratie van grond in de verd
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are algae and what makes them unique among microorganisms?
Algae are a heterogeneous group of photosynthetic organisms unified by possession of photosynthetic pigments, commonly chlorophyll. Most algae are microscopic, though the group includes macroscopic seaweeds. Unlike heterotrophic bacteria, algae are phototrophic, obtaining energy from photosynthesis and carbon from carbon dioxide, allowing growth in inorganic media without organic substrates.
Q2: Why are algal populations in soil typically lower than bacterial populations?
Algal populations in soils average around ten thousand cells per gram, lower than bacteria, fungi, or actinomycetes because algae require sunlight for photosynthesis. Sunlight cannot penetrate far below the soil surface, limiting algal growth to shallow depths where light is available for photosynthetic activity.
Q3: How does the serial dilution process work in algal enumeration?
Soil samples are serially diluted tenfold to 10-6 g soil per mL and cultured in growth media with multiple replicates at each dilution. Tubes are incubated in well-lit areas for up to four weeks. The serial dilution dilutes algae to extinction, meaning at some dilution, no algal growth occurs, enabling accurate enumeration using MPN analysis.
Q4: What does a positive result look like when culturing algae in the laboratory?
Algal growth appears as a green slime in the culture medium, resulting from photosynthetic activity. This visible green coloration indicates the presence of algae in that particular dilution and serves as the primary indicator for determining which tubes show positive growth during MPN analysis.
Q5: How is the Most Probable Number calculated from dilution results?
The highest dilution with the most positive replicate tubes is labeled p1, followed by p2 and p3 from higher dilutions. Values are located in an MPN table using p1 and p2 columns, then intersected with p3 across the top to obtain organisms per mL. This value is divided by soil concentration in the p2 dilution to calculate organisms per gram of original soil.
Q6: What are the practical applications of algal enumeration in environmental monitoring?
Algal enumeration assesses algal levels in rivers and lakes to evaluate risks of harmful algal blooms. It also monitors cleanliness and safety of human-use waters including swimming pools and drinking water sources, where ideally no algae should be present. The MPN method can similarly assess water quality using indicator organisms like coliforms or E. coli.
Q7: What beneficial roles do algae play in soil and agriculture?
Blue-green algae, or cyanobacteria, fix nitrogen gas from the atmosphere, increasing soil nitrogen in semi-arid environments. Some algae serve as biofertilizers, acting as symbionts with plants to enhance nitrogen uptake, particularly useful in areas with poor soil. Algae are also cultivated for biofuels and as nutrient-rich livestock feed.