Kwantificeren van milieumicro-organismen en virussen met behulp van qPCR

De komst van kwantitatieve polymerasekettingreactie, of qPCR, heeft het mogelijk gemaakt om kwantitatief de hoeveelheid van elk micro-organisme in een milieumonster te bepalen.

Net als standaard PCR identificeert qPCR micro-organismen door de aanwezigheid of afwezigheid van DNA-sequenties die specifiek zijn voor de organismen van belang te detecteren. Dit maakt het mogelijk om microben te detecteren die niet in het laboratorium kunnen worden gekweekt, waardoor het mogelijk wordt om een veel breder scala aan milieu-organismen te onderzoeken. Bovendien maakt qPCR het mogelijk om de hoeveelheid DNA kwantitatief te beoordelen. Maar tegelijkertijd detecteren PCR-methodologieën DNA van alle organismen, dood of levend, wat de mogelijkheid beperkt om alleen naar actief groeiende microben in het monster te zoeken.

Deze video bespreekt de chemische innovaties die qPCR onderscheiden van reguliere PCR, legt uit hoe qPCR kan worden gebruikt om DNA kwantitatief te meten, demonstreert een protocol voor het gebruik van qPCR om een RNA-virus uit bodemmonsters te detecteren, en toont ten slotte hoe qPCR vandaag de dag wordt toegepast in de milieumicrobiologie.

De basisprincipes achter qPCR zijn hetzelfde als reguliere PCR - herhaalde cycli van primer-annealing aan template, verlenging van PCR-product en denaturatie van product van template, leidend tot de exponentiële amplificatie van een doelsequentie van belang, bekend als het amplicon, uit een pool van uitgangsmateriaal.

De innovatie van qPCR zit in de toevoeging van fluorescerende chemicaliën in de reactie, wat het mogelijk maakt om de synthese van PCR-product bij elke cyclus direct te visualiseren in "real time" door gespecialiseerde thermocyclers, waardoor het mogelijk wordt om de hoeveelheid sjabloonsequentie in het oorspronkelijke monster te kwantificeren. De hoeveelheid wordt meestal gemeten in termen van de drempelcyclus, afgekort Ct, ook bekend als de kwantificeringscyclus of Cq, wat de PCR-cyclus is waarbij de hoeveelheid fluorescerende producten de achtergrondniveaus overschrijdt.

Kwantificering kan relatief zijn, waarbij de Ct-waarde van één sequentie wordt vergeleken met die van een andere standaard- of controlesequentie; de relatieve hoeveelheid is gelijk aan twee verhoogd naar de macht van het verschil in Ct. Als alternatief, als een reeks DNA met bekende hoeveelheid naast de monsters in de reactie wordt uitgevoerd, kan een standaardcurve worden geproduceerd die de fluorescentiewaarde vergelijkt met de hoeveelheid DNA, en waardoor de monster-DNA absoluut kan worden gekwantificeerd.

Er zijn twee brede typen van fluorescerende moleculen die in qPCR worden gebruikt. In één geval worden fluorescerende kleurstoffen die specifiek aan dubbelstrengs DNA binden in de reactie opgenomen. De kleurstof fluoreert alleen wanneer gebonden aan DNA, waardoor de hoeveelheid dubbelstrengs DNA-product kan worden gekwantificeerd.

In de andere methode is een kort stuk DNA, bekend als een sonde, ontworpen tegen een specifiek doelsequentie van belang. De sonde is chemisch bevestigd aan een fluorescerende kleurstof evenals een "quench"-molecuul dat het fluorescentiesignaal van de kleurstof onderdrukt wanneer deze in de nabijheid is. Het polymerase-enzym, dat het DNA-product synthetiseert, heeft een DNA-degraderende activiteit die ervoor zorgt dat het fluorescerende molecuul "vrijkomt" van de sonde, waardoor de kleurstof van de quencher wordt gescheiden en het fluorescentiesignaal kan worden gedetecteerd.

Nu u de principes achter qPCR begrijpt, laten we een protocol bekijken voor het gebruik van deze techniek om een RNA-virus dat planten infecteert, het pepper mild mottle-virus, uit bodemmonsters te identificeren.

In deze demonstratie wordt monster verzameld uit de rhizosfeer, de zone van de bodem van ongeveer 7 mm rond plantenwortels die wordt beïnvloed door de wortels en hun symbiotische micro-organismen.

Om rhizosfeerbodem te verzamelen, trekt u eerst voorzichtig de plant van belang uit de grond, en slaat u erop om zoveel mogelijk overtollig bulkgrond te verwijderen. Verpak de plant voor verdere verwerking in het laboratorium.

Nadat de monsters terug in het laboratorium zijn gebracht, gebruikt u een steriele spatel om het gewenste grondmonster in een verzamelvat te schraap. Verzamel vervolgens het virus uit de grond en extraheer het RNA.

Zodra RNA uit het monster is verzameld, converteert u het naar complementair of cDNA via reverse transcriptie. Raadpleeg de JoVE SciEd-video over reverse transcriptie-PCR voor details van deze procedure.

Wanneer u klaar bent om de qPCR uit te voeren, ontdooi bevroren reagentia bij kamertemperatuur in een speciale laminaire stromingskast, en plaats ze eenmaal ontdooid op ijs. Reagenscomponenten die het DNA-polymerase-enzym bevatten, moeten altijd op ijs worden bewaard.

Ontdooi het monster cDNA en een positieve controle-DNA, zoals een circulair stuk DNA dat bekend staat als een plasmide en dat de gewenste amplicon bevat die erin is gekloond.

Voordat u de reacties in een 96-well qPCR-plaat samenstelt, bereidt u een 96-cels tabeltemplate op papier voor, en labelt u elke cel met de reactie die in de plaat zal worden geladen. Neem reacties voor elk monster en standaard in drievoud op, evenals voor de positieve controle en negatieve controle, zoals een reactie zonder DNA.

Bereken de reagensvolumes die nodig zijn voor een reactie "master mix", die alle reagentia omvat die constant zijn onder de reacties. Bereid genoeg master mix voor voor drievoud reacties voor alle monsters plus controles, en een extra 10% om rekening te houden met pipetfouten.

Zodra de reagentia zijn ontdooid, stelt u de master mix samen in een 1,5-mL laag-adsorptie microfugebuis. Om dit te doen, vortex kort elke reagens om grondig te mengen, verzamel eventueel vocht aan de zijkant van de buisjes met een mini-centrifuge, en pipet de reagens in de microfugebuis. Zorg ervoor dat u voor elke reactiecomponent nieuwe pipettenpunten gebruikt. Nadat alle reagentia zijn toegevoegd, vortex om te mengen en centrifugeer. Pipet vervolgens de juiste hoeveelheid master mix in de aangewezen putjes op de PCR-plaat.

Vortex vervolgens en centrifugeer elke buis met monster- en controle-DNA, en pipet de juiste hoeveelheid in