Detectie van Bacteriofagen in Milieumonsters

1. Verkrijg een monster van afvalwater of water dat colifaag bevat.
2. Verdun het monster 1:10 en 1:100 met Tris-buffer. Doe dit door 1,0 mL van de cultuur over te brengen naar 9 mL Tris-buffer, en maak vervolgens een tweede 10-voudige verdunning.
3. Smelt drie buisjes zachte agar (0,7% voedingsagar of trypticase soja-agar per buisje van 3 mL) door ze in een stoombad of autoclaaf te plaatsen.
4. Plaats de agar in een waterbad op 45-48 °C gedurende 15 min om de temperatuur van de agar aan te passen tot 45 °C.
5. Voeg aan de eerste buis 1 mL van een log-fase vloeibaar medium van E. coli¹ en 1 mL onverdund monster toe.
6. Haal de buis uit het waterbad en schudding voorzichtig tussen de handen om de suspensie 2-3 s te mengen.
7. Veeg het water van de buis met een papieren handdoek en giet de agar over een eerder voorbereide Petri-schaal met bodemagar (gewone voedingsagar of trypticase soja-agar).
8. Roteer snel de plaat om de bovenste agar te verspreiden. Zorg ervoor dat de agar het hele oppervlak bedekt.
9. Herhaal stappen 5-8 met de andere twee buisjes zachte agar, gebruik 1 mL bacteriën en 1 mL van elke monsterverdunning (Figuur 2).
10. Nadat de agar gestold is, keer de Petri-schijven om en incubeer bij 37 °C gedurende 48 uur. Klop eventueel vocht van de deksel van de Petri-schaal. Als er een druppel vocht op een plaque valt, zal dit ervoor zorgen dat het virus zich over het agaroppervlak verspreidt.
11. Na de incubatie, tel het aantal plaques op elke verdunning (Figuur 3) en bereken de concentratie van faag in het originele monster. Noteer eventuele grote verschillen in de grootte of het uiterlijk van de plaques.

Figuur 2. Procedure voor de bereiding van een bacteriële lawn met behulp van bovenste agar voor colifaagtelling.

Figuur 3. Faagplaques op een bacteriële lawn.

¹E. coli-stam ATCC 15597 zal meestal het grootste aantal plaques uit afvalwatermonsters produceren. Het moet een nacht in een 250-mL Erlenmeyer-kolf met 100 mL voedings- of trypticase soja-vloeibaar medium worden gekweekt en onder schudden worden geïncubeerd bij 35 °C. 3 uur voor de faagtest inoculeert u 1 mL van deze cultuur in een verse kolf met 100 mL voedings- of trypticase soja-vloeibaar medium en plaatst u deze in een schuddend waterbad bij 35-37 °C. Dit zorgt ervoor dat de bacteriën in de log-fase van groei zijn.