What is the structure of a bacteriophage?

Bacteriophages are viruses consisting of a nucleic acid genome, either DNA or RNA, surrounded by a protein coat called a capsid. Some phages have an additional lipid envelope and spike-like surface appendages or tails. These ultramicroscopic particles are too small to view with a light microscope and can only be seen using an electron microscope.

How do bacteriophages infect and reproduce in bacterial cells?

Bacteriophages attach to the bacterial cell surface and inject their genetic material into the host. The viral genome is replicated and capsid proteins are produced using the host cell's biochemical machinery. Once phage particles assemble, they are released by lysing the host cell, often bursting out and killing the bacterium in the process.

What is a plaque assay and how does it measure phage concentration?

A plaque assay mixes phage with bacteria and soft agar overlaid on regular agar plates. Bacteria form a continuous lawn, and when phages infect and lyse bacteria, plaques form as clear zones. Counting discrete plaques and calculating plaque-forming units (PFUs) per milliliter determines the original phage concentration in the sample.

Why are coliphages useful indicators of water contamination?

Coliphages infect E. coli, a common gut bacterium indicating fecal contamination. They are reliable surrogate indicators for disease-causing enteroviruses that are also fecally-transmitted but difficult to assay. Quick and inexpensive enumeration methods make coliphages attractive tools for assessing fecal contamination in environmental water samples.

What conditions are necessary for preparing bacteria in a plaque assay?

Bacteria must be in the log phase of growth to ensure every bacterium is alive and allows phage to produce progeny. Three hours before the assay, inoculate overnight culture into fresh broth and incubate at 35-37°C with shaking. This timing ensures bacteria reach optimal metabolic activity for supporting phage replication.

How can plaque assays be adapted to detect viruses other than bacteriophages?

Plaque assays can be performed with mammalian viruses like influenza by growing mammalian cells as monolayers in tissue culture dishes. Virus-containing media are added to allow infection, then cells are overlaid with immobilizing medium such as agarose. After incubation lasting up to two weeks, infected cells are fixed and stained to visualize and count plaques.

How are individual phage isolates obtained from environmental samples using plaque assays?

Phages are collected from environmental samples like soil by filtration, then used to infect susceptible bacteria in a plaque assay. Individual plaques are picked and streaked onto new agar plates overlaid with bacteria-containing top agar. Phage concentration decreases along the streak, allowing discrete plaques from single phage types to be isolated and further analyzed.

Detectie van Bacteriofagen in Milieumonsters

0 weergaven09:17 min

Verkrijg een monster van afvalwater of water dat colifaag bevat.
Verdun het monster 1:10 en 1:100 met Tris-buffer. Doe dit door 1,0 mL van de cultuur over te brengen naar 9 mL Tris-buffer, en maak vervolgens een tweede 10-voudige verdunning.
Smelt drie buisjes zachte agar (0,7% voedingsagar of trypticase soja-agar per buisje van 3 mL) door ze in een stoombad of autoclaaf te plaatsen.
Plaats de agar in een waterbad op 45-48 °C gedurende 15 min om de temperatuur van de agar aan te passen tot 45 °C.
Voeg aan de eerste buis 1 mL van een log-fase vloeibaar medium van E. coli¹ en 1 mL onverdund monster toe.
Haal de buis uit het waterbad en schudding voorzichtig tussen de handen om de suspensie 2-3 s te mengen.
Veeg het water van de buis met een papieren handdoek en giet de agar over een eerder voorbereide Petri-schaal met bodemagar (gewone voedingsagar of trypticase soja-agar).
Roteer snel de plaat om de bovenste agar te verspreiden. Zorg ervoor dat de agar het hele oppervlak bedekt.
Herhaal stappen 5-8 met de andere twee buisjes zachte agar, gebruik 1 mL bacteriën en 1 mL van elke monsterverdunning (Figuur 2).
Nadat de agar gestold is, keer de Petri-schijven om en incubeer bij 37 °C gedurende 48 uur. Klop eventueel vocht van de deksel van de Petri-schaal. Als er een druppel vocht op een plaque valt, zal dit ervoor zorgen dat het virus zich over het agaroppervlak verspreidt.
Na de incubatie, tel het aantal plaques op elke verdunning (Figuur 3) en bereken de concentratie van faag in het originele monster. Noteer eventuele grote verschillen in de grootte of het uiterlijk van de plaques.

Diagram voor bacteriofaagdetectie: agar-inoculatie met bacteriën en faag, plaque-resultaten op platen.
Figuur 2. Procedure voor de bereiding van een bacteriële lawn met behulp van bovenste agar voor colifaagtelling.

Bacteriekoloniegroei op agarplaat, microbiologie-experiment, celcultuuranalyse-resultaat.
Figuur 3. Faagplaques op een bacteriële lawn.

¹E. coli-stam ATCC 15597 zal meestal het grootste aantal plaques uit afvalwatermonsters produceren. Het moet een nacht in een 250-mL Erlenmeyer-kolf met 100 mL voedings- of trypticase soja-vloeibaar medium worden gekweekt en onder schudden worden geïncubeerd bij 35 °C. 3 uur voor de faagtest inoculeert u 1 mL van deze cultuur in een verse kolf met 100 mL voedings- of trypticase soja-vloeibaar medium en plaatst u deze in een schuddend waterbad bij 35-37 °C. Dit zorgt ervoor dat de bacteriën in de log-fase van groei zijn.