Isolatie van fecale bacteriën uit watermonsters door filtratie

1. Water Sample Collection and Processing

1. Verzamel verschillende 1-L watermonsters uit de te testen waterbronnen (bijv. drinkfonteinen, zwembaden, reservoirs, waterdistributiesystemen, onbehandeld of behandeld afvalwater) en vervoer ze op ijs naar het laboratorium voor microbiologische analyse.
2. Steriliseer of desinfecteer het membraanfiltratieapparaat voor gebruik door autoclavage, blootstelling aan UV-straling (2 min) of ethanol-vlam-ontbranding.
3. Nadat alle onderdelen zijn afgekoeld, sluit u het manifold op de juiste manier aan op een vacuümpomp en een afvalvlak met vacuümfiltratie dat bleek bevat.
4. Steriliseer een paar pincetten met een ethanol-vlam en verwijder ermee een steriele, rasterachtige membraanfilter uit de verpakking. Membraanfilters met een diameter van 47 mm met een poriegrootte van 0,45 µm worden meestal gebruikt. Alternatieve diameters en poriegroottes kunnen echter worden gebruikt, op voorwaarde dat de poriegrootte het doelmicro-organisme(n) voldoende kan vasthouden en minimaal 70% van het filteroppervlak uit porie-ruimte bestaat.
5. Plaats het filter op het midden van het membraanfiltratiegebied van het manifold en breng een steriele filtertrechter aan op de unit en bevestig deze op zijn plaats.
6. Meet een gewenst volume van het testwater (bijv. 100 ml) en voeg het toe aan de trechter (een lijnmarkering van 100 ml is zichtbaar op de trechter).
7. Breng een gedeeltelijk vacuüm aan [drukverschil van 34 tot 51 kPa (kilopascals)] om het testmonster door het filter te trekken. Materieel dat totaal in suspensie is, inclusief bacteriën en afbrekend organisch materiaal, groter dan de gemiddelde poriegrootte van het filter van 0,45 µm, worden vastgehouden op het filter. Kleinere deeltjes, waaronder virussen en opgeloste vaste stoffen zoals kleine hoeveelheden organisch materiaal en zouten, passeren door het membraan en in de afvalcontainer vacuümfles met bleek.
8. Nadat het monster volledig door het filter is gegaan, spoelt u de binnenkant van de trechter af met twee tot drie volumes van 20-30 ml steriele water.
9. Schakel de vacuüm uit en verwijder de trechter uit het manifold na afsluiting van de laatste spoeling.
10. Verwijder met ethanol-vlam gesteriliseerde pincetten onmiddellijk het membraanfilter uit de unit en plaats het onmiddellijk op het juiste groei-agarosemedium voor het doelmicro-organisme (Tabel 1 geeft de aanbevolen groeimedia en incubatiecondities voor elk weer).
11. Breng het membraanfilter met een rolbeweging op de agarose-oppervlakte aan om volledige contact van het membraan met het groeimedium te garanderen en om het vasthouden van luchtbellen te voorkomen.
12. Vervang de gebruikte filtratietrechter door een steriele unit tussen de verwerking van elk monster en desinfecteer het roestvrijstalen manifold met ethanol om kruisbesmetting te voorkomen.

2. Kolonietelling

1. Verwijder na de incubatieperiode de groeipitten uit de incubator voor telling.
2. Voer de kolonietelling bij voorkeur uit onder lage vergroting met een koude, witte lichtbron.
3. Totale coliformen
   1. Totale coliforme kolonies zijn meestal roze tot donkerrood van kleur met een metalen glans. De glans zelf kan de kolonie gedeeltelijk of volledig bedekken. Atypische totale coliforme koloniemorfologieën kunnen donkerrood, slijmvormend of genucleeerd zijn zonder glans.
   2. Kolonies die roze, blauw, wit of kleurloos zijn en geen glans hebben, worden beschouwd als niet-coliformen.
4. Fecale coliformen
   1. Fecale coliforme kolonies zien eruit als verschillende tinten blauw.
   2. Niet-fecale coliforme kolonies zijn grijs tot crème van kleur.
5. Fecale enterokokken
   1. Fecale enterokokkolonies variëren van roze tot donkerrood van kleur.

3. Kolonieverificatie

1. Totale coliformen
   1. Voor een aanwezigheids-afwezigheidsverificatie, veeg de gehele membraan af met een steriele inoculatielus. Voor kolonies is het bij voorkeur om ten minste vijf van elke typische en atypische morfologieën te verifiëren.
   2. Breng de geselecteerde kolonie over in een glazen vat met lauryl tryptose bouillon met een Durham-buis. Bewaar de geïnoculeerde buizen bij 35°C ± 0,5 °C gedurende 48 uur. De aanwezigheid van troebelheid die groei aangeeft in combinatie met gasproductie verifieert de kolonie als een coliform.
2. Fecale coliformen
   1. Breng blauwe kolonies aseptisch over in glazen vaten met steriel EC-medium met een Durham-buis. Bewaar de geïnoculeerde buizen bij 44,5 ± 0,2 °C gedurende 24 uur. De aanwezigheid van troebelheid die groei aangeeft in combinatie met gasproductie verifieert de kolonie als een fecale coliform.
3. Fecale enterokokken
   1. Sla aseptisch kolonies met typisch fecale enterococci-morfologie neer op Brain-Heart Infusion Agar (BHIA) voor isolatie en bewaar deze bij 35 °C ± 0,5 °C gedurende 24 tot 48 uur.
   2. Breng de groei van een geïsoleerde kolonie op BHIA over op twee vooraf gereinigde glazen platen.
   3. Voeg twee tot drie druppels 3% waterstofperoxide toe aan bereide uitstrijkjes op de platen. Het snel optreden van bellen geeft een "katalase positief" resultaat aan, en de isolaat is geen fecale streptokokkenbacterie.
   4. Voer een Gram-kleuring uit voor isolaten die als "katalase negatief" testen (geen bubbels waargenomen). Fecale enterokokken zijn Gram-positief, eivormige en verschijnen meestal in paren of korte ketens.