Gemeenschaps-DNA-extractie uit bacteriekolonies

1. Extractie van DNA uit bacteriële gemeenschappen

1. Weeg om de procedure te beginnen 100 g gezeefd bodem af. Voeg dit toe aan een polypropyleen vat, en voeg 100 mL extractiebuffer toe, bestaande uit Tris buffer met EDTA om de afgifte van bacteriën uit de bodemmatrix te bevorderen, en schud met de hand.
2. Weeg vervolgens 100 g glazen kralen af, en voeg deze toe aan het mengvat. Roer het monster gedurende 5 min. met behulp van een bead beating apparaat of mechanische polsactie shaker gedurende 15 min. Voeg 10 mL 20% natriumdodecylsulfaat, of SDS, toe aan het mengsel, en roer gedurende nog een minuut. Incubeer op een hoge temperatuur van 60 - 65 °C gedurende 60 min.
3. Verdeel het monster gelijkmatig over afzonderlijke 50-mL buizen, en centrifugeer gedurende 10 min. bij 6.000 x g. Breng het supernatant van de buizen over naar een enkele steriele container. Herhaal vervolgens de extractie op de bodemkorrel zoals eerder beschreven, met behulp van een nieuw volume extractiebuffer.
4. Voeg vervolgens het totale volume van het verwerkte supernatant, ongeveer 200 mL, toe aan een schone 50-mL buis gevuld tot de helft met een oplossing van 30% polyethyleenglycol en 1,6 M natriumchloride. Draai de flesjes meerdere keren met de hand om te mengen, en incubeer op kamertemperatuur gedurende 2 uur. Centrifugeer monsters bij 10.000 x g gedurende 20 min. om het DNA te pelletten.
5. Verwijder het supernatant voorzichtig uit de centrifugeerbuis, waarbij het gedeeltelijk gezuiverde nucleïnezuurpellet achterblijft. Voeg 20 mL TE Buffer en 1,5 mL van een 7,5 M kaliumacetaatoplossing toe om het pellet te resuspenderen, en vortex. Plaats de suspensie op ijs gedurende 5 min. Centrifugeer gedurende 30 min. bij 16.000 x g bij 4 °C om eiwitten en polysachariden te bezinken.
6. Voeg vervolgens een RNAse en proteinase K toe aan het monster, meng voorzichtig met de hand, en laat even staan. Voeg een gelijk volume fenol:chloroform:isoamyl alcohol (verhoudingsmix 25:24:1) toe aan de suspensie om te extraheren, en meng voorzichtig met de hand. Centrifugeer de bereiding gedurende 10 min. bij 13.000 x g. Verwijder voorzichtig het vat uit de centrifuge, en noteer de twee lagen.
7. De onderste, zwaardere laag bestaat uit de fenol:chloroform:isoamyl alcohol en geëxtraheerd puin, en de bovenste laag is de waterige en bevat het DNA. Plaats de waterige fase in een steriele container, voeg een gelijk volume isopropanol toe, en draai voorzichtig om te beginnen met DNA precipitatie. Incubeer de suspensie op kamertemperatuur gedurende 2 uur. Pellet het gezuiverde DNA door centrifugatie bij 16.000 x g gedurende 30 min. Verwijder voorzichtig het supernatant omdat het gepelletede DNA mogelijk wel of niet zichtbaar is op de bodem van de container, en resuspendeer in 1 mL TE Buffer.
8. Gebruik een spectrofotometer of DNA/RNA kwantificatie fluorimeter om het niveau van DNA geëxtraheerd uit het monster te meten. De hoeveelheid DNA wordt geschat op basis van de 260 nm meting. Een absorptiewaarde van 1,0 komt overeen met 50 µg DNA per mL oplossing. Als de concentratie te hoog is voor nauwkeurige metingen, verdun de suspensie 1 op 10 of 1 op 100 met moleculair gradig water.
9. De zuiverheid van DNA wordt geschat op basis van de verhouding van de meting bij 260 nm tot die bij 280 nm. Een waarde > 1,7 duidt op relatief zuiver DNA. De maximale theoretische waarde is 2,0.