Gemeenschaps-DNA-extractie uit bacteriekolonies

Bacteriegemeenschap DNA-extractie is een proces waarbij DNA wordt verkregen van meerdere bacteriesoorten binnen een gemeenschap tijdens een enkele extractieprocedure.

Traditionele analyses van microbiële gemeenschappen in bodem hebben meestal culturele tests omvat, gebruikmakend van verdunning en plateringsmethodologie op verschillende selectieve media. Echter, veel bacteriën groeien slecht onder laboratoriumomstandigheden of op de specifieke groeimediavoorwaarden die zijn geselecteerd, wat betekent dat ze mogelijk worden gemist of ernstig ondervertegenwoordigd.

Onlangs heeft het extraheren van gemeenschaps-DNA uit bacteriële monsters uit de bodem een meer uitgebreide bemonstering van bacteriële gemeenschappen mogelijk gemaakt. Deze niet op kweek gebaseerde benadering wordt geacht representatiever te zijn voor de werkelijke aanwezige gemeenschappen dan traditionele kweekgebaseerde methoden.

Deze video zal een niet-kweekmethode van bacteriële gemeenschap DNA-extractie demonstreren, hoe de kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerd DNA te controleren, en verkennen hoe dit DNA kan worden gebruikt om bacteriële diversiteit te bestuderen.

DNA-extractie uit bodem kan op een van de twee manieren worden uitgevoerd. In de fractioneringsmethode worden cellen eerst gescheiden van de bodemmatrix voorafgaand aan extractie van het genetisch materiaal. Het monster wordt vervolgens onderworpen aan opeenvolgende cycli van mixen en langzame centrifugatie om intacte cellen in een pellet te verzamelen.

Lysozymen worden vervolgens toegevoegd aan de cellen en de suspensie wordt geïncubeerd. Lysozymen zijn enzymen die bacteriële celwanden afbreken. Zodra de celwandstructuur is aangetast, kan het DNA worden bevrijd voor zuivering. Echter, een tweede methode van gemeenschaps-DNA-extractie, de in situ-methode, heeft aangetoond dat deze een grotere DNA-concentratie oplevert.

Hier wordt een massa bodem gecombineerd met een gelijk volume Tris-EDTA extractiebuffer en glazen kralen en agressief gemengd om de scheiding van cellen van de bodempartikels te vergemakkelijken. Er wordt vervolgens een detergent toegevoegd, meestal natriumdodecylsulfaat of SDS, en het monster wordt verder gemengd om het lysen van de cellen en het vrijkomen van hun inhoud, inclusief DNA, te bevorderen.

Incubatie bij een hoge temperatuur wordt vervolgens uitgevoerd om eventuele resterende bacteriecellen te lysen. monsters worden gecentrifugeerd, en een extractie en incubatie met polyethyleenglycol wordt uitgevoerd op het supernatant om het DNA te precipiteren, dat vervolgens wordt gecentrifugeerd tot een pellet.

Het DNA wordt opnieuw gesuspendeerd in TE-buffer en kaliumacetaat om het DNA verder te wassen van eiwitten en polysachariden, waarna centrifugatie wordt uitgevoerd om deze ongewenste componenten tot een pellet te brengen. Het waterige supernatant dat het DNA bevat, wordt verwijderd en onderworpen aan een fenol-chloroform extractie en isopropanol precipitatie om het DNA verder te zuiveren en te concentreren. Na een incubatieperiode van twee uur bij kamertemperatuur wordt het DNA gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in TE-buffer voor opslag tot analyse.

Nu we bekend zijn met de concepten en processen achter bacteriële gemeenschap DNA-extractie, laten we eens kijken hoe dit in het laboratorium wordt uitgevoerd.

Om de procedure te beginnen, weeg 100 g gezeefde bodem af. Voeg dit toe aan een polypropyleen vat en voeg 100 mL extractiebuffer toe, bestaande uit Tris buffer aangevuld met EDTA om de afgifte van bacteriën uit de bodemmatrix te bevorderen, en schud met de hand.

Weeg vervolgens 100 g glazen kralen en voeg deze toe aan het mengvat. Roer het monster gedurende 5 min? met behulp van een bead beating apparaat of mechanische polsslinger shaker. Voeg 10 mL 20% natriumdodecylsulfaat, of SDS, toe aan het mengsel en roer nog een minuut. Incubeer gedurende 60 min bij hoge temperatuur.

Verdeel het monster gelijkmatig over afzonderlijke 50 mL buizen en centrifugeer gedurende 10 min? bij 6.000 x g. Breng het supernatant van de buizen over naar een enkele steriele container. Herhaal vervolgens de extractie op de bodem pellet zoals eerder beschreven, met behulp van een verse hoeveelheid extractiebuffer.

Voeg vervolgens het totale volume van het verwerkte supernatant toe aan een schone 50-mL buis gevuld tot half volume met een oplossing van 30% polyethyleenglycol en 1,6 M natriumchloride. Draai de flessen meerdere keren met de hand om te mengen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 h. Centrifugeer de monsters bij 10.000 x g gedurende 20 min? om het DNA tot een pellet te brengen.

Verwijder voorzichtig het supernatant van de centrifugeerbuis, waarbij het gedeeltelijk gezuiverde nucleïnezuurpellet achterblijft. Voeg 20 mL TE-buffer en 1,5 mL van een 7,5 M kaliumacetaatoplossing toe om het pellet op te schorten, en vortex. Plaats de suspensie 5 min op ijs. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 30 min bij 4?C om eiwitten en polysachariden te laten bezinken.

Voeg vervolgens een RNAse en proteinase K toe aan het monster, meng voorzichtig met de hand en laat even staan. Voeg een gelijk volume fenol:chloroform:isoamylalcohol toe aan de suspensie die moet worden geëxtraheerd en meng voorzichtig met de hand. Centrifugeer de bereiding gedurende 10 min bij 13.000 x g. Verwijder voorzichtig het vat uit de centrifuge en noteer de twee lagen.

De onderste, zwaardere laag bestaat uit de fenol:chloroform:isoamylalcohol en geëxtraheerd puin, en de bovenste laag is waterig en bevat het DNA. Plaats de waterige fase in een steriele vat, voeg een gelijk volume isopropanol toe en draai voorzichtig om DNA precipitatie te starten. Incubeer de suspensie bij kamertemperatuur gedurende 2 h. Pellet het gezuiverde DNA door centrifugatie bij 16.000 x g gedurende 30 min. Verwijder voorzichtig het supernatant, omdat het gepelletiseerde DNA wel of niet zichtbaar kan zijn op de bodem van het vat, en suspendeer vervolgens in 1 mL TE-buffer.

Met behulp van een