Name: De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Leer primaire hematopoietische cellen isoleren uit muizenbotmerg en transfecteren via elektroporatie. Deze methode optimaliseert differentiatie naar mestcellen en basofielen met 30% transfectie-efficiëntie voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Oogsten beenmerg van bovenbenen en tibiae <ol><li> De eerste stap van de procedure is om beenmerg oogst van de bovenbenen en de tibiae van een 6 - tot 12-week oude muis (we gebruiken BALB / c muizen, maar u kunt deze procedure doen met een muis-stam). Om te beginnen, euthanaseren de muis door CO 2 inhalatie (wordt niet getoond). Oogst dijbeen en tibiae van de achterpoten van elk. Dan, met een scheermesje, snij elk uiteinde van het dijbeen aan de heup-en kniegewrichten te verwijderen en het merg bloot te leggen. </li><li> Op een vergelijkbare manier, snijd elk uiteinde van de tibiae aan de knie en de enkel aangrenzende regio&#39;s te verwijderen en het merg bloot te leggen. </li><li> Neem een ​​3 ml spuit met een 26-gauge naald en vul deze met RPMI aangevuld met 10% FBS, penicilline, streptomycine, en beta-mercapto-ethanol (BME = 100 uM). Met een pincet, houdt het bot over een petrischaal met RPMI media. Steek de naald in het ene uiteinde van het bot en de zuiger uit te spoelen het beenmerg. De naald kan worden verplaatst op en neer in het bot uit te spoelen resterende beenmerg. </li><li> Herhaal de procedure voor alle beenderen, en ga dan verder met het vaststellen van de culturen. </li></ol> Tot vaststelling van culturen <ol><li> Om vast te stellen het beenmerg culturen, pipet de gespoeld beenmerg op en neer een paar keer op te breken het weefsel in een cel suspensie. </li><li> Plaats een 70 micron filter op de top van een 50 ml conische buis, en voeg de celsuspensie om het filter. </li><li> Spoel de petrischaal een keer met RPMI, voeg dan de spoel aan de 70 micron filter. </li><li> Met behulp van de rubber einde van een 1 ml zuiger, slijpen het beenmerg stukken blijven op de top van de 70 micron filter. </li><li> Was het filter een keer met RPMI. </li><li> Na het wassen van de filter, centrifuge de celsuspensie bij 1200 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Was de celpellet door resuspenderen in PBS. </li><li> Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. We meestal krijgen ~ 90 miljoen cellen van de botten een muis (twee dijbeen plus twee tibiae). Na het tellen van de cellen, opnieuw centrifuge ze bij 1200 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de cellen in een kleine hoeveelheid RPMI en aliquot ze in weefselkweek kolven met genoeg RPMI, zodat de uiteindelijke concentratie is 1 miljoen cellen per ml. </li><li> Voeg cytokinen aan de ontwikkeling van uw celtype van belang te bevorderen. In dit geval is het cytokine interleukine-3 (IL-3 = 10 ng / mL) toegevoegd aan de ontwikkeling van basofielen en mestcellen te bevorderen. Te verwerven basofielen, incubeer gedurende 10 dagen. Voor de mestcellen, incubeer gedurende 5 weken. Bij het genereren van mestcellen, de media en IL-3 moet een keer een week worden gewijzigd. </li><li> Hier is een blik op hoe de mestcellen moeten verschijnen vlak na plating. Deze afbeelding toont de differentiatie van beenmergcellen in de mast basofielen en mestcellen 10 dagen na de toevoeging van interleukine-3. </li><li> Zodra het gewenste celtype is verkregen, gaan met de elektroporatie stap. </li></ol> Electroporating Cellen <ol><li> Om te beginnen de elektroporatie stap, bepalen het aantal cellen in de cultuur kolf. </li><li> Cellen zijn meestal geëlektroporeerd bij een dichtheid van 10 miljoen per ml, zodat overdracht van de benodigde cel nummer conische buizen en centrifugeer de buizen op 1200 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Na centrifugeren, aspiratie van de media, was de cellen met 1X PBS, en centrifugeer opnieuw bij 1200 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het PBS en voeg Bio-Rad Gene Puiser elektroporatie buffer om een ​​celsuspensie van 10 miljoen cellen per ml. </li><li> Na resuspenderen van de cellen, voeg de gewenste plasmide-DNA bij een uiteindelijke concentratie van 10 tot 20 microgram per ml. </li><li> Aliquot 150 microliter van de celsuspensie in putten van uw keuze op een 96-well plaat elektroporatie. </li><li> Zet de plaat in de elektroporatie MXcell plaat kamer en sluit het deksel. </li><li> Voorafgaand aan de transfectie van mestcellen, moet een elektroporatie protocol worden geprogrammeerd in de MXcell, tenzij met behulp van een vooraf ingestelde of opgeslagen protocol. Door optimalisatie experimenten hebben we ontdekt dat de hoogste transfectie efficiëntie van mestcellen komen blokgolf-protocollen gebruikt. We zullen variëren de elektroporatie voorwaarden op de plaat te 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms en 350V/10ms blokgolf pulsen leveren aan 2000uF en 1000 ohm. Nadat het protocol is ingesteld en geladen op het apparaat, drukt u op &quot;Pulse&quot; om de cellen te electroporate. </li><li> Na de elektroporatie is voltooid, overdracht van de cellen om een ​​weefselkweek plaat. We meestal breng elke 150 microliter elektroporatie monster op een goed in een 48-well weefselkweek plaat met 300 microliter RPMI (aangevuld met 10% FCS, penicilline, streptomycine, en beta-mercapto-ethanol) met 10 nanogram per ml interleukine-3. Cellen worden gedurende de nacht geïncubeerd bij 37 ° C, vervolgens getest 24 uur later voor expressie en onderdrukking. </li></ol> Transfection resultaten De fluorescentie microscopie beeld van de cellen na succesvolle elektroporatie gebruik van 20 microgram per ml GFP plasmide wordt getoond in de video. Met behulp van de MXcell elektroporatie systeem transfectie efficiëntie van ongeveer 30% kan worden verkregen. Het systeem stelt u in staat om voorwaarden om uw transfectie-efficiëntie te maximaliseren variëren, met behoud van levensvatbaarheid van de cellen.

Naarmate meer genomische informatie naar voren komt en nieuwe tools zoals siRNA worden ontwikkeld, is het gebruik van fysiologisch relevante cellen worden steeds belangrijker voor ons begrip van de ziekte wegen, eiwit-eiwit interacties, en signaaltransductie verder. Primaire cellen worden rechtstreeks verkregen uit weefsels of vloeistoffen en gekweekt in vitro. Deze cellen kunnen worden gemanipuleerd in een aantal manieren, onder meer door de introductie van exogeen genetisch materiaal. Het wordt steeds duidelijker dat de meest effectieve manier om plasmide DNA of siRNA te introduceren in primaire cellen is elektroporatie. Elektroporatie blootstelt cellen elektrische pulsen om tijdelijk verhoging van de permeabiliteit van de celmembraan, waardoor exogene nucleïnezuren naar de cel in te voeren. Deze methode van transfectie kunnen worden geoptimaliseerd om ruimte maken voor verschillen tussen de verschillende celtypen / lijnen en dus kunnen worden gebruikt om mestcellen transfecteren evenals alle andere beenmerg-afgeleide cel. Bovendien, in tegenstelling tot virale-gemedieerde transfectie, is elektroporatie niet beperkingen aan de grootte van de getransfecteerde DNA, noch een grondige voorbereiding. In tegenstelling tot de lipide-gemedieerde transfectie, kan electroporatie minder giftig en niet leidt tot endosomale vangen van de getransfecteerde nucleïnezuur. Bio-Rad ontwikkelde de MXcell elektroporatie systeem speciaal voor deze cellen. de MXcell kunt u voorwaarden verschillen naar uw transfectie-efficiëntie en de levensvatbaarheid van de cellen te maximaliseren. Om de transfectie-efficiëntie te optimaliseren en het minimaliseren van celdood, een veelheid van elektroporatie parameters zoals spanning, kan capaciteit, weerstand en pulslengte worden aangepast en geëvalueerd.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser MXcell electroporatiesysteem</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser electroporatiebuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

de vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit murine bone marrow voor elektroporatie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Het wordt steeds duidelijker dat elektroporatie is de meest effectieve manier om plasmide DNA of siRNA introduceren in primaire cellen. De Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem en Gene Puiser elektroporatie buffer zijn speciaal ontwikkeld om nucleïnezuren te transfecteren in zoogdiercellen en moeilijk te transfecteren cellen, zoals de primaire en stam cells.This video laat zien hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf muizen beenmerg , en vervolgens hen voor te bereiden elektroporatie in het MXcell systeem. We beginnen met het isoleren van dijbeen en scheenbeen. Beenmerg van zowel de femur en de tibia worden dan geoogst en culturen zijn gevestigd. Gekweekte beenmergcellen worden vervolgens getransfecteerd en geanalyseerd.

Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

Het wordt steeds duidelijker dat elektroporatie de meest effectieve methode is om plasmide-DNA of siRNA in primaire cellen in te brengen. De Gene Pulser ...

Deze procedure begint met het oogsten van de femura en tibia van muizen. Na verwijdering van de heup-, knie- en enkelgewrichten wordt het merg geïsoleerd door middel van injectie van RPMI-medium in het open uiteinde van het bot. Na het verkrijgen van een enkelcel-suspensie worden de beenmergcellen gedifferentieerd tot mestcellen, overgebracht naar 96-wells elektroporatieplaten en vervolgens getransfecteerd.Maak gebruik van het Gene Pulse- of MX cell-electroporatiesysteem. Met behulp van vierkante golfpuls-protocollen kunnen transfectie-efficiënties van ongeveer 30% worden behaald. De eerste stap van de procedure is het oogsten van beenmerg uit het dijbeen en het scheenbeen van een muis van zes tot 12 weken oud.Begin met het euthanaseren van de muis door CO2-inhalatie en oogst het dijbeen en het scheenbeen uit de achterpoten van elke muis. Snijd vervolgens met het scheermesje aan beide uiteinden van het dijbeen om de heup- en kniegewrichten te verwijderen en het merg op een soortgelijke wijze bloot te leggen. Snijd aan beide uiteinden van het scheenbeen om de regio's rond de knie en enkel te verwijderen en het merg bloot te leggen.Neem vervolgens een spuit met een naald van 26,5 gauge en vul deze met RPMI aangevuld met 10% FBS, penicilline, streptomycine, beamer, capita ethanol en L-glutamine. Houd het bot met een pincet boven een petrischaal met RPMI-medium. Steek de spuitnaald in één uiteinde van het bot en druk op de zuiger om het beenmerg uit te spoelen.De spuitnaald kan in het bot op en neer worden bewogen om het resterende merg uit te spoelen. Herhaal de procedure voor alle botten en ga vervolgens over tot het aanleggen van de culturen. Om de beenmergculturen aan te leggen, pipetteert u het uitgespoelde beenmerg meerdere keren op en neer om het weefsel op te breken tot een celsuspensie.Plaats vervolgens een filter van 70 micron bovenop een conische buis van 50 milliliter en voeg de celsuspensie toe aan het filter. Spoel daarna de petrischaal één keer met RPMI. Voeg het spoelmiddel toe aan het filter van 70 micron en gebruik het rubberen uiteinde van een zuiger van een spuit van 1 milliliter om de resterende stukjes beenmerg bovenop het filter van 70 micron fijn te wrijven.Was het filter eenmaal met RPMI nadat het filter is gewassen. Centrifugeer de celsuspensie 5 minuten lang bij 1200 RPM. Was de celpellet door deze opnieuw te suspenderen in PBS.Tel de cellen met een hemocytometer. Gewoonlijk verkrijgen we ongeveer 90 miljoen cellen uit de botten van één muis, bestaande uit twee femura en twee tibiae. Centrifugeer de cellen na het tellen opnieuw bij 1200 RPM gedurende vijf minuten.Resuspendeer de cellen in een kleine hoeveelheid RPMI en verdeel ze in weefselkweekflessen die voldoende RPMI bevatten, zodat de uiteindelijke concentratie 1 miljoen cellen per milliliter is. Voeg vervolgens cytokinen toe om de ontwikkeling van het gewenste celtype te stimuleren. In dit geval wordt het cytokine interleukine 3 toegevoegd om de ontwikkeling van basofielen en mestcellen te bevorderen; voor het verkrijgen van basofielen wordt er 10 dagen geïncubeerd en voor mestcellen vijf weken tijdens de generatie van mestcellen.Het medium en IL drie moeten één keer per week worden ververst. Hier is een weergave van hoe het beenmergcellen er direct na het uitplaten uit moeten zien. Deze afbeelding demonstreert de differentiatie van beenmergcellen tot basofielen en mestcellen 10 dagen na de toevoeging van interleukine drie.Zodra het gewenste celtype is verkregen, wordt overgegaan tot de electroporatiestap. Bepaal aan het begin van de electroporatiestap het aantal cellen in de cultuur. Cellen uit flessen worden doorgaans geëlectroporeerd bij een dichtheid van 10 miljoen per milliliter.Breng vervolgens het vereiste aantal cellen over in conische buizen en centrifugeer de buizen bij 1200 RPM gedurende vijf minuten. Aspireer na het centrifugeren het medium, was de cellen met één keer XPBS en centrifugeer opnieuw bij 1200 RPM gedurende vijf minuten. Aspireer daarna de PBS en voeg BioRad gene pulsar electroporatiebuffer toe om een celsuspensie van 10 miljoen cellen per milliliter te maken.Nadat de cellen opnieuw zijn gesuspendeerd, voegt u het gewenste plasmid DNA toe tot een eindconcentratie van 10 tot 20 micrograms per milliliter. Meng de celoplossing voorzichtig en breng 150 microliters van de celsuspensie aan in de wells naar keuze op een 96 well electroporatieplaat. Plaats vervolgens de electroporatieplaat in de MXL-plaatkamer en sluit het deksel voordat u overgaat tot de transfectie van beenmergcellen en de electroporatie.Het protocol moet in de MXL worden geprogrammeerd, tenzij er gebruik wordt gemaakt van een vooraf ingesteld of opgeslagen protocol via optimalisatie-experimenten; we hebben ontdekt dat de hoogste transfectie-efficiëntie van beenmergcellen wordt behaald met vierkantgolf-puls-protocollen. We variëren de elektroporatiecondities op de plaat om vierkantgolf-pulsen van 2000 µF bij 1000 Ω toe te dienen. Zodra het protocol is ingesteld en op het apparaat is geladen, druk op pulse om de cellen te behandelen; nadat de elektroporatie is voltooid, worden de cellen overgebracht naar een weefkweekplaat.Meestal brengen we elk elektroporatie monster van 150 µL over naar een putje van een 48-wells weefselkweekplaat die 300 µL RPMI bevat met 10 ng/mL interleukine 3. De cellen worden overnacht geïncubeerd bij 37 °C en vervolgens 24 uur later geanalyseerd op expressie en suppressie. Dit is een fluorescentiemicroscopie-opname van de cellen.Na een succesvolle elektroporatie met 20 µg/mL GFP-plasmide, met gebruik van het MX cell elektroporatiesysteem, kunnen transfectie-efficiënties van ongeveer 30% worden behaald. Het systeem stelt u in staat om de condities te variëren om de transfectie-efficiëntie te maximaliseren terwijl de celviabiliteit behouden blijft. Het MX cell systeem is bijzonder nuttig voor primaire zoogdiercellen, zoals deze hematopoëtische muiscellen.We hebben zojuist laten zien hoe u beenmergcellen uit muizen isoleert en gedifferentieerde mestcellen transfecteert met behulp van het MX-cel-electroporatiesysteem. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

the-preparation-primary-hematopoietic-cell-cultures-from-murine-bone

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze procedure laat zien hoe de Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem te gebruiken om snel en gemakkelijk identificeren van de beste elektroporatie voorwaarden voor muis embryonale fibroblasten (MEF) of andere primaire cellen. Overwegingen voor het oplossen van problemen worden ook besproken in de bijbehorende video.

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Een protocol voor snelle CRISPR/Cas9-gemedieerde gene verstoring van muis en mens primaire hematopoietische cellen wordt beschreven in dit artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins worden ingevoerd via electroporation met sgRNAs gegenereerd via in vitro transcriptie en commerciële Cas9. Hoge bewerken rendementen worden bereikt met beperkte tijd en de financiële kosten.

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Dit protocol illustreert een veilige en efficiënte procedure voor het wijzigen van de CD133+ hematopoietische stamcellen. De voorgestelde niet-virale, magnetische polyplex gebaseerde benadering verschaffen een basis voor de optimalisatie van de cel van de stam van de therapeutische effecten ook monitoring van het product door de overheid gereguleerde cel via magnetische resonantie beeldvorming.

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia's en bekkenbotten.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het initiëren, onderhouden en analyseren van hematopoëtische stamcelculturen van muizen met behulp van ex vivo polyvinylalcoholgebaseerde expansie, evenals methoden om ze genetisch te manipuleren door lentivirale transductie en elektroporatie.

Ex Vivo Uitbreiding en genetische manipulatie van hematopoëtische stamcellen van muizen in op polyvinylalcohol gebaseerde culturen

Hier presenteren we protocollen die isolatie van stromale cellen uit muizenbot, beenmerg, thymus en menselijk thymusweefsel mogelijk maken die compatibel zijn met single-cell multiomics.

Stromale celisolatie van hematopoëtische organen

Leer primaire hematopoietische cellen isoleren uit muizenbotmerg en transfecteren via elektroporatie. Deze methode optimaliseert differentiatie naar mestcellen en basofielen met 30% transfectie-efficiëntie voor immunologisch onderzoek.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

Meer video's verkennen