Test voor Neurale Inductie in het kippenembryo

Deze video demonstreert de verschillende stappen in de assay voor neurale inductie in een kiजembyo. Eerst wordt het gastembryo geëxplanteerd in een nieuwe kweek, waarna het donorembryo wordt geëxplanteerd in zoutoplossing en de knoop van Hensen wordt gelabeld met een fluorescerende kleurstof. De knoop van Hensen wordt uit het donorembryo gesneden en getransplanteerd naar het gastembryo.

Het gastembryo wordt 24 uur gekweekt, gefixeerd en verwerkt voor foto-oxidatie onder fluorescentie met dab. Het embryo wordt vervolgens verwerkt voor in-situ hybridisatie met een neurale marker.

Hoi, ik ben Delphine van het Labor Fennell bij het Center for Environmental and Genomic Medicine aan de Texas A&M University in Houston. Vandaag laten we u een procedure zien voor het uitvoeren van neurale inductie-assays in het kikenbryo. Wij gebruiken deze procedure in het laboratorium om de effecten van antiepileptica op de neuraal inducerende eigenschappen van de knoop van Hensen te bestuderen.

Laten we beginnen. Voor de neurale inductie-assay moeten de eieren worden voorbereid. Deze eieren moeten gedurende 13 uur op hun zij in een bevochtigde incubator worden uitgebroed tot hamburger en Hamilton stadium drie plus of HH drie plus.

Bereid vervolgens het gastembryo voor met de nieuwe kweekmethode, die eerder is gedemonstreerd. Bedek in JoVE het oppervlak van het gastembryo met 200 microliters zoutoplossing. Dit zal de latere overdracht en positionering van het donortransplantaat vergemakkelijken.

Dek de opstelling tot slot af met een omgekeerde Falcon 35 millimeter kweekschaal. Om het donorembryo bloot te leggen, wordt het ei geopend door met een pincet op de schaal te tikken. Verwijder de bovenkant van de schaal en gooi deze weg.

Verwijder het dikke albumine met een pincet en kantel de dooierzak met een grove pincet zodat het embryo naar boven is gericht. Knip na het verwijderen van het albumine met een fijne schaar een vierkant uit de dooierzak rondom het embryo. Verwijder het embryo uit de dooier met een lepel en plaats dit in een schaaltje met PBS.

Gebruik vervolgens een pincet om het donorembryo los te maken van de dooier en de area lucida. Zodra het is losgemaakt, wordt het donorembryo overgebracht naar een met een SIL-guard bedekte schaal met PBS om het transplantaat te labelen en te transplanteren. Gebruik een micro-elektrodepuller om onder de microscoop glazen microcapillaire pipetten van 50 µL te trekken.

Snijd de punt van de micropipet af met een fijne pincet. Plaats de micropipet in een petrischaal waarin een strook boetseerklei is aangebracht. Bereid vervolgens de kleurstofoplossing voor, die zal worden gebruikt om het transplantaat te markeren vóór de transplantatie.

Bereid eerst een voorraadoplossing van dye eye van 0,5% in 1 mL absoluut ethanol. Deze voorraadoplossing kan in het donker bij -20 °C worden bewaard. Meng vervolgens in een warmteblok dat is ingesteld op 45 °C 10 µL voorverwarmde dai-voorraadoplossing met 90 µL 0,3 M sucrose. Deze temperatuur is noodzakelijk om neerslag van dai en de vorming van onoplosbare kristallen te voorkomen.

Centrifugeer de oplossing kortstondig in een mini SPECT-centrifuge gedurende vijf tot 10 seconden. De DAI-oplossing is nu klaar voor gebruik; bevestig het donor embryo met insectenspelden op de bodem van de met sill-guard bedekte schaal met de dorsale zijde naar boven. Zodra het embryo is vastgezet, vult u de micropipet opnieuw met D eye door zachte druk uit te oefenen.

Gebruik een aspiratieruurbestuk. Breng een kleine bolus dai aan op de knoop van henson. Herhaal dit en zorg ervoor dat de gehele knoop van henson vervolgens wordt gelabeld.

Snijd de knoop van Henson uit met een microcapillaire pipet of een microdissectiemes; de dorsale zijde van de knoop is te onderscheiden van de ventrale zijde doordat deze een groef vormt, terwijl de ventrale zijde van de knoop vlak is. Markeer indien nodig de dorsale zijde van het transplantaat met carminepoeder. Dit garandeert dat het transplantaat met de juiste dorsoventrale oriëntatie wordt geplaatst.

Overdraag het transplantaat naar het gastembryo met behulp van een microcapillaire pipet en een Gilson-pipet van 10 µL. Breng het transplantaat dicht bij de area opaca, de ondoorzichtige begrenzingsregio op het niveau van de knoop van Hensen van het gastembryo. Gebruik vervolgens een microcapillaire pipet of een micro-dissectiemes om een kleine incisie van 80 tot 100 µm in dit gebied te maken.

Lucita-gebied ondoorzichtig begrensd op het niveau van de knoop van henson van het gastembryo. Gebruik een microcapillaire pipet of een microdissectiemes. Positioneer het transplantaat zodanig dat de ventrale zijde naar u toe is gericht en het posterieure uiteinde parallel loopt aan de overeenkomstige regio in het gastembryo O. Zodra het in positie is, verwijdert u de zoutoplossing uit het gastembryo, waarbij u ervoor zorgt dat het transplantaat in nauwe nabijheid van de gastlocatie blijft, en bereidt u het gastembryo voor op een nieuwe kweek gedurende 18 tot 22 uur, zoals beschreven in onze vorige indiening.

Na 24 uur cultuur wordt het embryo uit de incubator gehaald en vastgepind in een cigar dish. De aanwezige PBS wordt verwijderd en vervangen door 4% paraformaldehyde. Het embryo wordt vervolgens 24 uur gefixeerd.

Voer de fixatievloeistof af in een geschikte bak voor gevaarlijk afval en voeg PBS toe aan de fixatieschaal. Verwijder de insectenpinnen met een pincet nadat de pinnen zijn losgekomen. Gebruik een stompe Pasteurpipet om het embryo over te brengen naar een scintillatiebuisje met PBS.

Was het embryo twee keer in PBS gedurende vijf minuten per keer en eenmaal in Tris-buffer gedurende vijf minuten. Breng het embryo na het wassen over naar een glazen cavity-preparaatglas met 0,1 milliliters Tris-buffer. Vervang de Tris-bufferoplossing door 0,1 milliliter DAB-oplossing. Gooi de pipetpunt weg in een emmer met een bleekmiddeloplossing.

Om DAB te ontkleuren, plaatst u een dekglas op de holle slide onder FEI fluoresceïne-isothiocyanaat fluorescentie-focus. Het objectief van de microscoop op de donorcellen van het transplantaat zal fluorescent rood verschijnen en wordt blootgesteld aan FEI-fluorescentie totdat alle fluorescent rode cellen bruin zijn geworden. Dit gebeurt doordat het fluorochroom door blootstelling aan de FEI-excitatiegolflengte wordt gefotoconverteerd naar onoplosbare bruine kristallen.

4 88 nanometer in de aanwezigheid van dab. Dit proces duurt tussen de 20 minuten en twee uur. Na voltooiing van de foto-oxidatiereactie wordt het dekglas met een fijne pincet verwijderd.

Breng het embryo over naar een scintillatieflacon van 20 milliliter met PBTW of PBS met 0,1% tween 20. Deactiveer tot slot DAB van het dekglas, het objectglas en de glazen holte. Behandel het embryo voor visualisatie door het te incuberen in een bleekmiddeloplossing.

Ga verder met in-situ hybridisatie en incubeer het embryo alleen voor de DIG-gelabelde probe. Begin vervolgens met het fotograferen en doorsnijden zoals beschreven in Jo Video twee. Hier is een voorbeeld van een neurale inductie-assay.

Aanvankelijk wordt het transplantaat geplaatst op de grens tussen de area lucita en de area alpaca van het gastembryo. Zowel de donor- als de gastembryo's bevinden zich in stadium drie plus. Na negen uur in cultuur begint het transplantaat te differentiëren en induceert het wat lijkt op een miniatuurkop in stadium acht minus.

Na 24 uur in cultuur is de neurale inductie voltooid na fixatie. Het embryo wordt verwerkt voor foto-oxidatie. Aanvankelijk is te zien dat de met kleurstof gelabelde cellen van de donor zijn geprolifereerd om een miniatuur-Noor te vormen, zoals hier in het rood te zien is.

Na foto-oxidatie kleuren deze cellen bruin. Het embryo wordt vervolgens verwerkt met whole mount in situ hybridisatie voor de neurale marker Otx2, ontwikkeld in het laboratorium van Dr. Bonelli.

Het donor-transplantaat induceert de expressie van OTX2 in weefsel afkomstig van de gastheer. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe een neurale inductie-assay in het cheek-embryo kan worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat na transplantatie alle vloeistof in het gebied rondom het transplantaat moet worden verwijderd met een micropipet.

Dit zorgt ervoor dat het transplantaat stevig gepositioneerd is en dat het zich tijdens de kweek niet zal verplaatsen ten opzichte van het gastembryo. Dat was het. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.