Name: Detectie en isolatie van levensvatbare muis IL-17-afscheidende T-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Leer de detectie en isolatie van levensvatbare muis IL-17-afscheidende T-cellen met behulp van cytokine-secretieassay-technologie. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van cytokinedetectie op enkel-celniveau.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De voorbereiding van de reagentia <ol><li> Maak een buffer met PBS met BSA (0,5%), en 2 mM EDTA. Omdat de luchtbellen kan blokkeren MACS scheiding kolommen, de buffer moet worden ontgast en bewaard bij 2-8 ° C voor gebruik. </li><li> We maken gebruik van RPMI 1640 medium dat 5% muis serum. Het kweekmedium mag geen BSA of FCS, aangezien voor deze verbindingen zal de specificiteit van de cel stimulatie te veranderen. </li><li> De muis IL-17 secretie test - Cel Verrijking en Detection Kit van Miltenyi-Biotec. De kit bevat de volgende onderdelen: de IL-17 Catch Reagens, de IL-17 detectieantilichaam (Biotine), de Anti-biotine-PE en de Anti-PE microbolletjes. </li></ol> Het stimuleren van de Splenocyten <ol><li> Dit protocol is uitgevoerd in de aanwezigheid van een negatieve en positieve controle, zoals ongestimuleerde splenocyten en een tegenkleuring voor de T-cellen. Dit protocol is uitgevoerd met behulp van steriele techniek. </li><li> Bereid een celsuspensie van de muis splenocyten die werden geïsoleerd met behulp van de gentleMACS ™ Dissociator. De concentratie van de cellen moet worden vooraf via de cel tellen. Pellet de cellen bij 200 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na centrifugatie, aspireer het supernatans uit de korrel met een pipet. Niet decanteren de buis om verlies van de pellet te voorkomen. </li><li> Nu, resuspendeer de cellen in het kweekmedium en vervolgens aan een goed. Voeg voldoende medium voor een concentratie van tien miljoen cellen per ml en vijf miljoen cellen per vierkante cm. </li><li> Het stimuleren van een immuunreactie in onze cellen geresuspendeerd, voegen we ionomycine (1 ug / ml) en PMA (10 ng / ml) aan het monster en meng de oplossing door voorzichtig en neer te pipetteren. Dan de putten worden dienovereenkomstig geëtiketteerd. </li><li> Nu zullen we onze cellen incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C zonder te mengen op de stimulatie periode te beginnen. Ga verder met IL-17 analyse 3 uur vanaf het begin van de stimulatie, zo dienovereenkomstig plannen. </li><li> Om te stoppen secretie, worden de cellen op ijs en we verzamelen de gestimuleerde cellen door voorzichtig en neer te pipetteren met koude buffer. Cellen worden dan overgebracht van de put naar een buis en worden gewassen een tweede keer. </li><li> Om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld, is het een goed idee om uw schotel te kijken onder een microscoop. Als cellen nog steeds aangesloten, kunt u het verzamelen van de resterende cellen door het spoelen van de schotel met koude buffer. Elke cel klonten in je cel suspensie kan worden verwijderd met de pre-scheiding filters. </li></ol> Het labelen van de Cellen met Catch reagens <ol><li> Het is van groot belang op te merken, dat deze test optimaal werkt als minder dan 2% van de IL-17-afscheidende cellen aanwezig zijn. </li><li> Als de concentratie van IL-17 afscheidende cellen wordt verwacht dat meer dan 2% worden dienovereenkomstig aan te passen volumes. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="figuur 8" width="500" height="162" /></li><li> Een mogelijke valkuil van deze procedure is kruisbesmetting van de Catch reagens, die kunnen optreden tijdens de etikettering als de bi-specifieke antilichaam bindt aan een niet-afscheidende T-cel en vallen IL-17 afgescheiden uit een naburig lymfocyt, waardoor het genereren van valse positieven. </li><li> Om dit probleem te omzeilen, is het essentieel om af te koelen cellen af ​​voorafgaand aan de etikettering van en werken met koude buffer om verspreiding van IL-17 langzaam en dit kruisbesmetting te voorkomen. In aanvulling op het houden van de cellen te koud is, moeten ze worden bewaard bij een bepaalde concentratie. </li><li> Om te beginnen de etikettering procedure maken we gebruik van tien miljoen cellen in een 15 ml afsluitbare buis. Als hogere cel aantallen moeten worden gebruikt, simpelweg schaal-up van alle volumes dienovereenkomstig. Zodra de optimale celconcentratie is verkregen, was de cellen door het toevoegen van 10 ml koud buffer. </li><li> Spin down de cellen op 300 xg gedurende 10 minuten in een gekoelde centrifuge (2-8 ° C). </li><li> Na centrifugatie, aspireer het supernatant volledig met behulp van een pipet. Niet decanteer het supernatant omdat dit zal leiden tot cel-verlies en onnauwkeurig volumes. Herhaal het wassen stap die bestaat uit het toevoegen van 10 ml koude buffer, centrifugeren, en aspiratie. </li><li> Nu we een pellet van de gewenste zuiverheid hebben, resuspendeer de cellen in 80 microliter van koud kweekmedium. Om label hen, zullen we nu toevoegen 20 ul van Mouse IL-17 Catch reagens. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 5 minuten op ijs. </li><li> Na de 5 minuten incubatietijd op ijs, verwijdert u de tube en verdun de cellen in 10 ml van 37 ° C warm medium. Bevestig vervolgens de buis op de MACSmix Tube Rotator en incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 45 min onder voortdurend in beweging. Het verhogen van de temperatuur tot 37 ° C wordt opnieuw gestart cytokine secretie. </li></ol> Het labelen van de cellen met IL-17 detectieantilichaam (biotine) en Anti-biotine-PE <ol><li> Na de 45 minuten periode van afscheiding bij 37 ° C, onmiddellijk plaats de buis op het ijs. Dit zal stoppen met cytokine secretie. Vanaf hier is het essentieel om cellen te houden op het ijs.Werken met koude buffer voorkomt kruisbesmetting van de Catch reagens. </li><li> Vul de buis met koude buffer en centrifugeer bij 300xg bij 2-8 ° C gedurende 10 minuten. Volledig aspireren het supernatant. Herhaal de wasstap nog een keer. </li><li> De cel pellet wordt geresuspendeerd in 80 ul van koude buffer en de buis is geplaatst op ijs. </li><li> Om te voorkomen dat niet-specifieke binding van het antilichaam, raden wij de toevoeging van 10μl FcR Blocking Reagent en incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Dan voegen we 20 ul van Mouse IL-17 detectieantilichaam (Biotine), dat is geconjugeerd aan biotine en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. </li><li> Nogmaals, wassen cellen als we eerder hebben gedaan door het toevoegen van 10 ml koude buffer en centrifugeer bij 300xg bij 2-8 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Nu het supernatans aspireren en resuspendeer de cel pellet in 80 ul van koude buffer. </li><li> Voeg 20 ul van onze secundaire antilichaam, anti-biotine-PE. </li><li> Meng de cellen en secundaire antilichaam-oplossing, en weer de buis incubeer gedurende 10 minuten op ijs. </li><li> Zodra deze tweede incubatie is voltooid, was de cellen met 10 ml koude buffer en centrifuge. </li><li> De pellet kan nu worden gesuspendeerd in 500 pi van koude buffer. </li><li> Als de cellen moeten worden gescheiden voor verder stroomafwaarts analyse, kunnen ze magnetisch gelabeld worden met anti-PE-microbolletjes en het handmatig of automatisch gescheiden met behulp van MACS Kolommen en MACS Separators. </li><li> We hebben nu de etikettering van de splenocyten en zijn klaar voor analyse. </li></ol> FACS-analyse <ol><li> Voor onze analyse, zullen we vergelijken gestimuleerd en ongestimuleerde splenocyten door flowcytometrie. </li><li> Voordat flowcytometrische analyse, worden de cellen gekleurd met propidiumjodide op 0,5 ug / ml tot gate uit dode cellen. De MACSQuant ™ Analyzer was geladen met 200.000 cellen voor elk monster en we nu gaan kijken naar de spreiding percelen van relatieve antilichaamreactiviteit in de monsters. Twee belangrijke overwegingen voor de analyse van zeldzame cellen - zoals IL-17 positieve cellen - door flowcytometrie zijn: <ul><li> het instellen van een poort op lymfocyten in de voorwaartse verstrooiing versus kant scatterplot </li><li> en gating uit dode cellen (gekleurd met propidiumjodide) en B-cellen (die niet-specifieke achtergrondkleuring kan veroorzaken) aan verdere versterking van de gevoeligheid van de detectie </li></ul></li><li> We gebruikten CD4-APC antilichaam aan T-cellen en de CD45R/B220-PerCP antilichaam tegen de B-cellen te detecteren detecteren. We zien de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing eigenschappen van de monsters en breng een hek aan de lymfocyten bevolking. </li><li> Een tweede poort was toegepast op de gekleurde dode cellen en gekleurd B-cellen (Y-as) te zien. Deze cellen zijn uitgesloten van de T-cel-analyse. </li><li> In dit voorbeeld, dat in wezen onze negatieve controle, kunnen we zien dat er zeer weinig IL-17 afscheiden CD4-positieve T-cellen in ongestimuleerde monsters - ongeveer 0,003% (figuur 4). Kijkend naar de gestimuleerde T-cel populatie, zien we een groot aantal CD4-positieve T-cellen die IL-17 afscheiden - ongeveer 0,367% (figuur 5A) voor de scheiding en 60,76% na magnetische scheiding met MACS Technology (figuur 5B). </li></ol>

Alle protocollen en data sheets zijn beschikbaar op www.miltenyibiotec.com. Waarschuwingen Reagentia bevatten natriumazide. Onder zure omstandigheden natriumazide opbrengst stikstofwaterstofzuur zuur, dat zeer giftig is. Azide stoffen moeten worden verdund met stromend water voor weggooien. Deze voorzorgsmaatregelen zijn aanbevolen om afzettingen in de leidingen waar explosieve omstandigheden kunnen ontstaan ​​te voorkomen.

Th17 cellen spelen een integrale rol in adaptieve immuniteit en de ontstekingsreactie en zijn een belangrijk onderdeel bij het stimuleren van auto-immune ontsteking. Deze video wordt beschreven hoe u Miltenyi&#39;s Mouse gebruiken IL-17 secretie test - Cel Verrijking en Detection Kit (PE). Bij het doen van deze procedure is het belangrijk om een ​​schatting van de frequentie van de IL-17-afscheidende cellen in uw vertrekpunt celpreparaat. De juiste cel concentratie tijdens de etikettering en de cytokine secretie periode voorkomt kruisbesmetting van andere cellen in uw vering en garandeert betrouwbare resultaten.

<table><tbody><tr><td>Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) </td><td>Reagens</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reagens</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reagens</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidiumjodide-oplossing</td><td>Reagens</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcR-blokkeringsreagens, muis </td><td>Reagens</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit </td><td>Reagens</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Dissociator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Starting Kit</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS-kolommen</td><td>Hulpmiddel</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS-separator</td><td>Hulpmiddel</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detectie en isolatie van levensvatbare muis il-17-afscheidende t-cellen

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

De MACS Cytokine Secretie Assay-technologie maakt de ontdekking van uitgescheiden cytokines op de single cell niveau en de gevoelige isolatie van levensvatbare cytokine-afscheidende cellen. Om de IL-17-afscheidende cellen, een enkele celsuspensie van de muis splenocyten wordt voorbereid en gestimuleerd bij 37 ° C met PMA / ionomycine tot cytokine secretie te induceren label. Om te stoppen secretie cellen worden vervolgens geplaatst op ijs en worden blootgesteld aan de IL-17 Catch Reagent een bi-specifiek antilichaam dat bindt aan CD45 op het celoppervlak van leukocyten en IL-17 als het is afgescheiden en gevangen in de buurt van het celoppervlak. Secretie wordt dan opnieuw gestart door het verhogen van de temperatuur tot 37 ° C en IL-17 is gevangen door de Catch reagens. Secretie wordt dan weer tegengehouden, door het plaatsen van cellen op ijs. Voor het detecteren van de gevangen IL-17 worden cellen geïncubeerd met een tweede IL-17-specifiek antilichaam geconjugeerd aan biotine en een anti-biotine-PE antilichaam. Cellen kunnen nu direct worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie of voorbereid voor de isolatie en de verrijking door latere labeling met Anti-PE geconjugeerd microbolletjes.

Deze procedure beschrijft de detectie en isolatie van de muis Th17 leukocyten die actief IL-17 afscheiden na stimulatie.

Detectie en isolatie van levensvatbare muis IL-17-afscheidende T-cellen

De MACS Cytokine Secretion Assay-technologie maakt de detectie van gesecreteerde cytokinen op single-cell niveau en de sensitieve isolatie van levensvatbare ...

De max Cytokine secretie-assay technologie maakt detectie van gesecreteerde cytokinen op enkelcelniveau mogelijk en de sensitieve isolatie van levensvatbare cytokine-secreterende cellen om IL 17-secreterende cellen te labelen. Er wordt een enkelcel-suspensie van muizenleukocyten bereid en gestimuleerd bij 37 °C met PMA ionomycine om cytokine-secretie te induceren en vervolgens te stoppen. De cellen worden daarna op ijs geplaatst, waar ze worden blootgesteld aan het IL 17 catch-reagens.Zodra de secretie opnieuw wordt gestart door de temperatuur te verhogen naar 37 °C, wordt IL 17 opgevangen door het catch-reagens. Een bispecifiek antilichaam bindt aan CD 45 op het celoppervlak van leukocyten en aan IL 17 zodra dit wordt uitgescheiden en nabij het celoppervlak wordt opgevangen. De secretie wordt vervolgens opnieuw gestopt door de cellen op ijs te plaatsen om het opgevangen IL 17 te detecteren. De cellen worden geïncubeerd met een tweede IL 17-specifiek antilichaam geconjugeerd aan biotine en een anti-biotine PE-antilichaam. De cellen kunnen nu direct worden geanalyseerd via flowcytometrie of worden voorbereid voor isolatie en verrijking door daaropvolgende labeling met anti-PE-geconjugeerde microbeads. Hallo, mijn naam is Ellie Rankin, een van de wetenschappers bij Miltenyi Biotec.Vandaag ga ik u een procedure laten zien om TH 17-leukocyten te isoleren en te detecteren, die na stimulatie IL 17 uitscheiden. IL 17 speelt een belangrijke rol bij de adaptieve immuniteit en de ontstekingsreactie en is ook belangrijk bij het aansturen van auto-immuunontstekingen. Laat me u laten zien hoe de assay wordt uitgevoerd. Voor het protocol van vandaag moeten we eerst een buffer maken die PBS bevat met BSA en 2 mM EDTA; omdat luchtbellen de Max separation-kolommen kunnen blokkeren, moet de buffer worden ontgast en bewaard bij 2 tot 8 °C vóór gebruik.Ten tweede gebruiken we RPMI 1640-medium met 5% muisserum. Het cultuurmedium mag geen BSA of FCS bevatten, aangezien deze verbindingen de specificiteit van de celstimulatie zullen beïnvloeden. Ten slotte heeft u de mouse IL 17 secretion assay cell enrichment and detection kit van MIL 10 E Biotech nodig.De kit bevat de volgende componenten: het IL 17 catch-reagens, het IL 17 detectie-antilichaam, biotine, de anti-biotine PE en de anti-PE microbeads. Logischerwijs zult u dit protocol waarschijnlijk uitvoeren met een negatieve en positieve controle, zoals niet-gestimuleerde PLE-cyten, en een tegenkleuring voor T-cellen. Voor onze demonstratie zullen we ons uitsluitend richten op de gestimuleerde cellen.Dit protocol wordt uitgevoerd met behulp van steriele technieken. Ons protocol begint met een single-cell suspensie van muis-SP-cyten die zijn geïsoleerd met behulp van de gentle max associator. De celconcentratie dient vooraf te worden bepaald via celtelling.Centrifugeer de cellen om een pellet te vormen bij 200 Gs gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie aspireren we het supernatant boven de pellet af met een pipet. Schenk de buis niet leeg om verlies van de pellet te voorkomen. Resuspendeer de cellen vervolgens in het kweekmedium en voeg dit toe aan de well; voeg voldoende medium toe voor een concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter en 5 miljoen cellen per vierkante centimeter.Om een immuunrespons in onze geresuspendeerde cellen te stimuleren, voegen we ionmycine en PMA toe aan het monster en mengen we de oplossing door voorzichtig op en neer te pipetteren. Vervolgens worden de wells dienovereenkomstig gelabeld. Nu incuberen we het geheel gedurende drie uur bij 37 °C zonder te mengen om de stimulationsperiode te starten.Ga drie uur na het begin van de stimulatie over tot de analyse van IL 17. Plan dit dus dienovereenkomstig in. Hier zien we gestimuleerde miltcellen van muizen.Let op de kenmerkende morfologie en celclustering van de gestimuleerde cellen. Voor de duidelijkheid volgen we alleen de gestimuleerde cellen. Om de secretie vanaf dit punt te stoppen, verzamelen we de gestimuleerde cellen door voorzichtig met een pipet op en neer te zuigen.Met koude buffer worden de cellen vervolgens van de well naar een buis overgebracht en voor een tweede keer gewassen. Om er zeker van te zijn dat alle cellen zijn verzameld, is het raadzaam om de schaal onder een microscoop te controleren. Als er nog cellen aanhecht zijn, kunt u de resterende cellen verzamelen door de schaal te spoelen.Met koude buffer kunnen eventuele celklonten in uw celsuspensie worden verwijderd met behulp van de pre-participatiefilters. Een potentieel struikelblok bij deze procedure is kruisbesmetting van het opvangreagens, wat tijdens het labelen kan optreden. Wanneer het bispecifieke antilichaam bindt aan een niet-secreterende T-cel en IL 17 opvangt dat is uitgescheiden door een naburig lymfocyt, ontstaan er fout-positieve resultaten. Om dit probleem te omzeilen, is het essentieel om de cellen vóór het labelen af te koelen en met koude buffer te werken om secretie te beperken en de diffusie van IL 17 te vertragen, zodat deze kruisbesmetting wordt voorkomen.Het is van cruciaal belang om op te merken dat kruiscontaminatie ook kan optreden als meer dan 2% IL 17-secreterende cellen aanwezig zijn. Indien wordt verwacht dat de concentratie IL 17-secreterende cellen hoger is dan 2%, dienen de volumes dienovereenkomstig te worden aangepast. Daarom moeten de cellen, naast het koel houden, op een gedefinieerde concentratie worden bewaard.Om te beginnen met de labelingsprocedure gebruiken we 10 miljoen cellen in een afsluitbare buis van 15 milliliter. Indien er hogere celconcentraties gebruikt moeten worden, schaal dan eenvoudigweg alle volumes dienovereenkomstig op. Zodra de optimale celconcentratie is bereikt, worden de cellen gewassen door 10 milliliter koude buffer toe te voegen.Centrifuge de cellen nu 10 minuten bij 300 Gs in een gekoelde centrifuge; aspireer na de centrifugatie het supernatant volledig met een pipet. Schenk het supernatant niet af, omdat dit leidt tot celverlies en onnauwkeurige volumes. Herhaal de wasstap, die bestaat uit het toevoegen van 10 milliliters koude buffer, centrifugatie en aspiratie.Nu we een pellet van de gewenste zuiverheid hebben, resuspenderen we de cellen in enkele microliters koud cultuurmedium om ze te labelen. We voegen nu 20 microliters muis IL 17 catch-reagens toe. Incubeer de cellen gedurende vijf minuten op ijs.Haal de buis na de incubatieperiode van vijf minuten op ijs uit de koeling en verdun de cellen in 10 milliliters voorverwarmd medium van 37 degrees Celsius. Bevestig de buis vervolgens in de MaxMix buisrotator en incubeer de buis gedurende 45 minuten bij 37 degrees Celsius.Bij continue menging zorgt het verhogen van de temperatuur naar 37 °C ervoor dat de cytokine-secretie opnieuw start. Plaats de buis na de secretieperiode van 45 minuten bij 37 °C onmiddellijk op ijs. Dit stopt de cytokine-secretie.Vanaf dit punt is het cruciaal om de cellen op ijs te houden. Door met koude buffer te werken, wordt kruiscontaminatie van het vangreagens voorkomen. Vul de buis aan met koude buffer en centrifugeer bij 300 Gs bij twee tot acht graden Celsius gedurende 10 minuten.Aspireer het supernatant volledig. Herhaal de wasstap nog een keer. De celpellet wordt geresuspendeerd in 80 µL koude buffer en de buis wordt op ijs geplaatst.Om aspecifieke binding van het antilichaam te voorkomen, raden wij aan om 10 µL FCR-blokkeringsreagens toe te voegen en vijf minuten op ijs te incuberen. Vervolgens voegen we 20 µL muis IL 17-detectieantilichaam toe dat geconjugeerd is aan biotine en incuberen we dit 10 minuten op ijs. Was de cellen opnieuw zoals eerder beschreven door 10 mL koude buffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 ×g bij 2 tot 8 °C.Aspireer nu het supernatant en resuspendeer de celpellet in 80 µL koude buffer en voeg 20 µL van onze secundaire antilichaam toe, Anti biotin pe. Meng de cellen met de secundaire antilichaamoplossing en incubeer de buis opnieuw gedurende 10 minuten op ijs.Zodra de tweede incubatie is voltooid, worden de cellen gewassen met 10 milliliters koude buffer en gecentrifugeerd. De pellet kan nu worden geresuspendeerd in 500 microliters koude buffer. Als de cellen moeten worden gescheiden voor verdere downstream-analyse, kunnen ze magnetisch worden gelabeld met anti PE-microbeads en handmatig of geautomatiseerd worden gescheiden met behulp van max-kolommen en max-separatoren.We hebben nu de labeling van onze SPLU-cyten voltooid en zijn klaar voor de analyse. We zullen de gestimuleerde en ongestimuleerde SP-cyten met flowcytometrie vergelijken voordat we de run starten. De cellen worden gekleurd met propidiumjodide in een concentratie van 0.5 µg/mL om dode cellen uit te sluiten via gating.De flowcytometer werd geladen met 200.000 cellen per monster en we gaan nu kijken naar de scatterplots van de relatieve antilichaamreactiviteit in de monsters. Twee belangrijke overwegingen bij de analyse van zeldzame cellen, zoals IL 17-positieve cellen, via flowcytometrie zijn het instellen van een gate voor lymfocyten in de plot van forward scatter versus side scatter en het wegfilteren (gating out) van dode cellen die zijn gekleurd met propidiumjodide en B-cellen die aspecifieke achtergrondkleuring kunnen veroorzaken. Om de detectiegevoeligheid verder te verhogen.Hier gebruiken we een CD4 APC-antilichaam om T-cellen te detecteren in het CD45RB PE-antilichaam. Om de B-cellen te detecteren, bekijken we de forward- en side-scatter-eigenschappen van de monsters en passen we een gate toe op de lymfocytenpopulatie. Een tweede gate werd toegepast om de gekleurde dode cellen en gekleurde B-cellen op de Y-as te visualiseren.Deze cellen worden uitgesloten van de T-celanalyse. In dit voorbeeld, dat in essentie onze negatieve controle is, kunnen we zien dat er zeer weinig IL 17-secreterende CD four-positieve T-cellen aanwezig zijn in ongestimuleerde monsters, ongeveer 0,003%. Kijkend naar de gestimuleerde T-celpopulatie, zien we een aanzienlijk aantal CD four-positieve T-cellen die IL 17 secreteren, ongeveer 0,367% voor de scheiding en 60,76% na magnetische scheiding met max-technologie. We hebben u zojuist via videodocumentatie laten zien hoe u de mouse IL 17 secretion assay for the cell enrichment and detection kit van mul 10 biotech met behulp van pe gebruikt.Het belangrijkste onderdeel van deze procedure is een inschatting te hebben van de frequentie van IL 17-secreterende cellen in de startpopulatie. De juiste celconcentratie zorgt ervoor dat er minder kruisbesmetting optreedt tijdens de labeling en de cytokine-secretieperiode, wat betrouwbare resultaten garandeert. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

detection-and-isolation-of-viable-mouse-il-17-secreting-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video illustrates a method for isolating invariant natural killer T cells, also known as iNKT cells. The procedure begins with injecting a synthetic glycolipid into a mouse to stimulate the activation and proliferation of iNKT cells in the spleen. Subsequently, single-cell suspensions are prepared from the spleen and incubated with iNKT-cell-recognizing complexes labeled with fluorophores, followed by magnetic bead-based separation, to isolate the iNKT cells.

Isolating Invariant Natural Killer T Cells from a Mouse Model

Met effector functies te onderscheiden van andere T-cel subsets, zijn Th17 cellen centraal zijn betrokken bij inflammatoire auto-immuniteit. Deze in vitro Th17 differentiatie protocol verschaft een middel om te bepalen of naïeve CD4 + T-lymfocyten kunnen differentiëren in Th17 cellen en hun rol bij auto-immuniteit en gastheerrespons verder te onderzoeken.

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

In vitro analyse van klasse-switch recombinatie bij muizen is uitdagend vanwege cytofiele IgE-moleculen die gebonden zijn aan Fc-receptoren op het oppervlak van B-cellen.  We beschrijven een methode voor IgE-detectie door middel van trypsine-gemedieerde splitsing van oppervlakte-gebonden IgE vóór fixatie en permeabilisatie voor cytoplasmatische fluorescentiekleuring.

Detectie van True IgE-expressie muis B Lineage Cellen

Naïve CD4+ T-cellen polariseren naar verschillende subsets, afhankelijk van de omgeving op het moment van activering.  De differentiatie van naïve CD4+ T-cellen naar verschillende effector-subsets kan in vitro worden bereikt door de toevoeging van T-celreceptor-stimuli en specifieke cytokine-signalen.

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Hier beschrijven we een protocol om het fenotype van regulatorische T-cellen (Treg) te analyseren die zijn geïsoleerd uit naïeve en chronisch lymphocytaire choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen. Daarnaast bieden we een proces om de onderdrukkende activiteit van de Treg-cellen te evalueren.

Fenotypische en functionele analyse van geactiveerde regulatoire T-cellen Geïsoleerd van Chronische Lymfatische choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen

We beschrijven hier een transgenisch reportermuismodel om de IL-22-producerende cellen in verschillende muisweefsels te visualiseren. Deze methode kan worden gebruikt om de locatie van andere cytokinen of secretoire eiwitten in de muis te volgen.

Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

Groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2's), betrokken bij type 2-ontsteking, nemen voornamelijk deel aan de reactie op worminfectie, allergische aandoeningen, metabole homeostase en weefselherstel. In deze studie wordt een procedure aangetoond om ILC2's te isoleren van murine neusslijmvlies en de expressie van CD226 te detecteren.

Isolatie van groep 2 aangeboren lymfoïde cellen van muis neusslijmvlies om de expressie van CD226 te detecteren

Dit protocol beschrijft de differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in vitro. In combinatie met een op flowcytometrie gebaseerde benadering met meerdere parameters kan met behulp van deze differentiatiemethode een zuiverheid van 90% van pathogene Th17-cellen worden verkregen uit naïeve CD4+ T-cellen.

In vitro differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in muizen

De huidige studie toont protocollen voor het beoordelen van de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen en het manipuleren van genexpressie in deze cellen.

Toegang tot vroege differentiatie van virusspecifieke folliculaire helper CD4+ T-cel in acute LCMV-geïnfecteerde muizen

We bieden een gedetailleerd protocol voor het isoleren en identificeren van zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulaties in muizenlongen door middel van T-celverrijking op basis van magnetische kralen en peptide:major histocompatibility complex (MHC)-tetrameren.

Identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen uit muizenlongen met peptide: belangrijke histocompatibiliteitscomplextetrameren

Leer de detectie en isolatie van levensvatbare muis IL-17-afscheidende T-cellen met behulp van cytokine-secretieassay-technologie. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van cytokinedetectie op enkel-celniveau.

Detectie en isolatie van levensvatbare muis IL-17-afscheidende T-cellen

Meer video's verkennen