Biodistributie van nano-geneesmiddeldragers: toepassingen van SEM

1. Nanoparticle-injectie en orgaanoogst

1. Injecteer nanodeeltjes intraveneus in een verdoving gebrachte muis om passieve targeting mogelijk te maken.
2. Op de gewenste tijdstippen, d.w.z. 1, 4 en 8 weken na injectie, euthanaseren de muizen humaan volgens de richtlijnen van de American Veterinary Medical Association (AVMA).
3. Open de lichaamsholte en verwijder chirurgisch de organen van belang. Plaats de organen in 10% fosfaat gebufferde formaline in een polypropyleen container tot de voorbereiding van het monster.

2. Voorbereiding van weefselmonsters

1. Gebruik pincetten om het muizenweefsel van het fixatief over te brengen naar fosfaat gebufferd zoutoplossing (PBS). Wieg het monster gedurende 30 minuten, waarbij het PBS om de 10 minuten wordt vervangen.
2. Verwijder het weefsel en droog het met een kimwipe. Plaats het vervolgens in een plastic mal met optimaal snijtemperatuur compound (OCT). Bewaar het overnacht bij -80 °C.
3. Breng de volgende dag het monster over naar de cryostaat en stel de temperatuur in op -23 °C.
4. Label de dia's met het type orgaan en de nanodeeltjesgrootte en plaats ze op een plank in de cryostaat.
5. Bedek de cryostaat-chuck met OCT en plaats het monster erop. Laat de extractor-zuiger over het monster zakken en laat het 3-5 minuten gelijkmatig verdelen.
6. Monteer de chuck op de monsterstan en richt deze zodanig dat het mes recht door het bevroren monster kan snijden. Breng het monster dicht bij het mes voor ruw snijden. Stel de dikte in op 30 μm en snijd verschillende secties totdat er een gelijkmatig gesneden plak wordt geproduceerd.
7. Schakel over naar fijn snijden door de dikte van de sectie te verminderen tot 7-8 μm. Verzamel een gesneden sectie door een gelabelde glazen dia op de plak te drukken. Plaats twee dia's op elke dia en bewaar ze in een dia-rek. Laat ze drogen bij kamertemperatuur.
8. Eenmaal droog, dehydrateer de monsters door de dia-rek 3 minuten in 50% ethanol te dompelen om OCT te verwijderen. Breng de rek vervolgens 3 minuten over naar 80% ethanol voordat u de rek in een 1:1-verhouding van koud methanol naar aceton plaatst gedurende 10 minuten bij -20 °C.
9. Verwijder de dia-rek en laat het overtollige oplosmiddel op een papieren handdoek weglopen. Plaats de dia's na 20-30 minuten in een dia-doos en bewaar ze in een vriezer bij -20 °C tot het beeldvormingsmoment.

3. Beeldvorming met hoge resolutie met behulp van SEM en EDS

1. Bereid het monster voor zoals beschreven in "SEM-beeldvorming van biologische monsters." Laad vervolgens het monster in de SEM.
2. Schakel de SEM in en pas de werkafstand aan op ongeveer 5 mm en de versnellingsspanning en straalstroom op 25 keV, wat normaal gesproken te hoog zou zijn voor een biologisch monster. Het monster is echter gecoat voor geleidbaarheid en bescherming.
3. Begin met beeldvorming en zoom tot ongeveer 1.000-2.000x vergroting om de structuren te zien die de nanodeeltjes zouden bevatten. Merk op dat zonder backscatter detectie (BSD) de nanodeeltjes niet onder een bepaalde diepte kunnen worden onderscheiden.
4. Plaats de BSD onder dezelfde parameters en beweeg de stage in de z-richting naar dezelfde werkafstand als voorheen.
5. Begin met beeldvorming bij ongeveer dezelfde vergroting en controleer of u in staat bent om hoog contrast te zien in aanwezigheid van nanodeeltjes. Sla de beelden op.
6. Gebruik verschillende BSD-configuraties (waarbij de ladingen op de detector zijn uitgelijnd) om degene te kiezen die het hoogste contrast voor de nanodeeltjes toont.
7. Zoom in op een gebied met hoog contrast dat een nanodeeltje of klomp nanodeeltjes toont.
8. Open de 2^de camera van de kamer en kijk hoe u de EDS in het systeem inbrengt door op de neerwaartse knop op de SEM-aansluiting te drukken. Zodra de EDS dichtbij maar niet de BSD of de pistool raakt, laat de knop los.
9. Open het Aztec-programma op de EDS-computer (nog steeds op de werkstation) en verzamel een afbeelding van de SEM. Gebruik de "point and shoot"-methode om op een gebied te klikken dat zeer dicht is in contrast en nanodeeltjes. 
10. De EDS toont het spectrum van karakteristieke röntgenstralen vanaf dat punt. Zoek naar zowel barium als titanium-pieken om op de grafiek te worden geïdentificeerd. Dit bevestigt dat wat je bekijkt inderdaad de nanodeeltjes zijn en niet een of ander soort verontreiniging. 
11. Keer terug naar het monster en gebruik de Atlas-software om de randen van het orgaan op de dia in kaart te brengen. Selecteer het "Orgaan" protocol voor het maken van een mozaïekbeeld van het gebied en laat het lopen (dit kan maximaal een paar uur duren). 
12. Zodra het samengestelde beeld door de software is gemaakt en samengesteld, exporteer het als een Tif-bestand. 
13. Open het Tif-bestand in ImageJ, een open source software, en pas de contrastdrempelwaarden aan om de gebieden met zeer hoog contrast (dwz de nanodeeltjes) te markeren. Gebruik ingebouwde functies om het volume van nanodeeltjes te kwantificeren met behulp van de pixelsgrootte die in het orgaanprotocol is gedefinieerd (moet ongeveer 100 nm zijn). 
14. Terwijl deze procedure alleen verwijst naar het 1-week monster van de muizenlong, wordt deze procedure herhaald met de monsters van andere weken en andere organen om een grafiek te compileren die de verdeling toont.
15. Nadat de biodistributie voor elk orgaan voor elke week is berekend, tonen de biodistributiegrafieken de veranderingen in biodistributie en concentratie van nanodeeltjes gedurende de