$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bacteriën zijn microscopisch kleine levende organismen met veel onderscheidende kenmerken zoals vorm, celrangschikking, of ze nu capsules produceren of niet, en of ze sporen vormen. Deze kenmerken kunnen allemaal worden gevisualiseerd door kleuring en helpen bij de identificatie en classificatie van verschillende bacteriesoorten.
Om de eerste twee kenmerken van celvorm en rangschikking te onderzoeken, kunnen we een eenvoudige techniek gebruiken die Gram-kleuring wordt genoemd. Hierbij wordt kristalviolet aangebracht op bacteriën die op een dia zijn vastgemaakt door middel van verhitting. Vervolgens wordt de oplossing van Gram's jodium aan de dia toegevoegd, wat resulteert in de vorming van een onoplosbaar complex tussen het kristalviolet en de oplossing van Gram's jodium. Vervolgens wordt een ontkleurmiddel aangebracht en alle bacteriën met een dikke peptidoglycaanlaag zullen paars worden, omdat deze laag niet gemakkelijk door het ontkleurmiddel kan worden doorboord. Deze bacteriën worden Gram-positief genoemd.
Gram-negatieve bacteriën hebben een dunnere peptidoglycaanlaag en zullen de ontkleurder de-kleuren en de paarse kleur verliezen. Ze zullen echter roodachtig roze worden wanneer een safranine tegenkleuring wordt toegevoegd, die zich bindt aan een lipopolysacharidelaag aan de buitenkant. Eenmaal gekleurd, kunnen de cellen worden waargenomen op morfologie, grootte en rangschikking, zoals in ketens of clusters, wat verder helpt bij classificatie en identificatie.
Een andere nuttige techniek in de toolkit van de microbioloog is de capsulekleuring, die wordt gebruikt om externe capsules te visualiseren die sommige soorten bacteriecellen omringen. Vanwege de niet-ionische samenstelling van de capsule en de neiging om vlekken af te stoten, werken eenvoudige kleuringsmethoden niet. In plaats daarvan wordt een negatieve kleuringstechniek gebruikt, waarbij de achtergrond eerst wordt gekleurd met een zure kleurstof, zoals Congorood, voordat de bacteriecellen worden gekleurd met kristalviolet. Dit laat eventuele capsules die aanwezig zijn als een heldere halo rond de cellen achter.
De laatste grote kleuringstechniek die hier wordt behandeld, kan helpen bepalen of de bestudeerde bacterie sporen vormt. In ongunstige omstandigheden produceren sommige bacteriën endospore, slapende, taaie, niet-reproductieve structuren waarvan de primaire functie is om de overleving van bacteriën te garanderen tijdens perioden van omgevingsstress, zoals extreme temperaturen of uitdroging. Echter, niet alle bacteriesoorten maken endospore, en ze zijn moeilijk te kleuren met standaardtechnieken omdat ze ondoordringbaar zijn voor veel kleurstoffen. De Schaeffer-Fulton-methode gebruikt malachietgroen kleuring, die wordt aangebracht op de bacteriën die op een dia zijn vastgemaakt. De dia wordt vervolgens gewassen met water voordat ze worden tegengekleurd met Safranine. Vegetatieve cellen zullen roze-rood verschijnen, terwijl eventuele endospore die aanwezig zijn, groen zullen verschijnen. In deze video leert u hoe u deze gangbare bacteriekleuringstechnieken uitvoert en vervolgens de kleuringsmonsters onderzoekt met behulp van lichtmicroscopie.
Om de procedure te beginnen, bindt u lang haar terug en draagt u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief een laboratoriumjas en handschoenen.
Maak vervolgens een verse microscoopdia schoon met een laboratoriumdoekje. Pipetteer vervolgens 10 microliter 1X fosfaat-gebufferde zoutoplossing op de eerste dia. Gebruik vervolgens een steriele pipettentip om een enkele bacteriekolonie van de LB-agarplaat te selecteren. Smeer de bacteriekolonie in de vloeistof om een dunne, gelijkmatige laag te produceren. Zet de dia op de werktafel en laat deze volledig drogen.
Eenmaal gedroogd, steekt u een Bunsenbrander aan om de bacteriën te verhitten. Gebruik tongs om de dia meerdere keren door de vlam van de brander te halen, met de bacteriekant omhoog, en zorg ervoor dat u de dia niet te lang in de vlam houdt, omdat dit de cellen kan vervormen.
Nu, werken over de gootsteen, houdt u de dia horizontaal en brengt u verschillende druppels Gram's kristalviolet aan om de bacterie-uitstrijk volledig te bedekken en plaats vervolgens de dia op de werktafel om 45 seconden te staan. Houd vervolgens de dia schuin en spuit zachtjes een straal water op de bovenkant van de dia, zorg ervoor dat u de bacterie-uitstrijk niet direct spuit. Houd nu de dia weer horizontaal en breng Gram's jodiumoplossing aan om de gekleurde bacteriën volledig te bedekken en laat deze vervolgens nog eens 45 seconden staan. Spoel vervolgens voorzichtig het jodium van de dia, zoals eerder getoond. Terwijl u de dia schuin houdt, voegt u een paar druppels Gram's ontkleurder toe aan de dia, waardoor deze over de gekleurde bacteriën loopt, net totdat het afstromen helder is, gedurende ongeveer 5 seconden. Spoel onmiddellijk met water zoals eerder getoond. Dit zal overmatig ontkleuren van de uitstrijk beperken. Houd vervolgens de dia weer horizontaal en breng Gram's safranine tegenkleuring aan om de gekleurde bacteriën volledig te bedekken. Na 45 seconden spoelt u de Safranine voorzichtig van de dia met water, zoals eerder getoond, en dep vervolgens droog met papieren handdoeken.
Ten slotte, voegt u een druppel immersieolie direct toe aan de dia, en onderzoek vervolgens de dia met een lichtmicroscoop met een 100X olieobjectief.
Om dit kleuringsprotocol te beginnen, draagt u eerst de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en zorgt u er vervolgens voor dat de glazen dia's die zullen worden gebruikt, schoon zijn.
Bereid vervolgens de oplossingen voor. Om 1% kristalviolet-oplossing te maken, meng 0,25 gram kristalvioletpoeder met 25 milliliter gedestilleerd water en vortex tot het is opgelost. Bereid vervolgens 1% Congorood-oplossing voor door 0,25 gram Congoroodpoeder te mengen met 25 milliliter gedestilleerd water en vortex tot het is opgelost. Pipetteer nu 10 microliter van de Congorood-oplossing op de dia. Gebruik een schone, steriele pipettentip om een enkele bacteriekolonie van de LB-agarplaat te selecteren. Smeer ver
