Snelle versterking van cDNA-uiteinden

1. Experiment set up for 3’ RACE

1. Ontwerp een 5’ specifiek primer voor een gen van belang (gen specifiek primer 1, GSP-1). Het moet zeer specifiek zijn, aangezien het de enige primer is die specificiteit introduceert. Daarom is een relatief lange primer preferabel (typische lengte rond de 24 nucleotiden, Tm variërend van 55-65˚C). 
2. Ontwerp een tweede, nested primer (GSP-2), d.w.z. de primer moet zich 3’ van GSP-1 bevinden. Deze stap is optioneel, maar het uitvoeren van een tweede PCR met een nested primer zal de opbrengst en specificiteit van de PCR voor het gen van belang verhogen. De primers die worden gebruikt om dSmad2 cDNA's te versterken, staan in Tabel 2 vermeld.

2. Synthese van cDNA 

1. Extract RNA uit monsters, met behulp van een RNA extractie methode of kit volgens het protocol van de fabrikant. Behandel de monsters met DNase om amplificatie van genomisch DNA te voorkomen. In ons voorbeeld hebben we RNA geëxtraheerd uit 10 hele volwassen vliegen.
2. Meet de RNA concentratie met behulp van een microvolume spectrofotometer en pas deze aan met RNase vrij water tot maximaal 100 ng/μl indien nodig.
3. Bereid cDNA voor in een reverse transcriptie (RT) reactie, met behulp van een kit die wordt aanbevolen voor RACE. Bereid een mastermix voor, met de volgende reagentia per monster:
   - 4   μl  Reverse transcriptie buffer (5x)
   - 2   μl  Oligo(dT)₂₀ primer (een oligo bestaande uit 20 deoxythymidinen)
   - 10 μl  RNA (max. 1 μg)
   - 3   μl  ddH₂O
   - 1   μl  reverse transcriptase 
   - TOTAAL: 20 μl
4. Incubeer de reactie gedurende 90 minuten bij 42ºC. Voeg een negatieve controle toe door reverse transcriptase weg te laten.
5. Inactiveer de reverse transcriptase door 5 minuten bij 85ºC te incuberen.
6. Om DNA niveaus voor efficiënte PCR te verdunnen, voeg 80 μl TE buffer toe om het totale volume op 100 μl te brengen.

3. Amplificatie van cDNA fragmenten

1. Bereid de PCR mix voor de eerste ronde amplificatie voor door een high-fidelity (HF) Taq polymerase te gebruiken:
   - 4      μl  5x HF Taq polymerase buffer
   - 0.4   μl  dNTP mix (10 mM elk)
   - 1      μl  GSP1 primer (10 μM)
   - 1      μl  Oligo(dT)20 primer (10 μM)
   - 1      μl  cDNA template
   - 0.2   μl  HF Taq DNA polymerase
   - 12.4 μl  ddH2O
   - Totaal: 20 μl
2. Voer de PCR uit met behulp van het PCR1 programma (Tabel 1). Voeg een negatieve controle toe door als template het originele RNA product zonder RT te gebruiken. Verder kan een 'geen primer' controle worden opgenomen.
3. Optioneel: nested PCR om de specificiteit en de hoeveelheid cDNA producten te verhogen. Verdun 1 μl van de PCR producten en negatieve controle 1:20 in TE buffer. Gebruik ze als template voor de tweede PCR reacties:
   - 4      μl  5x HF Taq polymerase buffer
   - 0.4   μl  dNTP mix (10 mM elk)
   - 1      μl  GSP2 primer (10 μM)
   - 1      μl  Oligo(dT)₂₀ primer (10 μM)
   - 1      μl  PCR product template
   - 0.2   μl  HF Taq DNA polymerase
   - 12.4 μl  ddH2O
   - Totaal: 20 μl
4. Voer de tweede PCR uit met behulp van het PCR2 programma (Tabel 1)

4. Isolatie van cDNA fragmenten

1. Bereid een 1-2% agarose gel met TAE buffer, met behulp van ethidiumbromide of een alternatieve DNA kleurstof. 
2. Meng 5 μl monster met 1 μl van 6x gel lading buffer.
3. Laad de monsters en 1kb DNA ladder als marker en draai de gel aan op 120 V gedurende ongeveer 45 minuten of totdat de kleurfront ~75% van de weg naar beneden de gel is. Zorg ervoor dat de monsters niet uit de gel lopen.
4. Controleer de gel banden onder een UV lamp. Gebruik voor verdere verwerking van de producten lage intensiteit UV, lokaliseer de geamplificeerde banden en snijd ze uit de gel met een scalpel.
5. Zuiver het DNA uit de gel door een methode zoals freeze-squeeze of een kit te gebruiken.
6. Bewaar de gezuiverde cDNA fragmenten bij -20ºC of gebruik ze onmiddellijk voor