What is Rapid Amplification of cDNA Ends and why is it used?

Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a PCR-based method that amplifies unknown nucleotide sequences at the ends of mRNA molecules. It is used when only a partial sequence of a novel mRNA is known. RACE allows researchers to determine missing sequences and identify transcript variants, even without prior knowledge of the complete sequence.

What are the structural features of eukaryotic mRNA ends?

Eukaryotic mature mRNAs have distinctive structural features at both ends. The five-prime end contains a methylated guanosine residue connected via a five-prime to five-prime triphosphate linkage, called the five-prime cap. The three-prime end typically has a poly(A) tail consisting of 20 to 250 adenylate residues that serves as a binding site for non-specific primers.

How does three-prime RACE differ from five-prime RACE?

Three-prime RACE amplifies sequences up to the three-prime end using a gene-specific primer and an oligo(dT) primer that binds the poly(A) tail, detecting transcript variants and different three-prime UTRs. Five-prime RACE first attaches a poly(A) tail at the five-prime end, then amplifies to that end, identifying differential five-prime splice variants and alternative five-prime UTRs.

Why are nested primers used in RACE protocols?

Nested primers are used in a second round of PCR to increase specificity and yield. Because the non-specific oligo(dT) primer and gene-specific primer can cause off-target amplification through random mispriming, nested primers bind downstream of the first set, amplifying only the target cDNA and reducing non-specific products.

What role does reverse transcription play in RACE?

Reverse transcription is the initial step in RACE that synthesizes complementary DNA (cDNA) from isolated mRNA templates. An oligo(dT) primer and reverse transcriptase enzyme generate single-stranded cDNA from the mRNA, creating a template pool from which the target cDNA's unknown ends can be extended and amplified during subsequent PCR reactions.

How are RACE products separated and identified?

RACE products are separated using agarose gel electrophoresis, which separates different transcripts based on their sizes, producing distinct bands. The band of interest is then excised from the gel, purified using a spin column kit, and sequenced to obtain the complete transcript sequence.

What primer design specifications are important for RACE?

Gene-specific primers for RACE should be approximately 24 nucleotides long with a melting temperature (Tm) ranging from 55 to 65 degrees Celsius to ensure high specificity. A second nested primer should be designed downstream of the first primer, also specific for the target sequence, to improve specificity in the second PCR round.

Snelle versterking van cDNA-uiteinden

0 weergaven09:44 min

1. Experiment set up for 3’ RACE

Ontwerp een 5’ specifiek primer voor een gen van belang (gen specifiek primer 1, GSP-1). Het moet zeer specifiek zijn, aangezien het de enige primer is die specificiteit introduceert. Daarom is een relatief lange primer preferabel (typische lengte rond de 24 nucleotiden, Tm variërend van 55-65˚C).
Ontwerp een tweede, nested primer (GSP-2), d.w.z. de primer moet zich 3’ van GSP-1 bevinden. Deze stap is optioneel, maar het uitvoeren van een tweede PCR met een nested primer zal de opbrengst en specificiteit van de PCR voor het gen van belang verhogen. De primers die worden gebruikt om dSmad2 cDNA's te versterken, staan in Tabel 2 vermeld.

2. Synthese van cDNA

Extract RNA uit monsters, met behulp van een RNA extractie methode of kit volgens het protocol van de fabrikant. Behandel de monsters met DNase om amplificatie van genomisch DNA te voorkomen. In ons voorbeeld hebben we RNA geëxtraheerd uit 10 hele volwassen vliegen.
Meet de RNA concentratie met behulp van een microvolume spectrofotometer en pas deze aan met RNase vrij water tot maximaal 100 ng/μl indien nodig.
Bereid cDNA voor in een reverse transcriptie (RT) reactie, met behulp van een kit die wordt aanbevolen voor RACE. Bereid een mastermix voor, met de volgende reagentia per monster:
- 4 μl Reverse transcriptie buffer (5x)
- 2 μl Oligo(dT)₂₀ primer (een oligo bestaande uit 20 deoxythymidinen)
- 10 μl RNA (max. 1 μg)
- 3 μl ddH₂O
- 1 μl reverse transcriptase
- TOTAAL: 20 μl
Incubeer de reactie gedurende 90 minuten bij 42ºC. Voeg een negatieve controle toe door reverse transcriptase weg te laten.
Inactiveer de reverse transcriptase door 5 minuten bij 85ºC te incuberen.
Om DNA niveaus voor efficiënte PCR te verdunnen, voeg 80 μl TE buffer toe om het totale volume op 100 μl te brengen.

3. Amplificatie van cDNA fragmenten

Bereid de PCR mix voor de eerste ronde amplificatie voor door een high-fidelity (HF) Taq polymerase te gebruiken:
- 4 μl 5x HF Taq polymerase buffer
- 0.4 μl dNTP mix (10 mM elk)
- 1 μl GSP1 primer (10 μM)
- 1 μl Oligo(dT)20 primer (10 μM)
- 1 μl cDNA template
- 0.2 μl HF Taq DNA polymerase
- 12.4 μl ddH2O
- Totaal: 20 μl
Voer de PCR uit met behulp van het PCR1 programma (Tabel 1). Voeg een negatieve controle toe door als template het originele RNA product zonder RT te gebruiken. Verder kan een 'geen primer' controle worden opgenomen.
Optioneel: nested PCR om de specificiteit en de hoeveelheid cDNA producten te verhogen. Verdun 1 μl van de PCR producten en negatieve controle 1:20 in TE buffer. Gebruik ze als template voor de tweede PCR reacties:
- 4 μl 5x HF Taq polymerase buffer
- 0.4 μl dNTP mix (10 mM elk)
- 1 μl GSP2 primer (10 μM)
- 1 μl Oligo(dT)₂₀ primer (10 μM)
- 1 μl PCR product template
- 0.2 μl HF Taq DNA polymerase
- 12.4 μl ddH2O
- Totaal: 20 μl
Voer de tweede PCR uit met behulp van het PCR2 programma (Tabel 1)

4. Isolatie van cDNA fragmenten

Bereid een 1-2% agarose gel met TAE buffer, met behulp van ethidiumbromide of een alternatieve DNA kleurstof.
Meng 5 μl monster met 1 μl van 6x gel lading buffer.
Laad de monsters en 1kb DNA ladder als marker en draai de gel aan op 120 V gedurende ongeveer 45 minuten of totdat de kleurfront ~75% van de weg naar beneden de gel is. Zorg ervoor dat de monsters niet uit de gel lopen.
Controleer de gel banden onder een UV lamp. Gebruik voor verdere verwerking van de producten lage intensiteit UV, lokaliseer de geamplificeerde banden en snijd ze uit de gel met een scalpel.
Zuiver het DNA uit de gel door een methode zoals freeze-squeeze of een kit te gebruiken.
Bewaar de gezuiverde cDNA fragmenten bij -20ºC of gebruik ze onmiddellijk voor

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bron: Pablo Sanchez Bosch², Sean Corcoran² en Katja Brückner^1,2,3
¹Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
²Afdeli…

Browse More Videos

RACE techniek

3 RACE

5 RACE

genspecifieke primers

nested PCR

agarosegelelektroforese

reverse transcriptie

oligo dT primer

transcriptvarianten