Name: Microcontact afdrukken van eiwitten voor Celbiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Leer microcontact afdrukken voor celbiologie met fibronectine op glas. Deze techniek creëert complexe extracellulaire omgevingen om celgedrag te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. De voorbereiding van oplossingen en materialen Deze stappen moeten worden uitgevoerd enkele dagen op voorhand. <ol><li> Dekglaasjes. Dekglaasjes werden schoongemaakt door onderdompeling gedurende 10 minuten in een oplossing van Linbro 7X detergent: water, gemengd met een 1: 3 verhouding en verhit, onder roeren, totdat duidelijk. Dekglaasjes werden uitgebreid gespoeld met gedemineraliseerd water, en vervolgens gebakken bij 450 ° C gedurende 6 uur. Het laden van coverslips in keramische vlekken rekken (zie reagentia) vereenvoudigd dit proces. </li><li> Eiwitoplossing voor het stempelen. Reconstitueer fibronectine volgens de instructies van de fabrikant om een ​​voorraad oplossing van 1 mg / ml concentratie. </li></ol> 2. Gegoten stempels van de topologische meester Deze stappen kunnen worden uitgevoerd enkele dagen op voorhand. Store postzegels patroon-up in een overdekte schotel, zoals een weefselkweek schotel. <ol><li> Verwijder los stof van meester met behulp van een stroom van samengeperste, gefilterde lucht of inert gas. </li><li> Plaats de meester, patroon kant naar boven, op de bodem van een plastic schaaltje net groter is dan de meester. 60 - of 100-mm weefselkweek gerechten zijn zeer geschikt voor dit doel. </li><li> In een polystyreen centrifugebuis van 50 ml, combineren de Sylgard componenten in een verhouding van verharder: elastomeer basis van 1: 10 gewicht. Meng grondig met behulp van een plastic apparaat, zoals een wegwerp pipet. Voor te bereiden op zijn minst 0,2 ml van elastomeer per vierkante centimeter van de schotel gebied. </li><li> Centrifugeer de 50 ml buis op 300 G gedurende 5 minuten om luchtbellen te verwijderen. </li><li> Giet het elastomeer over de master, en plaats in een exsiccator, onder vacuüm, gedurende 30 minuten. </li><li> Cure de elastomeer in een oven bij 65 ° C gedurende ten minste 2 uur. Uitharding bij hogere temperaturen en voor langere tijd resulteert in een stijver elastomeer. Laat afkoelen tot kamertemperatuur. </li><li> Afzonderlijk het vel van postzegels van de master. </li></ol> 3. Microcontact printen van fibronectine op glas <ol><li> Knip een stempel. Postzegels van 4 mm x 4 mm tot 1 cm x 1 cm in oppervlakte en 1 - 2 mm dikke zijn het gemakkelijkst om mee te beginnen. Plaats patroon zijde naar boven op een glasplaatje of een klein plastic schaaltje. </li><li> Plaats stempel in een plasma schoner, en het proces, onder vacuüm, gedurende 30 seconden. Een Harrick Wetenschappelijke plasma cleaner (zie Equipment), die op zijn hoogste output setting zal maken van de PDMS oppervlak hydrofiel. Langere tijden resulteren in barsten van de elastomeer. </li><li> Verdun de fibronectine oplossing met gedemineraliseerd water tot een stampende concentratie van 50 ug / ml. </li><li> Plaats een kleine druppel (10 - 50 ul) van stempelen oplossing op de postzegel. Het zal verspreid over het hydrofiele oppervlak. Voeg alleen voldoende oplossing dat de daling van de stempel covers, maar loopt niet over de randen. Laat eiwit hecht het zich aan stempel gedurende 5 minuten. </li><li> Met behulp van een Kimwipe ® of andere schone papieren tissue, pit het grootste deel van het eiwit-oplossing uit de stempel, zonder het patroon regio. </li><li> Droog de resterende oplossing van de stempel onder een stroom van schoon, droog, inert gas, zoals stikstof. </li><li> Met behulp van een pincet, verwijder dan de stempel van het glasplaatje, omkeren, en plaats in contact met de gereinigde glazen dekglaasje (het oppervlak een patroon). Leg een gewicht op de top om goed contact te bevorderen. Het soortelijk gewicht dat de beste patronen biedt, is afhankelijk van de postzegel grootte en patroon; beginnen met een gewicht van 5 g, en pas tussen het stampen of stansen. Laat stempel in contact met het oppervlak voor een minuut. </li><li> Voorzichtig uit elkaar halen van de stack, en een aparte stempel van dekglaasje aan. </li><li> Krachtig spoelen het patroon dekglaasje in PBS, gevolgd door gedeïoniseerd water, eiwit dat niet is geadsorbeerd aan het oppervlak te verwijderen. Droog dekglaasje onder een stikstofstroom. </li></ol> Representatieve resultaten Microcontact printen is een krachtig proces voor patroonvorming moleculen op oppervlakken. Dit proces heeft de mogelijkheid om functies met afmetingen variërend van enkele tientallen micrometers tot honderden nanometers te maken; in Fig. 1A, de logo&#39;s aan de linkerkant zijn elk 200 micrometer in lengte, terwijl de groene plekjes geïllustreerd in Fig. 1B zijn 1 micrometer in diameter en een onderlinge afstand van 4 micrometer intervallen, gemeten hart-op-center. Fig. 1B toont ook een krachtige eigenschap van microcontact afdrukken, namelijk dat het is en additief proces. Meerdere ronden van microcontact printen kan worden toegepast op een oppervlak meercomponentensystemen 3 te creëren. <img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_3/Figure_a.jpg" alt="Figuur A" /><img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_4/FIGURE_B.jpg" alt="Figuur B" />

<ol><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1425 (1997).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Gold+Having+Micrometer+to+Centimeter+Dimensions+can+be+Formed+Through+a+Combination+of+Stamping+with+an+Elastomeric+Stamp+and+an+Alkanethiol+%22Ink%22+Followed+by+Chemical+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching.</a> Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).</li>
<li>St. John, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Glial+Cell+Attachment+to+Microcontact-printed+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).</li>
<li>Kam, L., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+protein-micropatterned-supported+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).</li>
<li>Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Hybrid+Surfaces+of+Proteins+and+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).</li>
<li>Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+costimulatory+ligands+enhances+CD4%2B+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).</li>
<li>Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+presentation+of+L1+and+N-cadherin+in+multicomponent%2C+microscale+patterns+differentially+direct+neuron+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

De microcontact drukproces is conceptueel eenvoudig en zeer robuust, dat is toegepast op patronen een brede waaier van moleculen op een verscheidenheid van substraten. Echter, dit proces blijft iets van een kunst. De specifieke geometrie van het patroon te creëren, eiwit te zijn patroon, toegepast gewicht en coating / stempelen voorwaarden alle van invloed op de kwaliteit stampen. Bijvoorbeeld, te weinig gewicht, toegepast op de grote mogelijkheden, resulteert vaak in hiaten in het patroon zoals te zien in de rechterbovenhoek logo van Fig. ...

<table><tbody><tr><td>Plasmareiniger</td><td></td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Dessiccator</td><td></td><td>Nalge Nunc international</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td></td></tr><tr><td>Eiwitlabelingskit</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Kleuringsrek</td><td>Reagens</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Reagens</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>Diffractierooster</td><td>Reagens</td><td>Edmund Scientific</td><td>3040267</td><td></td></tr></tbody></table>

microcontact afdrukken van eiwitten voor celbiologie

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

De mogelijkheid om patroon eiwitten en andere biomoleculen op substraten is belangrijk voor het vastleggen van de ruimtelijke complexiteit van het extracellulaire milieu. Ontwikkeling van microcontact afdrukken door de Whitesides groep (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/"&gt; Http://gmwgroup.harvard.edu/</a&gt;) In het midden van de jaren 1990 revolutionalized dit gebied door het maken van micro-elektronica / microfabricage technieken toegankelijk voor laboratoria gericht op de life sciences. De eerste implementaties van deze methode gebruikte polydimethylsiloxaan (PDMS) postzegels om patronen van gefunctionaliseerde chemicaliën te maken op materiaaloppervlakken<sup&gt; 1</sup&gt;. Sindsdien zijn er een reeks van innovatieve benaderingen zijn ontwikkeld op patroon andere moleculen, zoals eiwitten<sup&gt; 2</sup&gt;. Deze video toont de basis-proces van het maken PDMS stempels en gebruikt ze om patroon eiwitten, als deze stappen zijn moeilijk om nauwkeurig te drukken in woorden. Wij richten ons op patronen van de extracellulaire matrix eiwit fibronectine op glas dekglaasjes als een specifiek voorbeeld van patronen. Een belangrijk onderdeel van het microcontact drukproces is een topologische meester, van waaruit de postzegels worden gegoten, de omhoog en omlaag regio&#39;s van de meester worden weerspiegeld in de stempel en bepalen de uiteindelijke patroon. Typisch, een meester bestaat uit een silicium wafer bedekt met fotolak en daarna patroon door fotolithografie, zoals hier gebeurt. Creatie van masters met een specifiek patroon vereist gespecialiseerde apparatuur, en wordt het best benaderd in overleg met een fabricage centrum of faciliteit. Echter, bijna elke ondergrond met topologie worden gebruikt als een master, zoals plastic buigingsroosters (zie Reagentia voor een voorbeeld), en dergelijke toevallige masters bieden direct beschikbaar, eenvoudige patronen. Dit protocol begint op het punt van het hebben van een meester in de hand.

Microcontact afdrukken wordt op grote schaal gebruikt voor het patroon eiwitten en andere moleculen op materiaal oppervlakken. Tonen we de basisstappen van dit proces, stempelen patronen van fibronectine op glas.

Microcontact afdrukken van eiwitten voor Celbiologie

Het vermogen om proteïnen en andere biomoleculen in patronen op substraten aan te brengen is essentieel voor het vastleggen van de ruimtelijke complexiteit van de extracellulaire omgeving. ...

Microcontactprinting wordt gebruikt om eiwitten en andere moleculen in patronen aan te brengen op materiaaloppervlakken om de complexiteit van extracellulaire omgevingen na te bootsen. Om te beginnen met microcontactprinting wordt een topologische master gemaakt, waarna soft-lithografie wordt gebruikt om uit de master een stempel van Sylgard te gieten. De stempel kan worden gecoat met eiwit en vervolgens worden gebruikt om eiwitten op een nieuw oppervlak aan te brengen waaraan cellen kunnen hechten.Hoi, mijn naam is Chen. Ik kom uit het laboratorium van dr. Lance Camp in biomedische technologie aan de Columbia University. Hoi, ik ben GT van de afdeling Werktuigbouwkunde.Hallo, ik ben Lance Kem van de afdeling Biomedical Engineering aan de Columbia University. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe cellen reageren op complexe arrangementen van eiwitten in hun extracellulaire omgeving. Deze methode werd halverwege de jaren 90 ontwikkeld door het laboratorium van George Whitesides en is sindsdien een veelgebruikt en waardevol instrument geworden.Er zijn veel variaties op deze techniek, maar vandaag zullen G en Co U het basisproces van microcontactdrukken

microcontact-printing-of-proteins-for-cell-biology

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

Zelf-geassembleerde monolagen (SAM) gevormd uit lange keten alkaan thiolen op goud bieden goed gedefinieerde substraten voor de vorming van eiwit patronen en cel opsluiting. Microcontact printen van hexadecanethiol met behulp van een polydimethylsiloxaan (PDMS), stempel, gevolgd door opvulling met een glycol-beëindigde alkaan thiol monomeer produceert een patroon waarbij eiwitten en cellen adsorberen alleen aan de gestempelde hexadecanethiol regio.

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Een beschrijving van de methoden die worden gebruikt om een ​​HP DeskJet 500-printer te zetten in een bioprinter. De printer kan verwerken levende cellen die transient poriën veroorzaakt in het membraan. Deze poriën kan worden gebruikt om kleine moleculen zoals fluorescerende G-actine nemen in de gedrukte cellen.

Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter

Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Deze 3D microfluïdische printtechnologie drukt arrays van cellen op ondergedompelde oppervlakken af.  We beschrijven hoe arrays van cellen microfluïdisch in 3D-stroomcellen op ondergedompelde oppervlakken worden afgeleverd.  Door op ondergedompelde oppervlakken te printen, werden celmicroarrays geproduceerd die geneesmiddelscreening en cytotoxiciteitsbeoordeling mogelijk maken op een veelvoud van gebieden.

De Ondergedoken afdrukken van cellen op een gemodificeerde oppervlak met behulp van een continue stroom Microspotter

Celcultuur substraten die gefunctionaliseerd zijn met microscopische patronen van biologische liganden hebben een immense bruikbaarheid op het gebied van weefselengineering. Hier demonstreren we de veelzijdige en geautomatiseerde productie van celcultuur substraten met meerdere, microgepatteerde poly(ethyleenglycol) borstels die orthogonale chemieën presenteren die ruimtelijk nauwkeurige en locatiespecifieke immobilisatie van biologische liganden mogelijk maken.

Fabriceren Complex Cultuur Substrates behulp Robotic Microcontact Printing (R-μCP) en Sequential Nucleofiele Substitutie

Dit rapport beschrijft een eenvoudige, gemakkelijk uit te voeren techniek, met behulp van lagedrukvacuüm, om microfluïdische kanalen te vullen met cellen en substraten voor biologisch onderzoek.

Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Hier presenteren we een protocol bij scherm extracellulaire proteïne microarrays voor de identificatie van nieuwe receptor-ligand interacties in hoge-doorvoer. Ook beschrijven we een methode ter verbetering van de opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie met behulp van eiwit-microbead complexen.

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Ons algemene doel is om te begrijpen hoe cellen extracellulaire signalen voelen die leiden tot gerichte axonale groei. Hier beschrijven we de methodologie van licht-geïnduceerde moleculaire adsorptie van eiwitten, gebruikt om gedefinieerde micro-patronen van extracellulaire matrix componenten te produceren om specifieke gebeurtenissen te bestuderen die axon-uitgroei en pathfinding beheersen.

Lichtgeïnduceerde moleculaire adsorptie van eiwitten met behulp van het PRIMO-systeem voor micro patronen om Celresponsen te bestuderen op extracellulaire matrix eiwitten

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Traditioneel wordt celkweek uitgevoerd op vlakke substraten die de natuurlijke omgeving van cellen in vivo slecht nabootsen. Hier beschrijven we een methode om celkweeksubstraten te produceren met fysiologisch relevante gebogen geometrieën en micropatterned extracellulaire eiwitten, waardoor systematisch onderzoek naar cellulaire detectie van deze extracellulaire signalen mogelijk is.

Generatie van multicue cellulaire micro-omgevingen door UV-fotopatterning van driedimensionale celcultuursubstraten

Leer microcontact afdrukken voor celbiologie met fibronectine op glas. Deze techniek creëert complexe extracellulaire omgevingen om celgedrag te bestuderen.

Microcontact afdrukken van eiwitten voor Celbiologie

Meer video's verkennen