Name: Photo-geïnduceerde verknoping van ongeschikte Eiwitten (PICUP) Toegepast op Amyloidogenic Peptiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer de PICUP-methode om oligomeergrootteverdeling van amyloïdogene peptiden te analyseren met lichtgeïnduceerde crosslinking. Deze techniek helpt bij het bestuderen van structurele eigenschappen voor neurodegeneratief onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies AG027818 en AG030709 van NIH / NIA, 2005/2E uit de Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 van de Alzheimer Association, en 07-65798 uit California Department of Public Health.

1. Peptide voorbereiding <ol><li> Weeg ~ 100 tot 200 ug van gevriesdroogde peptide met behulp van een microbalans en overdracht in gelabelde, silicium-coating, low-adsorbens microcentrifuge buizen. Hier gebruiken we de menselijke sequenties van Aβ40, Aβ42, calcitonine, en GRF. </li><li> Hier maken we gebruik van peptiden die voorbehandeld zijn met 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) tot homogene, aggregaat-vrije bereidingen te verkrijgen. Deze stap is nodig omdat vooraf gevormde aggregaten induceren snelle aggregatie van amyloidogenic eiwitten, die leiden tot een slechte reproduceerbaarheid onder de experimenten 5. Andere methoden zoals filtratie en SEC kunnen ook worden gebruikt voor het verzamelen zonder de voorbereidingen voor PICUP 6 te verkrijgen. </li><li> De behandeling van de peptiden met HFIP, pre-chill de HFIP container op het ijs in een zuurkast het dragen van adequate bescherming (HFIP is vluchtig en giftig). Koelen van een 250 ml fles vereist normaliter 10-15 minuten. Voeg HFIP vooraf gekoelde buisjes met peptide lyofilisaten tot een nominaal peptide concentratie van 0,5 mM te verkrijgen. </li><li> Ultrasone trillingen het peptide oplossingen in een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Vortex en incubeer voorzichtig de buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Chill de buizen op ijs (voor 1 min), en verdeel de oplossingen in 10-50-ul monsters in het label 0.6-ml low-adsorbens buizen. </li><li> Verwijder HFIP door verdamping onder een zachte stikstofstroom, of &#39;s nachts laat de buizen te openen in de zuurkast. Voor &#39;s nachts verdamping, plaats de open buizen in een rek en bedek ze met een groot vel Kimwipes om stof en deeltjes contaminatie te voorkomen. </li><li> Exsiccate de resterende HFIP in vacuüm in een vriesdroger, of een centrifugale compressor voor 30 min, of in een exsiccator bevestigd aan een vacuüm inlaat gedurende 2 uur Het uiteindelijke product zal een peptide film op de bodem van de microcentrifuge buizen worden. Als dit goed wordt exsiccated, kunnen de buizen luchtdicht worden opgeslagen voor langere tijd (maanden) bij -20 of -80 ° C. </li></ol> 2. Oplossen van de HFIP behandeld met peptiden en foto&#39;s cross-linking <ol><li> Voor oplossen van de HFIP behandelde peptiden voor cross-linking reacties, moet men de cross-linking en quenching reagentia te bereiden. </li><li> Weeg ammoniumpersulfaat (APS, de heer 228,2 g / mol) en bereiden een 20 mM oplossing in 10 mM natriumfosfaat, pH 7,4. Meng met behulp van een vortex tot de oplossing helder is. </li><li> Bereid 1 mM oplossing van Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydraat (RuBpy, de heer 748,63 g / mol) in 10 mM natriumfosfaat, pH 7,4. Meng met behulp van een vortex en controleer volledig is opgelost. Bescherm de buis van licht met behulp van aluminiumfolie. </li><li> Voor de SDS-PAGE analyse na de cross-linking, een handige quenching reagens is 5% β-mercapto-ethanol in 2 × SDS-PAGE sample buffer. U kunt ook een M dithiothreitol (DTT, de heer 154,5 g / mol) in gedeïoniseerd water of een geschikte buffer kan worden gebruikt. </li><li> HFIP behandelde peptide films zijn opgelost in verdund NaOH en vervolgens natriumfosfaatbuffer wordt toegevoegd aan ~ 30 uM peptide concentratie te krijgen. Voeg 60 mM NaOH gevolgd door gedeïoniseerd water in de buis met het peptide film zodanig dat NaOH en water 10 en 45% van het uiteindelijke volume, respectievelijk vormen. Schraap het peptide film uit de binnenwanden van microfugebuis het gebruik van de tip, meng door en neer te pipetteren, en ultrasone trillingen gedurende 5 minuten in een waterbad ultrasoonapparaat. </li><li> Voeg 45% 20 mM natriumfosfaat, pH 7,4, meng door pipetteren, en centrifugeer bij 16.000 g gedurende 10 minuten. Gereserveerd fracties van uncross gekoppelde peptiden gemengd met de quenching reagens voor negatieve controles. </li><li> Stel de camera ontspanknop vertraging van 1 s. Bij hogere bestraling Soms kan een uitgebreide radicale reacties kan veroorzaken afbraak van eiwitten. Laad de sluiter van de camera. Bestraling tijd moet mogelijk worden geoptimaliseerd bij gebruik van de methode met een nieuw eiwit. </li><li> Een typische PICUP reactie wordt uitgevoerd in een 20 ul reactie volume. Overdracht 18 ul van de peptide-oplossing in een dunwandige, helder, 0,2 ml PCR-buis. </li><li> Om de peptide-oplossing, voeg 1 pl RuBpy gevolgd door een ui APS en meng de reagentia door pipetteren (de uiteindelijke concentratie van RuBpy en APS in het reactiemengsel wordt 0,05 en 1 mM, respectievelijk). </li><li> Plaats snel de reageerbuis in een 1.8-ml glazen flacon. Plaats de flacon in de balg bevestigd voor de camera body. Bevestig de lens beschermer en druk de ontspanknop, zodat het monster wordt bestraald voor een s in de balg. </li><li> Na het monster bestraling, snel de flacon uit de balg en de PCR-buis uit de flacon. Snel blussen de reactie door het toevoegen van een ui DTT of 10 ul verminderen PAGINA sample buffer. Herhaal de reactie voor elke peptide aliquot deel. </li><li> De reactie mengsels kan nu worden ingevroren bij -20 ° C voor de opslag niet langer dan 7 dagen of op ijs bewaard voor analyse door SDS-PAGE en zilver-kleuring. </li></ol> 3. SDS-PAGE en sliver-kleuringvan cross-linked producten peptide <ol><li> Routine SDS-PAGE en zilver-kleuring worden uitgevoerd om cross-linked peptiden te visualiseren. </li><li> Belasting 5 ul van het reactiemengsel per rijstrook tot ~ 130 pmol van peptide per baan te verkrijgen. </li><li> Onder vergelijkbare hoeveelheden van uncross-linked peptiden voor vergelijking. Eveneens een standaard eiwit ladder voor visuele aanpassing van de moleculair gewicht van peptide bands. </li><li> Voer de gel met behulp van een standaard-gelelektroforese apparaat. We gebruiken de XCell SureLock Mini-Cell systeem van Invitrogen en uitvoeren van zilver-kleuring volgens Invitrogen publicatie IM-1002, Novex Pre-Cast gelelektroforese Guide. </li></ol> Deel 4: representatieve resultaten (figuur 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="Figuur 1" /> Figuur 1: Silver-gekleurde polyacrylamide gels zien uncross-linked (-) en foto-cross-linked (+) GRF, calcitonine, Aβ40 en Aβ42 SDS-PAGE en zilver-kleuring analyses van PICUP gegenereerde Aβ40 oligomeren tonen ongeveer dezelfde band intensiteiten monomeer door tetrameer, gevolgd door een scherpe daling in de overvloed van hogere oligomeren 7. Uncross-linked Aβ40 migreert met een heer in overeenstemming is met dat van monomeer 7. Aβ42 toont een duidelijke oligomeer grootteverdeling. Aβ42 oligomeren omvatten 2-3 groepen 8. De eerste groep, monomere door trimeer, displays afnemende intensiteit met toenemende oligomeer bestelling. In de tweede groep, is een Gaussiaanse-achtige verdeling waargenomen tussen tetrameer en heptamer, met een maximum op pentameer en hexameer. De derde groep, die hier niet wordt weergegeven, bevat oligomeren van de heer ~ 30,000-60,000 Da 8. Deze hogere heer oligomeren meestal worden waargenomen met behulp van SEC-geïsoleerde LMW Aβ42 maar niet peptide bereid door filtratie of HFIP behandeling 6. Uncross-linked Aβ42 produceert voornamelijk twee bands, een monomeer band en een brede trimeer / tetrameer band, dat is een artefact veroorzaakt door SDS 5,9. Calcitonine levert een oligomeer grootte-verdeling die sterk afwijkt van een monotone exponentiële daling in de regio monomer via tetrameer, wat suggereert pre-existentie van dimeren, trimeren en tetrameren 7. De controle polypeptide, GRF, produceert een monotone oligomeer distributie, variërend van dimeer via hexameer zodanig dat de schijnbare relatieve hoeveelheden van oligomeren exponentieel afnemen met toenemende moleculaire massa. In andere experimenten, hogere oligomeren ook zou kunnen worden gevisualiseerd 7. Het exacte aantal en de relatieve intensiteiten van oligomeer bands kunnen enigszins variëren tussen de experimenten afhankelijk van de werkelijke eiwitconcentratie, de hoeveelheid proteïne geladen op de gel, en de tijd gebruikt voor de ontwikkeling stap in de zilver-kleuringsprotocol.

<ol><li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions%3A+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).</li>
<li>Kluger, R., Alagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+protein-protein+interactions%E2%80%94a+review+with+illustrative+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols.</a> Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).</li>
<li>Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+chemistry+and+biology%3A+development+of+multifunctional+photoaffinity+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rec%22%5BJournal%5D)">Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes.</a> Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers%E2%80%94what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+aggregate-free%2C+low+molecular+weight+amyloid-%CE%B2+for+assembly+and+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays.</a> Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+%28A%CE%B2%29+assembly%3A+A%CE%B240+and+A%CE%B242+oligomerize+through+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).</li>
<li>Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+state+characterization+of+amyloid+%CE%B2-derived+diffusible+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+photochemical+cross-linking%E2%80%94a+new+tool+for+studies+of+metastable%2C+amyloidogenic+protein+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies).</a> Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).</li>
<li>Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+crosslinking+of+prion+protein+oligomers+and+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions.</a> Amyloid. 13, 67-77 (2006).</li>
<li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+events+of+%CE%B1-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept.+Lett%22%5BJournal%5D)">The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li>
<li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li>
</ol>

PICUP is oorspronkelijk ontwikkeld om een stabiele eiwitcomplexen 2-studie. De methode werd later toegepast op de kwantitatieve studie van metastabiele amyloïde eiwit assemblages, waaronder Aß 10, prion en ziekte-geassocieerde PrP Sc 11, en ​​α-synucleïne 12. De belangrijkste factoren die moeten worden genomen bij het ontwerpen van een PICUP experiment zijn de reagens stoichiometrie, bestraling tijd, en monstervoorbereiding procedure. De eerste twee punten kan verlangen empirische optimalisatie, t...

<table><tbody><tr><td>Dolan-Jenner 200-W gloeilamp</td><td>Overig</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Model 170-D</td><td>De warmte die door de lamp wordt gegenereerd d&amp;#8211;heeft geen invloed op de monsters bij korte incubatieperioden.</td></tr><tr><td>35-mm SLR-camerabody</td><td>Instrument</td><td>Pentax</td><td>SP500-model</td><td>In onze opstelling is een balg aan de behuizing van de camera bevestigd om een geschikte kamer te creëren voor bestraling van het monster, dat op 10 cm afstand van de lichtbron is geplaatst.</td></tr><tr><td>Heldere PCR-buisjes met dunne wanden</td><td>Overig</td><td>Eppendorf</td><td>951010006 geleverd door Fisher L22-003-24</td><td></td></tr><tr><td>Glazen vials (1,8 ml)</td><td>Overig</td><td>Kimble Chase</td><td>60940A 2, geleverd door Fisher 03-340-60</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>Reagens</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>HFIP</td><td>Reagens</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Gebruik in een zuurkast.</td></tr><tr><td>A&amp;#946;40 en A&amp;#946;42</td><td>Reagens</td><td>Biopolymeerlaboratorium van de UCLA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcitonine</td><td>Reagens</td><td>American Peptide</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2'-bipyridyl)dichlororuthenium(II)hexahydraat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Vortex tot de oplossing helder is. Dek de RuBpy-buis af met aluminiumfolie om het reagens te beschermen tegen omgevingslicht. RuBpy wordt elke keer vers bereid en moet binnen 48 uur worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Vortex tot de oplossing helder is. APS wordt elke keer vers bereid en moet binnen 48 uur worden gebruikt. </td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 ML</td><td>Kan worden gebruikt wanneer SDS-PAGE-analyse wordt uitgevoerd.</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS-monsterbuffer (2x)</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;i&gt;SureLock&lt;/i&gt; Mini-cel</td><td>Instrument</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine-gels (10-20%)</td><td>Overig</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS-runbuffer (10x)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Silver Express Kleuringskit</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

photo-geïnduceerde verknoping van ongeschikte eiwitten (picup) toegepast op amyloidogenic peptiden

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

De assemblage van amyloidogenic eiwitten in toxische oligomeren is een rudimentaire gebeurtenis in de pathogenese van eiwit misfolding ziekten, waaronder Alzheimer, Parkinson en Huntington ziekten, erfelijke amyotrofe laterale sclerose, en type 2 diabetes. Vanwege de metastabiele aard van deze verzamelingen van eiwitten, is het moeilijk om hun oligomeer grootte-verdeling kwantitatief te beoordelen met behulp van klassieke methoden, zoals elektroforese, chromatografie, fluorescentie, of dynamische lichtverstrooiing. Oligomeren van amyloidogenic eiwitten bestaan ​​als metastabiele mengsels, waarin de oligomeren dissociëren in monomeren en tegelijkertijd associate in grotere assemblages. PICUP stabiliseert oligomeer populaties door covalente cross-linking en in combinatie met fractionering methoden, zoals natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) of size-exclusion chromatografie (SEC), PICUP biedt snapshots van het oligomeer grootte distributies die bestond voordat kruis -linking. Vandaar dat PICUP maakt visualisatie en kwantitatieve analyse van metastabiele eiwit bevolking en kan gebruikt worden om de montage en ontcijferen relaties tussen volgorde wijzigingen en oligomerisatie te controleren<sup&gt; 1</sup&gt;. Mechanistisch, PICUP gaat om foto-oxidatie van Ru<sup&gt; 2 +</sup&gt; In een tris (bipyridyl) Ru (II) complex (RuBpy) naar Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Door bestraling met zichtbaar licht in de aanwezigheid van een elektron acceptor. Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Is een sterke een-elektron oxidator in staat is te abstraheren een elektron uit een naburige eiwitmolecuul, het genereren van een eiwit radicale<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Radicalen zijn onstabiele, zeer reactieve stoffen en dus snel verdwijnen door een verscheidenheid aan intra-en intermoleculaire reacties. Een radicaal kan gebruik maken van de hoge energie van een ongepaard elektron om te reageren met een ander eiwit monomeer de vorming van een dimeer radicaal, die vervolgens verliest een waterstofatoom en vormt een stabiele, covalent gekoppelde dimeer. De dimeer kan dan verder reageren via een vergelijkbaar mechanisme met monomeren of andere dimeren naar een hogere orde oligomeren vormen. Voordelen van PICUP in vergelijking met andere foto-of chemische verknoping methoden<sup&gt; 3,4</sup&gt; Zijn korte (≤ 1 s) blootstelling aan niet-destructieve zichtbaar licht, geen behoefte aan<i&gt; Pre facto</i&gt; Aanpassing van de natieve sequentie, en de lengte nul covalente cross-linking. Daarnaast PICUP maakt cross-linking van eiwitten binnen de brede pH en temperatuur bereiken, inclusief fysiologische parameters. Hier tonen we de toepassing van PICUP tot verknoping van drie eiwitten amyloidogenic de 40 - en 42-residu amyloid β-eiwit varianten (Aβ40 en Aβ42) en calcitonine, en een controle eiwit, de groei-hormoon releasing factor (GRF).

Photo-geïnduceerde verknoping van niet-gemodificeerde eiwitten (PICUP) maakt karakterisering van oligomeer grootte van de distributie in metastabiele eiwitmengsels. Tonen we de toepassing van PICUP aan drie representatieve amyloidogenic peptiden van de 40 - en 42-residu vormen van amyloid β-eiwit, en calcitonine, en een controle peptide groei-hormoon releasing factor.

Photo-geïnduceerde verknoping van ongeschikte Eiwitten (PICUP) Toegepast op Amyloidogenic Peptiden

De assemblage van amyloïdogene eiwitten tot toxische oligomeren is een cruciale gebeurtenis in de pathogenese van eiwitmisvouwingsziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, ...

Men gelooft dat oplosbare oligomeren van amyloïdogene eiwitten, vanwege hun cytotoxische eigenschappen, ten grondslag liggen aan de pathofysiologie van neurodegeneratieve ziekten. Deze oligomeren vormen zich en dissociëren continu wanneer ze in oplossing zijn. Dit is een feit dat de structurele studies bemoeilijkt die cruciaal zijn voor de ontwikkeling van inhiberende moleculen om dit probleem te omzeilen.Er wordt gebruikgemaakt van foto-geïnduceerde cross-linking van ongemodificeerde eiwitten of opname. Deze methode houdt in dat gedisaggregeerde en gesolubiliseerde, amyloïde-genische peptiden worden blootgesteld aan cross-linking-reagentia en een pulse van één seconde intens licht om dimeren en oligomeren covalent te koppelen. De grootteverdeling van de oligomeren kan vervolgens worden geanalyseerd via standaard biochemische technieken.Hallo, ik ben Far Rahimi van het Batan Laboratory van de afdeling Neurologie aan de University of California in Los Angeles. Ik ben Al Mai van het Bean Laboratory. Vandaag laten we u een procedure zien voor foto-geïnduceerde crosslinking van ongemodificeerde eiwitten.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om gestabiliseerde amyloïde beta-proteïne-oligomeren te genereren en de structurele modificaties in de oligomerenverdeling te bestuderen. Deze procedure werd oorspronkelijk gepubliceerd door Fancy en Coate om stabiele proteïnecomplexen te bestuderen. De methode werd later toegepast door Battan en anderen voor de kwantitatieve studie van metastabiele amyloïde proteïne-assemblages, waaronder amyloïde beta en alfa-synucleïne.Laten we beginnen. Om het protocol te starten, wordt hexafluorisopropanol of HFIP, dat vooraf op ijs is gekoeld, toegevoegd aan een met siliconen gecoate buis met lage adsorptie die 1 tot 200 µg geliofiliseerd peptide bevat, zodat de uiteindelijke concentratie ongeveer 0,5 is.Millimolaire HFIP voorkomt dat amyloïde-genische peptiden aggregeren en zal de consistentie van de resultaten verbeteren. Soniceer nu de peptidebuis gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Wanneer de sonicatie is voltooid, worden de buisjes voorzichtig gevortext en 30 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Na 30 minuten worden de peptiden één minuut op ijs gekoeld. De gekoelde peptiden kunnen nu worden verdeeld in aliquoten van 10 tot 50 µL in low-absorbent tubes van 0,6 mil.Plaats de buisjes vervolgens met de doppen eraf in de zuurkast. Om het HFIP gedurende de nacht te laten verdampen, wikkel je het rek met buisjes in Kimwipes om te voorkomen dat er stof in de buisjes terechtkomt. Zodra het grootste deel van het HFIP is verdampt, moeten eventuele sporen van HFIP worden verwijderd door de buisjes gedurende twee uur onder vacuüm in een ex-siccaat te plaatsen.Het eindproduct is een dunne laag peptidefilm in de buisjes. Deze buisjes kunnen maandenlang worden bewaard bij minus 20 of minus 80 graden Celsius. Om te beginnen met de solubilisatie- en fotocrosslinkingstappen, wordt de peptidefilm eerst opgelost in een oplossing van verdund natriumhydroxide.Nadat het natriumhydroxide, gedeïoniseerd water en vervolgens fosfaatbuffer zijn toegevoegd, moet de uiteindelijke oplossing bestaan uit 45% fosfaatbuffer, 45% water en 10% natriumhydroxide-oplossing. Als er een residu van eiwitfilm aan de wand van de buis achterblijft, schraap deze dan in de oplossing. Met behulp van een pipetpunt en door op en neer te pipetteren, moeten de gesuspendeerde peptiden nu worden gesoniceerd in een Sonica waterbad; soniceer gedurende één tot twee minuten.Voeg na sonicatie de fosfaatoplossing toe en meng deze door herhaaldelijk te pipetteren. Centrifugeer de buis vervolgens 10 minuten bij 16, 000 G. Terwijl de centrifuge draait, bereidt u de camera voor op de stappen voor fotocrosslinking.De vertraging van de camerashutter moet worden ingesteld op één seconde en de shutter moet worden geladen. Zodra de buizen klaar zijn met centrifugeren, maakt u aliquots van 18 µL van de peptideoplossing in transparante 0,2 ml PCR-buisjes. Deze aliquots zullen worden gebruikt voor de fotocrosslinking.Zorg ervoor dat u een hoeveelheid peptide-oplossing apart zet om vlak voor het crosslinken als negatieve controle te gebruiken. Voeg één µL ammoniumpersulfaat en één µL ruthenium toe. Plaats de buis nu snel in een glazen vial van 1,8 M en plaats de vial in de balg aan de voorzijde van de camerabehuizing.Sluit de camera af met de lensbeschermer en druk op de ontspanknop. Het monster wordt nu gedurende één seconde bestraald. Bij langere bestralingstijden veroorzaken uitgebreide radicaalreacties proteïnedegradatie.Haal de 0,2 mil PCR-buis na bestraling snel terug en voeg 10 µL toe van de vooraf bereide page-monsterbuffer die Beta-mercaptoethanol bevat. De gecrosslinkte peptiden kunnen tot zeven dagen worden bewaard bij -20 °C. Voorafgaand aan SDS-page, fractionering en zilverkleuring.Om de crosslinked peptiden te onderzoeken, kunnen routine SDS-PAGE en zilverkleuring worden gebruikt. Bij het schatten van de volumes zou het laden van 5 µL van het reactiemengsel ongeveer 130 pmol peptide moeten opleveren. Het wordt aanbevolen om het Xcel Sherlock mini cell-systeem van Invitrogen te gebruiken voor gelelektroforese en voor het uitvoeren van de zilverkleuring. Volgens Invitrogen-publicatie IM 1 0 0 2, de NOx precast gel electrophoresis guide, vertoont bij analyse van de SDS-PAGE-gel na zilverkleuring het niet-crosslinked controlepolypeptide, GRF, hoofdzakelijk migratie als een monomeer.Gecrosslinkt GRF produceert een continue all liga-distributie variërend van dimeer tot hexameer, zodanig dat de schijnbare relatieve bandintensiteit van oligomeren exponentieel afneemt bij een toenemende molecuulmassa. Niet-gecrosslinkte calcitonine migreert voornamelijk als monomeer en gedeeltelijk als dimeer. Gecrosslinkte calcitonine levert een a liga-grootteverdeling op die in dat gebied sterk afwijkt van een monotone exponentiële afname.Monomeren tot tetrameren suggereren het voorafgaande bestaan van niet-gecrosslinkte dimeren, trimeren en tetrameren. A beta 40 loopt alleen als een monomeer, terwijl pickup een Beta 40 genereerde. Alle ligamenten vertonen ongeveer vergelijkbare bandintensiteiten van monomeer tot tetrameer, gevolgd door een afname in de abundantie van hogere all ligamenten.Niet cross-linked. A beta 42 produceert voornamelijk twee banden, een monomeerband en een trimeer-tetrameerband. De trimeer-tetrameerband is een artefact veroorzaakt door SDS cross-linking.Een Beta 42 vertoont een duidelijke oligomeergrootteverdeling die uit twee groepen bestaat. De eerste groep, van monomeer tot trimeer, vertoont een afnemende intensiteit bij een toenemende oligomeerorde. In de tweede groep wordt een klokvormige verdeling waargenomen tussen tetrameer en heptameer, met een maximum bij pentameer en hexameer.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe het eiwit kan worden gecrosslinkt met behulp van pika via deze procedure. Het is belangrijk om te onthouden dat wanneer we amyloidogene eiwitten gebruiken, we ervoor moeten zorgen dat de preparaten aggregaatvrij zijn om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De hier getoonde condities en experimenten kunnen experimenteel worden aangepast aan de hand van de relevante lysaten. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met het gebruik van het opname-experiment.

photo-induced-cross-linking-unmodified-proteins-picup-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Aptameren zijn korte ribo-/deoxyribo-oligonucleotides geselecteerd...

Selectie van Aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer

Eiwitten kunnen ofwel een natuurlijke structuur aannemen ofwel verkeerd vouwen in onoplosbare amyloyde. Omstandigheden die de verkeerd vouwende route bevorderen, leiden tot de vorming van verschillende soorten amyloyde fibrillen. De hier beschreven methoden maken een snelle omzetting van natuurlijke eiwitten in amyloyde in vitro mogelijk.

Snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten in vitro

Hoewel het transport van celoppervlak-eiwitten relatief gemakkelijk bestudeerd visualiseren van de handel in intracellulaire eiwitten is veel moeilijker. Hier gebruiken we constructen waarin activeerbare GFP en tonen een werkwijze om nauwkeurig volgen amyloïd precursor eiwit van het Golgi apparaat naar stroomafwaartse compartimenten en volg de klaring.

Beeldvorming van de intracellulaire mensenhandel van APP met fotoactiveerbare GFP

De amyloid-β (Aß) -injected diermodel kan de toediening van een bepaalde hoeveelheid en de soort van Ap-fragmenten en vermindert de individuele verschillen binnen elke studiegroep. Dit protocol beschrijft de intracerebroventriculaire (ICV) injectie van Ap zonder stereotactische instrumenten, waardoor de productie van Alzheimer-achtige gedragsafwijkingen bij normale muizen.

Intracerebroventriculaire Injectie van amyloid-β peptiden in normale muizen om acuut induceren Alzheimer-achtige cognitieve tekorten

Hierin beschrijven we een speciaal HPLC zuiveringsprotocol hoogzuivere amyloïde beta 42 (Aß42) en amyloïde beta 40 (Aβ40) peptiden, kunnen oligomeervorming oplevert. Amyloid beta is een zeer gevoelig aggregatie, hydrofoob peptide betrokken bij de ziekte van Alzheimer. De amyloidogenic aard van het peptide maakt de zuivering ervan een uitdaging.

Een op maat HPLC Zuivering Protocol dat zijn vruchten High-zuiverheid Amyloïd Beta 42 en Amyloid Beta 40 Peptiden, in staat oligomeervorming

Amyloïde afzetting is een kenmerk van verschillende ziekten en treft vele verschillende organen. Deze paper beschrijft de toepassing van de fluorescentie van de verlichte geconjugeerd oligothiophene in combinatie met fluorescentie microscopie technieken kleuring. Deze kleuringstechniek vertegenwoordigt een krachtige tool voor de detectie en verkenning van eiwit-aggregaten in zowel klinische en wetenschappelijke opstellingen.

Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Aβ oligomeren van een synthetische peptide in vitro en relatieve hoeveelheid Aβ oligomeren evalueren door een stip bevlekken analyse.

A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse

Een protocol voor de synthese van een 1,2-dithiolane gemodificeerde peptide en de karakterisatie van de supramoleculaire structuren die voortvloeien uit de peptide zelf-assemblage.

Synthese en karakterisering van 1,2-Dithiolane gemodificeerde zelfassemblerende Peptides

Dit artikel beschrijft hoe polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie kan worden toegepast om de lokale organisatie binnen labelvrije amyloïde superstructuren-sferulieten te karakteriseren. Het beschrijft ook hoe het monster moet worden voorbereid en gemeten, de vereiste opstelling moet worden samengesteld en de gegevens moeten worden geanalyseerd om informatie te verkrijgen over de lokale organisatie van amyloïde fibrillen.

Polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie voor een labelvrije structurele karakterisering van amyloïden

Hier presenteren we een systematische methode die de quasi-omkeerbare zelfassemblage van de amyloïde bèta 1-40 (Aβ 1-40)-gecoate 20 nm goudaggregaten beschrijft. Het nano-grootte-afhankelijke quasi-omkeerbare netwerk tussen peptiden was gecorreleerd met specifieke aminozuren of secties van het Aβ 1-40-monomeer.

Karakterisering van pH-afhankelijke omkeerbare zelfassemblage van amyloïde bèta-1-40-gecoate goudcolloïden

Leer de PICUP-methode om oligomeergrootteverdeling van amyloïdogene peptiden te analyseren met lichtgeïnduceerde crosslinking. Deze techniek helpt bij het bestuderen van structurele eigenschappen voor neurodegeneratief onderzoek.

Photo-geïnduceerde verknoping van ongeschikte Eiwitten (PICUP) Toegepast op Amyloidogenic Peptiden

Meer video's verkennen